La malaltia de Parkinson és una de les malalties neurodegeneratives humanes més freqüents, especialment en pacients d'edat avançada amb una simptomatologia provocada especialment per la manca de DA. La gènesi d'aquesta malaltia no és clara, si bé sembla haver un component genètic en un nombre reduït dels casos diagnosticats, la principal causa roman encara desconeguda. La hipòtesi neurotòxica està present des de fa molt temps i el que sembla més lògic és pensar en l'existència d'una condició mixta, es a dir, una predisposició genètica (congènita, heretada o adquirida) i un detonant que podria ser endogen o exogen. Diverses evidencies suggereixen un paper important de la dopamina en el dany neuronal observat durant la malaltia, per aquest motiu, mitjançant diversos experiments, el nostre laboratori ha determinat els efectes de diferents concentracions de dopamina (DA) sobre la viabilitat de les cèl·lules SH-SY5Y. El primer que s'ha fet es comprovar que la DA s'acumula dins la cèl·lula i aproximadament a quines concentracions ho fa. La DA entra ràpidament dins la cèl·lula, on arribarà a unes concentracions inferiors però properes a les utilitzades extracel·lularment.El primer pas dins de la toxicitat produïda per la DA sembla clarament implicar la seva oxidació intracel·lular. Totes les alteracions produïdes per la DA s'han bloquejat amb antioxidants d'acció intracel·lular com la N-acetilcisteïna. Així doncs, per garantitzar que la DA no sigui tòxica, cal que no s'oxidi. És difícil precisar si la toxicitat de la DA pot estar vinculada al seu procés d'oxidació o als metabòlits reactius que es produeixen. En el primer cas la DA, a l'oxidar-se, està donant lloc a peròxid d'hidrogen i, per tant, a un potencial estrès oxidatiu. En les nostres cèl·lules, l'augment de peroxidació per efecte de la DA és relativament suau, a menys que s'incorpori Fe3+ en el medi com a catalitzador d'aquest procés. En el segon cas s'ha de considerar que la DA està donant lloc a quinones i a aminocroms. Les primeres són prou reactives com per unir-se a grups tiol de forma covalent i per tant, potencialment, poder modificar qualsevol proteïna. Venim a suggerir i en part a demostrar que la DA, oxidant-se a dopaquinona i dopaminocrom, pot reduir-se novament en presència de NADH o NADPH i donar lloc a un cicle redox en el que es pot disminuir considerablement el contingut de la forma reduïda d'aquests coenzims, essencials pel bon funcionament cel·lular. A part d'aquesta alteració redox, s'han observat altres alteracions com a conseqüència de l'oxidació de la DA. Una de les més primerenques és l'acumulació de proteïnes ubiqüitinitzades. Com a conseqüència d'aquest fet i d'altres mecanismes s'activarien una sèrie de vies que modificarien l'expressió de tota una gama de gens implicats en la transducció de senyals i en mort o supervivència cel·lular com GADD153 i C/EBP-beta així com de l'alfa-sinucleïna. L'acumulació d'alfa-sinucleina, conjuntament amb la de les proteïnes alterades per les quinones i les proteïnes ubiqüitinitzades no degradades pel proteosoma pot afavorir la formació d'agregats de nucleació, amb característiques d'agressoma, que donen lloc a la formació al seu voltant de vacuoles autofàgiques i a l'activació d'un senyal d'estrès reticular. La DA desencadena doncs clarament i de forma dosi-dependent un procés d'autofàgia en el citoplasma cel·lular. Pensem que la finalitat de l'autofàgia és un cop més la de salvar la cèl·lula, però si l'agressió no s'atura la cèl·lula s'acaba morint per acció de la mateixa autofàgia, o bé mitjançant un procés apoptòtic en alguns casos o simple necrosi en d'altres. BNIP3 és una proteïna la expressió de la qual també incrementa després del tractament amb DA. BNIP3 ja s'ha descrit anteriorment com factor que s'indueix quan hi ha autofàgia. Un dels factors que la regulen és HIF-1-alfa, factor que s'indueix ràpidament en situacions d'hipòxia o d'estrès oxidatiu i com hem vist després del tractament amb DA. Per tant, la cèl·lula es comporta de forma semi-anaeròbica, de manera que la relació lactat/piruvat augmenta, i com a conseqüència d'aquest fet, els nivells d'AMP han d'estar augmentats, podent-se activar l'AMPK. Aquest procediment per si sol pot explicar l'aturada de la ruta de mTOR observada per part de la DA, sense descartar