Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 154-182. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les cyanobactéries sont des procaryotes photosynthétiques ubiquitaires qui produisent un grand nombre de métabolites secondaires, dont des toxines. Parmi ces cyanotoxines, l'anatoxine-a est une neurotoxine puissante qui provoque une mort rapide après ingestion. La mort est causée par asphyxie car ces alcaloïdes sont de puissants agonistes du récepteur nicotinique de l'acétylcholine.L'équipe, au sein de laquelle j'ai effectué ma thèse, étudie la biosynthèse de l'anatoxine-a et de ses dérivés, chez les cyanobactéries. Des travaux précédents de l'équipe ont permis d'identifier le cluster de gènes responsable de la biosynthèse de l'anatoxine-a et de l'homoanatoxine-a, dans le génome de la cyanobactérie Oscillatoria sp. PCC 6506, une souche productrice d'homoanatoxine-a. Une voie de biosynthèse, à partir de la proline a été proposée par l'équipe.J'ai travaillé sur l'étude des dernières étapes de cette voie de biosynthèse, qui met probablement en jeu une polyketide synthase (PKS) AnaG et une thioestérase AnaA. Lors de ces étapes le précurseur de l'homoanatoxine-a est condensé à une unité acétate, puis subirait une méthylation, une hydrolyse et une décarboxylation, pour donner l'homoanatoxine-a. Néanmoins, la PKS AnaG ne possède ni domaine thioestérase ni domaine décarboxylase, et les dernières étapes de la biosynthèse sont donc mal définies. Nous avons décidé d'exprimer différents domaines d'AnaG chez Escherichia coli pour obtenir plus d'informations sur ces étapes. Nous avons également tenté de préparer un analogue du substrat putatif d'AnaG par synthèse chimique.Par ailleurs, nous avons étudié la biosynthèse de la dihydroanatoxine-a chez Cylindrospermum stagnale PCC 7417. / Cyanobacteria are photosynthetic ubiquiterious prokaryotes which produce a high range of secondary metabolites including toxins. Among these cyanotoxins anatoxin-a is a potent neurotoxin which causes the rapid death on ingestion. The death is caused by respiratory failure because these alkaloid are potent agonists of the nicotinic alcetylcholine receptor. The team in which I did my PhD thesis studies the biosynthesis of anatoxin-a and of its derivatives in cyanobacteria. Preceding works by our team have permitted the identification of the cluster of genes that is responsible for the biosynthesis of anatoxin-a and homoanatoxin-a in the cyanobacterium Oscillatoria sp. PCC 6506. A biosynthetic pathway from proline was also proposed by the team. I have worked on the final stages of this biosynthesis pathway which probably involves a polyketide synthase (PKS), AnaG, and a thioesterase, AnaA. During these stages, the homoanatoxin-a precursor is likely condensed to one acetate unit, and then it is subjected to a methylation, a hydrolysis and a decarboxylation , to yield homoanatoxin-a. The PKS AnaG possesses neither a thioesterase domain nor a decarboxylase domain, and the last steps of the biosynthesis are therefore not well defined. We have chosen to express different domains of AnaG in Escherichia coli to obtain more information on these steps. We have also attempted by chemical synthesis to prepare an analog of the substrate of AnaG. With these tools in hand and with the use of mass spectrometry we hope to be able to confirm the biosynthetic pathway we have put forth. We have also studied the biosynthesis of dihydroanatoxin-a in Cylindrospermum stagnale PCC 7417.

Per a modelar alguns aspectes bioquímics i anatomopatològics de la malaltia de Parkinson en la rata, en aquesta tesi hem començant utilitzant la neurotoxina MPP+, de relativament recent aparició i la més veterana 6-OHDA i hem acabat emprant el propi neurotransmissor de les neurones que degeneren, la dopamina, intentant esbrinar els seus mecanismes de lesió. L’estudi s’ha iniciat en el animal in vivo, ha continuat en talls gruixuts de teixit ex vivo i ha acabat en mitocondris in vitro. Hem volgut reproduir resultats d’altres grups però amb abordat¬ges experimentals més senzills i econòmics, al nostre abast. Hem volgut aplicar el nostre model animal per a estudis comparatius amb la malaltia humana Per a la introducció he partit d’uns 50 articles de revisió actualitzats, amb la voluntat d’adquirir una visió panoràmica de la malaltia de Parkinson: les hipòtesis etiopatogèniques, les manifestacions clíniques, els trets anatomopatològics i bioquímics, així com dels models animals que s’utilitzen per a reproduir-la. En aquests articles he trobat les referències biblogràfiques per aprofundir en els aspectes més directament relacionats amb els experiments realitzats. Per als resultats, que s’han de contemplar dins el marc de la participació en projectes dels nostre grup i d’altres que utilitzaven aquests models animals d’experimentació, hem triat aquells en els que he participat directament, treballs que en alguns casos han estat els preliminars per altres treballs de doctorat del grup. Pràcticament tots els resultats que presentem han estat publicats, com article, en revistes internacionals, aquí queden recollits en l’apartat d’annexes, raó per la qual en la introducció general no consten alguns conceptes introductoris que apareixen en cadascun d’ells.

Les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson sont causés par un déficit dopaminergique progressif au niveau du corps strié, résultant principalement de la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire et de la