algun efecte més directe sobre TSC1/TSC2 o Rheb. / "Mechanisms of cell damage triggered by dopamine in SH-SY5Y cells."TEXT:Dopamine (DA) could play a central role in neuronal dopaminergic degeneration in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders. The mechanisms leading to neuronal damage and death are not yet fully understood.We have used human neuroblastoma SH-SY5Y cells that are sensitive to dopamine, with the aim to further understand the molecular mechanisms through which dopamine may damage the cell. DA enters the cell in a dose-dependent and saturating way. DA triggers a redox cycle that causes a slight increase in peroxidation (DCFH) and a decrease in the reductive power of the cell that could be assessed by MTT, NADH concentration and GSH/GSSG relationships. Such an effect is reflected in a decrease in cell viability, a decrease in oxygen consumption and an increase in cytosolic calcium concentration. The transcription factors C/EBPß and GADD153/CHOP increase their expression. Parameters of endoplasmic reticulum stress (grp78) are activated and a consistent autophagy is observed using electronic microscopy.Autophagy is a process characterized by the presence of double or multiple-membrane cytoplasmic vesicles sequestering cytoplasm and organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum.The genes related with autophagy and their products are currently known as ATG. The microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) (the mammalian orthologue of yeast ATG8) is a useful procedure for autophagy detection. We show that dopamine increases LC3 expression and its proteolysis product LC3-II which is localized in autophagosamal membranes.The PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in autophagy induced by starvation. The activation of S6K (a downstream substrate of mTOR) decreases after incubation with dopamine. This is indicative of a mTOR inhibition by dopamine. 3-Methyladenine blockes autophagy but not the LC3 increase. Beclin 1 (ATG6) is also involved in this process.Moreover, a multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) showed an increase in BNIP3, NOXA and PUMA expression after DA treatment. BNIP3 and p53 expression were confirmed by WB. BNIP3 is a member of the BH3-only family, which are factors involved in apoptosis and autophagy. Since BNIP3 is induced under hypoxic conditions we studied and found an increase of hypoxia inducible factor (HIF 1alpha) expression, suggesting a hypoxic-like condition caused by dopamine.

Per a modelar alguns aspectes bioquímics i anatomopatològics de la malaltia de Parkinson en la rata, en aquesta tesi hem començant utilitzant la neurotoxina MPP+, de relativament recent aparició i la més veterana 6-OHDA i hem acabat emprant el propi neurotransmissor de les neurones que degeneren, la dopamina, intentant esbrinar els seus mecanismes de lesió. L’estudi s’ha iniciat en el animal in vivo, ha continuat en talls gruixuts de teixit ex vivo i ha acabat en mitocondris in vitro. Hem volgut reproduir resultats d’altres grups però amb abordat¬ges experimentals més senzills i econòmics, al nostre abast. Hem volgut aplicar el nostre model animal per a estudis comparatius amb la malaltia humana Per a la introducció he partit d’uns 50 articles de revisió actualitzats, amb la voluntat d’adquirir una visió panoràmica de la malaltia de Parkinson: les hipòtesis etiopatogèniques, les manifestacions clíniques, els trets anatomopatològics i bioquímics, així com dels models animals que s’utilitzen per a reproduir-la. En aquests articles he trobat les referències biblogràfiques per aprofundir en els aspectes més directament relacionats amb els experiments realitzats. Per als resultats, que s’han de contemplar dins el marc de la participació en projectes dels nostre grup i d’altres que utilitzaven aquests models animals d’experimentació, hem triat aquells en els que he participat directament, treballs que en alguns casos han estat els preliminars per altres treballs de doctorat del grup. Pràcticament tots els resultats que presentem han estat publicats, com article, en revistes internacionals, aquí queden recollits en l’apartat d’annexes, raó per la qual en la introducció general no consten alguns conceptes introductoris que apareixen en cadascun d’ells.

L'objectiu general d'aquest treball és el d'aprofundir en l'estudi de les sinucleïnopaties, principalment a nivell bioquímic, en les interaccions de l'alfa-sinucleïna amb altres proteïnes del cervell humà per tal d'estudiar l'efecte de la unió en aquestes patologies. També hem volgut comprovar la similitud de les sinucleïnopaties humanes amb un model animal transgènic per a la forma humana mutada de l'alfa-sinucleïna. D'altra banda i també relacionat amb aquestes neurodegenarions, s'ha estudiat de quina manera resultaven afectats diferents marcadors de l'estrès oxidatiu, que se sap juga un important paper en el desenvolupament d'aquestes patologies. Mitjançant estudis d'immunoprecipitació i de pull-down en cervell humà s'ha trobat interacció de l'alfa-sinucleïna amb les proteïnes sinàptiques rab3a i rabfilina a córtex de la sinucleïnopatia anomenada Demència amb cossos de Lewy (DLBD), i no en cervells control. Donada la interacció anòmala amb aquestes proteïnes sinàptiques podem afirmar que a DLBDs la transmissió sinàptica es troba alterada, i una de les causes és la interacció anòmala de l'alfa-sinucleïna amb rab3a i rabfilina. Aquest tipus d'interacció també s'ha estudiat a l'MSA o Atròfia Sistèmica Múltiple, una sinucleïnopatia que té afectat sobretot el cerebel, i no el córtex, com les DLBDs. Doncs, tot i estar classificada com a sinucleïnopatia a part, hem observat la mateixa interacció anòmala tan a cerebel com escorça de pacients d'MSA, suggerint-se un mecanisme comú de neurodegeneració per a totes les sinucleïnopaties. Paral.lelament també hem estudiat la via de transducció glutamatèrgica a pacients amb DLBDs, i s'ha trobat que en condicions normals exiteix interacció de l'alfa-sinucleïna amb un efector del receptors metabotròpics del glutmat tipus I, com és la PLC-beta-1. Al mateix temps, i a través d'estudis de solubilitat, s'han observat canvis en la solubilitat de PLC-beta-1 en aquestes patologies, tal com succeeix amb l'alfa-sinucleïna.Quan s'han estudiat marcadors d'estrès oxidatiu per una forma primerenca de la malaltia de Parkinson s'han trobat alterats a córtex d'aquest pacients, quan la patología, en els primers estadis només es detecta fins ara a substància negra. Per tant, l'estrès oxidatiu a córtex d'una forma pre-clínica de la malaltia de Parkinson, ja té un paper en el desenvolupament d'estadis posterior de la malaltia, com podrien ser les DLBDs. / The aim of this work is to study alpha-synuclein interactions in human brain to deep on the knowledge of a group of neurodegenerative diseases called synucleinopathies in which alpha-synuclein accumulates in the form of Lewy bodies. In human cortex we found alpha-synuclein interactions with the synaptic proteins rab3a and rabphilin in Dementia with Lewy Bodies (DLBDs) patients, and not in control brains. This interaction is corroborated in transgenic mice expressing human A30P human mutated alpha-synuclein. When a different synucleipathy , like Multiple Systemic Atrophy (MSA), is studied we found the same anomalous interaction even different areas were affected, cerebellum vs cortex in the case of MSA and DLBDs, indicating a common neurodegenerative mechanism for the synucleinopathies group. Also in DLBDs we studied the glutamatergic signal transduction pathway immunoprecipitating alpha-synuclein from brain cortex and we found that PLC-beta-1, an effector of the metabotropic glutamate receptors (mGLuR1) binds to alpha-synuclein only in control conditions and not in DLBDs. At the same time PLC-beta-1 showed changes in solubility like alpha-synuclein in DLBDs. So, the results presented here indicate a kind of relation between alpha-synuclein and PLC-beta-1 in DLBDs which damage can affect the mGLuR1 transduction pathway which is altered in cortex from DLBDs.The other factor studied in this work is the oxidative stress effect in brain cortex from early stages Parkinson's disease (PD) patients. We found an increase of the oxidative stress markers used in this work indicating that oxidative stress in cortex from PD patients starts at early stages in human cortex, even though in early stages only the substantia nigra seems to be affected. This markers of oxidative stress were also studied in Alzheimer's disease (AD) obtaining similar results. Finally another point of this work is the study of the Amyloid Precursor Protein (A-beta-PP) mRNA isoforms in human cortex from DLBDs. We found a relative increase of the isoforms contained the Kunitz Protease Inhibitor, implicating A-beta-PP the isoforms processing in the developing of DLBDs

DE LA TESIS:Una de las consecuencias de los avances científicos y tecnológicos del ultimo siglo es el aumento de esperanza de vida en las sociedades modernas lo que, en términos demográficos, se traduce en un incremento en la media de edad de la población. Sin embargo, este envejecimiento progresivo comporta una mayor incidencia en la sociedad de enfermedades que se manifiestan a edades avanzadas, destacando las que afectan al sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer o la de Parkinson. El dramático incremento en la incidencia de este tipo de enfermedades se ha traducido en una sensibilización social frente a ellas, así como en un creciente interés en el estudio de los procesos neurodegenerativos asociados a la edad y en su posible tratamiento.La etiología de la muerte neuronal en los procesos de neurodegeneración continúa siendo un enigma por descifrar pero cada vez se sabe más acerca de las causas y trastornos que la envuelven. Un factor que parece estar implicado directamente en estos procesos es el glutamato, el neurotransmisor excitador mayoritario del sistema nervioso central. La paradoja de ésta molécula estriba en que a pesar de estar implicada en procesos fisiológicos normales como el aprendizaje, la memoria o la construcción de conexiones sinápticas durante el desarrollo, también puede ser tóxica para las neuronas. El glutamato juega un papel central en muchos procesos neurodegenerativos y está implicado en patologías tan diversas como la corea de Huntington, la epilepsia, el daño cerebral isquémico o la enfermedad de Alzheimer. El modo mediante el que el glutamato ejerce su función tóxica consiste en la sobreactivación de sus receptores sinápticos, provocando una serie de fenómenos patológicos que llevan a la muerte de la neurona y que son conocidos con el nombre de excitotoxicidad. El mecanismo por el que todo esto sucede es todavía objeto de estudio.Dentro de este marco, los objetivosprincipales sobre los que se fundamenta el trabajo aquí expuesto eran:- Caracterizar en términos histológicos, bioquímicos y funcionales la lesión excitotóxica de la rata creada en la vía septohipocampal por la microinyección en el septo medio de un agonista de los receptores del glutamato (el ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol-4-propiónico, o AMPA) y comparar los efectos provocados en función de la dosis administrada con los que aparecen en función del tiempo postlesión transcurrido.- Bajo las condiciones de neurodegeneración seleccionadas, estudiar in vivo las respuestas adaptativas de los sistemas de activación e inhibición hipocampales controlados por los núcleos de la región septal para así establecer la relevancia de cada sistema en este modelo animal.- De forma paralela y en otro modelo animal de aprendizaje y memoria en el que previamente se habían caracterizado variaciones de los receptores hipocampales del glutamato, nos propusimos estudiar el origen celular del aumento de receptores AMPA asociados al deterioro cognoscitivo provocado por el envejecimiento.- Investigar la posible relación entre la vulnerabilidad humana a la hipoxiaisquemia durante el periodo perinatal, la calcificación cerebral en el mismo periodo y su evolución, con el fin de establecer posibles paralelismos con la lesión excitotóxica inducida en nuestro modelo en diferentes condiciones de dosis y tiempo.- Analizar los mecanismos moleculares que puedan estar interrelacionados para dar lugar tanto a la formación de precipitados intracelulares de calcio como a la progresividad del proceso neurodegenerativo.

Las mutaciones en el gen LRRK2, en especial la G2019S, parecen ser una causa relativamente frecuente de enfermedad de Parkinson (EP).Mutaciones en este gen se detectan en el 5-6% de los casos con EP familiar y en el 1-2 % de los casos esporádicos de diferentes poblaciones occidentales. La mutación R1441G del gen LRRK2 también es una causa frecuente de parkinsonismo en el País Vasco. Las hipótesis del presente trabajo son: 1) En Cataluña las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 son causa de parkinsonismo tanto familiar como esporádico, 2) Las manifestaciones clínicas motoras y no motoras del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 son heterogéneas, y 3) El sustrato neuropatológico del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 es heterogéneo y determina el fenotipo clínico. En relación a estas hipótesis, los objetivos son: 1) Determinar la frecuencia de las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 en pacientes con diagnóstico clínico de EP en un hospital terciario de Barcelona, 2) Definir el fenotipo clínico de los pacientes con EP portadores de una mutación en el gen LRRK2, y 3) Determinar la presencia de las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 en cerebros diagnosticados de EP, de parkinsonimo degenerativo, o de degeneración lobar frontotemporal, y estudiar las características clínicas y patológicas de los casos portadores de una mutación en este gen. Los resultados y conclusiones son: 1) La frecuencia de mutaciones en el gen LRRK2 en pacientes con EP que atienden a una consulta especializada en un hospital terciario de Barcelona es del 5,3%, siendo la mutación G2019S la más frecuente (el 4,3% de los pacientes son portadores). La mutación R1441G es más infrecuente (0,7%). 2) Las mutaciones en el gen LRRK2 son más frecuentes en casos familiares de EP (un 9,6% de los casos son portadores) que en casos esporádicos (un 3,4% son portadores). Hasta en un 43,7% de los pacientes con mutaciones en el gen LRRK2 no existen antecedentes familiares de parkinsonismo. 3) Las características clínicas de los síntomas motores y no motores del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 es indistinguible de los observados en la EP clásica. 4) Las alteraciones neuropatológicas del parkinsonismo asociado a la mutación G2019S del gen LRRK2 son heterogéneas. Si bien el sustrato neuropatológico más frecuente es la patología tipo Lewy, describimos un caso que confirma que uno de los fenotipos neuropatológicos asociados a la mutación G2019S es la degeneración nigral inespecífica sin inclusiones distintivas. 5) No hemos detectado mutaciones en el gen LRRK2 en cerebros asociados a otro tipo de enfermedad neurodegenerativa diferente a la EP, como la demencia por cuerpos de Lewy, la parálisis supranuclear progresiva o la atrofia multisistémica. Su existencia habría que considerarla probablemente excepcional o coincidental. / LRRK2 G2019S mutation is a frequent cause of Parkinson’s disease (PD). This mutation is present in 5-6% of familial PD cases and 1-2 % of sporadic PD patients. LRRK2 R1441G is frequent in PD patients from the Basque country. We hypothesize that 1) In Catalonia, the G2019S and R1441G mutations are frequent in patients with familial as well as sporadic parkinsonism. 2) Clinical features in LRRK2-related parkinsonism are heterogeneous 3) The neuropathological substrate of LRRK2-related parkinsonism is pleomorphic and determines the clinical phenotype. We aim to assess 1) The frequency of the G2019S and R1441G mutations in patients with a clinical diagnosis of PD in Barcelona 2) The clinical phenotype of PD patients carrying a LRRK2 mutation, and 3) The presence of LRRK2 G2019S and R1441G mutations in brains diagnosed of PD, other neurodegenerative parkinsonism, as well as frontotemporal lobar degeneration, and assess the clinical and neuropathological features of those cases carrying a LRRK2 mutation. Results and conclusions: 1) LRRK2 mutations are frequent in PD patients from Barcelona (5.3% of them). The G2019S mutation is more frequent (4.3%) than the R1441G mutation (0.7%). 2) LRRK2 mutations are more frequent in familial PD cases (9.6% of them) than in sporadic cases (3.4%). Family history of parkinsonism is absent in up to 43.7% of patients with LRRK2 mutations. 3) Clinical features of motor and non-motor symptoms of LRRK2-related parkinsonism is indistinguishable from those of classical PD. 4) The neuropathological phenotype of LRRK2 G2019S-related parkinsonism is heterogeneous. Although the most frequent neuropathological substrate is Lewy boby type pathology, we describe a patient with non-specific nigral degeneration and the G2019S mutation. 5) We have not been able to identify LRRK2 mutations in brains of a neurodegenerative disease other than PD (e.g Lewy bodies dementia, Progressive supranuclear palsy or Multiple system atrophy). Presence of LRRK2 mutations in these neurodegenerative diseases would be exceptional or coincidental.

Parkinson’s disease (PD) is currently the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease (AD), affecting 100.000 people in Spain and more than 4 million people worldwide. Being a movement disorder, impairment of motor functions is considered to be the hallmark symptom of PD. However, cognitive dysfunction is now recognized as a common feature, being present since early disease stages and affecting the majority of patients as the disease progresses. In line with this, one of the most common cognitive deficits found in PD patients are verbal semantic and phonemic fluency deficits. Although there are still no established biomarkers for PD, neuroimaging methods offer the possibility of mapping the neurobiological substrates of motor and cognitive impairment in these patients. Amongst the available neuroimaging techniques, structural and functional magnetic resonance imaging (MRI, fMRI) produces images of the brain that provide quantitative values of cerebral atrophy and brain dysfunction, respectively. These techniques are relevant because they shed light into neurodegeneration processes occurring in PD compared to normal aging as well as those pathological processes that specifically underlie cognitive decline in these patients. In addition to neuroimaging, another method that allows studying brain networks and their disruption in PD is transcranial direct current stimulation (tDCS), which, in addition to modulating functional connectivity, provides a tool for cognitive and motor rehabilitation. This thesis comprises three different studies that had two main goals. On one hand, it was aimed at characterizing the brain’s structural and functional correlates of semantic and phonemic fluency cognitive deficits in patients with PD using MRI, fMRI and tDCS methods. On the other hand, given the lack of a comparison of the relative contribution of different existing MRI-based techniques to characterize cortical degeneration in PD, specific changes in different characteristics of the cortical gray matter (GM) layer were assessed to determine whether brain atrophy in PD can be attributed to changes in cortical thickness, cortical folding or GM volume. The first study of this thesis showed that semantic fluency is associated with GM density in cortical frontal and temporal areas in PD patients, suggesting this function relies both on executive functions and semantic memory processes. The second study showed that by stimulating the left dorsolateral prefrontal cortex with tDCS, significant enhancement of functional connectivity occurs in both semantic and phonemic fluency networks in PD, in addition to a significant improvement of phonemic fluency functions. The third and final study showed that amongst the most widely used neuroimaging analysis techniques to assess cortical changes in PD, cortical thickness seems to be the most sensitive, followed by cortical folding and finally GM volume as assessed by voxel-based morphometry. To conclude, the results that were found in this thesis shaded light into previously unstudied issues related to PD, increasing the knowledge on some of the cerebral pathological changes that affect patients with this disorder. In addition they encourage the use of tDCS to explore brain networks in PD and suggest that surface-based techniques such as cortical thickness are useful to assess GM changes occurring in these patients. / Actualmente, la enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente después de la enfermedad de Alzheimer. Al ser un trastorno del movimiento, el síntoma principal de la EP es el deterioro de las funciones motoras. Sin embargo, la disfunción cognitiva actualmente se reconoce como una característica más de la EP, que está presente desde las fases iniciales de la enfermedad y que afecta a la mayoría de los pacientes a medida que la enfermedad va avanzando. Entre los déficits cognitivos más comunes en la EP se encuentra el deterioro de la fluidez semántica y fonológica que normalmente se atribuye al deterioro de las funciones ejecutivas. Aunque todavía no se han establecido biomarcadores definitivos para la EP, los métodos de neuroimagen como la resonancia magnética estructural y funcional (RM, RMf) y los métodos de estimulación cerebral no invasiva como la estimulación por corriente directa (ECT) ofrecen la posibilidad de estudiar los sustratos neurobiológicos del deterioro cognitivo en estos pacientes. Esta tesis está formada por tres estudios. El primer estudio de esta tesis demostró que la fluidez semántica está asociada con la densidad de sustancia gris en áreas corticales frontales y temporales en los pacientes con EP, lo que sugiere que esta función se basa tanto en las funciones ejecutivas como en la memoria semántica. El segundo estudio mostró que la ECT sobre la corteza prefrontal dorsolateral izquierda, da lugar a un aumento significativo de la conectividad funcional en las redes neuronales de la fluidez semántica y fonológica, además de una mejora significativa de las funciones de fluidez fonológica en la EP. El tercer y último estudio mostró que entre las técnicas de análisis de neuroimagen más utilizadas para evaluar los cambios corticales en la EP, el grosor cortical parece ser el más sensible, seguido por el plegado cortical y el volumen de sustancia gris. Para concluir, los resultados que se encontraron proporcionan información relevante sobre temas que previamente no se habían estudiado en la EP, aumentando el conocimiento sobre algunos de los cambios cerebrales patológicos que afectan a los pacientes con este trastorno

Parkinson’s disease (PD) is an incurable, chronically progressive neurodegenerative disease leading to premature invalidity and death. The locomotor disability of PD patients is mainly rooted in the gradual and insidious degeneration of dopaminergic neurons (DA) projecting from the midbrain substantia nigra (SN) to the basal ganglia striatum, a pathological process highlighted microscopically by the formation of insoluble cytosolic protein aggregates, known as Lewy bodies and Lewy neurites. The pathogenic mechanisms leading to PD remain poorly understood, arguably owing to the lack of suitable animal and cellular experimental models of the disease. Therefore, there is an urgent need for developing reliable experimental models that recapitulate the key features of PD. The recent development of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has enabled the generation of patient-specific iPSC and their use to model human diseases, although it is currently unclear whether this approach could be useful to successfully model age-related conditions. Importantly, disease modeling using iPSC largely relies on the existence of efficient protocols for the differentiation of disease-relevant cell types. Here, we first developed an efficient protocol for the differentiation of iPSC to authentic midbrain-specific DA neurons with SN properties by forced expression of LMX1A using a lentivirus-mediated gene delivery system. Next, we generated an iPSC-based cellular model of PD that recapitulates key phenotypic features of PD, such as DA neuron loss and α-synuclein accumulation in DA neurons from PD patients. Overall, our results demonstrate that we have developed a valuable tool for elucidating the pathogenic mechanisms leading to PD, as well as an experimental platform for screening new drugs that may prevent or rescue neurodegeneration in PD. / La malaltia de Parkinson (MP) és una malaltia neurodegenerativa incurable que causa invalidesa i mort prematura. Els pacients de la malaltia de Parkinson presenten alteracions motores degudes a una degeneració gradual de les neurones dopaminèrgiques que projecten des de la substància nigra fins a l’estriat. A nivell microscòpic s’observa la presència d’agregats proteics insolubles en el citosol de les neurones coneguts com cossos o neurites de Lewy. Els mecanismes patològics responsables de la MP no es coneixen bé, possiblement a causa de la manca de models animals i cel•lulars adequats. Per tant, existeix una gran necessitat de desenvolupar models experimentals fiables que recapitulin les característiques bàsiques de la MP. El recent desenvolupament de les cèl•lules mare pluripotents induïdes (iPSC) ha permès la generació de iPSC específiques de pacient i el seu ús per modelar malalties humanes, ara bé, no és clar si aquesta estratègia es pot utilitzar per modelar exitosament malalties d’origen tardà, com ara la MP. És important destacar que el modelatge de malalties utilitzant iPSC, es basa, en gran mesura en l'existència de protocols eficients per a la diferenciació de les iPSC cap al tipus cel•lular rellevant per a la malaltia. Durant aquest període, per primera vegada, s’ha desenvolupat un protocol per a l’eficient diferenciació de les iPSC cap a neurones dopaminèrgiques amb les propietats característiques de neurones dopaminèrgiques nigrostriatals, mitjançant l’expressió forçada de LMX1A utilitzant vectors lentivirals. A continuació, s’ha generat un model cel•lular usant iPSC derivades de pacients de MP que recapitula les principals característiques fenotípiques de la malaltia, com ara la pèrdua de neurones dopaminèrgiques i l'acumulació de α-sinucleïna en les neurones dopaminèrgiques. En general, els nostres resultats demostren que hem desenvolupat una eina valuosa per a l’estudi dels mecanismes patològics que condueixen a la MP, així com una nova plataforma pel descobriment de nous fàrmacs encaminats a prevenir o evitar la neurodegeneració.

Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP), representan un grave problema de salud pública, sobre todo en los países occidentales, donde el envejecimiento creciente de la población augura un incremento sustancial de la prevalencia de estas patologías. A pesar de que ciertos tratamientos proporcionan una disminución de las manifestaciones clínicas, el avance del proceso neurodegenerativo es irreversible. La identificación de los mecanismos, como la interacción entre factores genéticos y medio-ambientales, implicados en la etiología y evolución de estas patologías es de importancia capital. En el presente trabajo de tesis se explora el papel de la metilación del ADN genómico y el mosaicismo genético en enfermedades neurodegenerativas. El análisis del perfil de metilación del ADN se realizó empleando dos arrays de metilación: “HumanMethylation” (27K y 450K, IlIumina), cuyas sondas distribuidas estratégicamente por todo el genoma, permiten detectar cuantitativamente el estado de mutilación de unos 27.000 y 450.000 dinucleótidos CpG, respectivamente. La comparación de un total de 60 individuos (28 con enfermedad de Alzheimer, 3 con enfermedad de Parkinson y 29 controles) ha permitido identificar el perfil de metilación del genoma de distintas áreas del sistema nervioso central (SNC) (corteza, amígdala, hipocampo, hipotálamo, protuberancia, sustancia negra y cerebelo), mostrando la existencia de un patrón diferencial entre hombres y mujeres, asociado a la inactivación del cromosoma X, un patrón independiente para cerebelo, y un patrón de metilación de un conjunto de dianas característico de los estadíos 3 y 4 de Braak de la EA. Asimismo, se observaron diferencias significativas de metilación (1.112 CpGs, p<0,0l) en el cerebelo asociadas a la EA, confirmando su implicación en la enfermedad. El análisis del mosaicismo somático del cerebro se realizó empleando el "SurePrint G3 human CGH array 400K" (Agilent). Tomando como área de referencia el cerebelo se detectaron ganancias o pérdidas de material genómico entre áreas del cerebro de un mismo individuo. Dos muestras de corteza, pertenecientes a dos controles, presentaron una ganancia de material genómico en el gen WWOX, mientras que tan solo una muestra mostró una ganancia de material genómico en el gen ADAM5P3A. La elevada frecuencia de variantes en el número de copia en WWOX y su posible implicación en EA llevó a genotipar un mayor número de individuos, aunque ninguno mostró mosaicismo somático. El análisis del estado de metilación de las sondas ubicadas en WWOX permitió observar una disminución significativa de la metilación entre pacientes y controles en 14 sondas (T-student, p<0,05), sugiriendo que la regulación epigenética de WWOX puede estar alterada en la EA. En conjunto, estos resultados muestran la alteración de los perfiles de mutilación del SNC en relación con la EA tardía (estadíos 3 y 4 de Braak). Principalmente, en una de las regiones cuya afectación patológica en la EA ha sido más controvertida, cerebelo. Es especialmente interesante remarcar que la aparición de las lesiones características de cerebelo tienen lugar en estadíos más avanzados, indicando la posibilidad de que la alteraciones epigenéticas observadas podrían corresponder a un evento prematuro en la progresión de la patología. / Neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), represent a major issue of public health in developing countries where the aging of the population is leading to a progressive increase of its prevalence rates. Currently, several therapeutic strategies help to palliate clinical symptoms, but the neurodegeneration is progressive and irreversible. Identification of underlying mechanisms leading to these disorders is essential to improve patient's life expectancy and quality. In this context, many efforts have been focused on identifying genetics and environment causes of these disorders with little success, highlighting the need to evaluate new mechanisms and factors involved. The present thesis project has explored the implication of new mechanisms, such as DNA methylation and somatic mosaicism in AD and PD. The analysis of DNA methylation was performed with a new methylation array technology: 'HumanMethylation' (27K and 450K, IlIumina), whose probes strategically distributed along the human genome, enables to quantify the methylation state of around 27,000 and 450,000 CpG sites, respectively. The pattern of methylation of 60 subjects (28 AD, 3 PD and 29 unaffected) with four to seven brain regions (cortex, amygdala, hippocampus, hypothalamus, pons, substantia nigra and cerebellum) has been assessed. The study has shown three ma in clusters depending on gender (female/male), brain area (cerebellum vs others) and disease stage (AD3 vs AD4). In addition, a' differential analysis performed in individual CpG sites proved the presence of significant differences associated to AD patient's cerebellum (1112 CpG sites, p<0.01). Somatic mosaicism analysis has been carried out with a 'SurePrint G3 human CGH array 400K' (Agilent) to detect intra-individual genomic gains and losses compared to cerebellum. A total of two cortex samples showed a genomic gain in the WWOX gene, whereas only one sample showed a gain on ADAM5P3A. WWOX has been considered as a potential candidate gene in previous AD studies, and was further analyzed in a larger cohort of human brain samples. Genotyping assays did not confirm the presence of new somatic mosaicism cases, but it was possible to determine the genotype distribution and compared data between samples. A significant hypomethylation of the WWOX promoter region was observed in AD patients compared to controls subjects (T-test, p<0.05) in 14 probes, suggesting a potential regulation of expression by methylation. Overall, these results highlight the implication of epigenetic mechanisms in neurodegenerative disorders, as AD. In particular, it is remarkable the specific pattern of methylation in the cerebellum in intermediate stages of AD, suggesting an overlap with early modifications, which could contribute to unraveling new mechanisms implicated in AD.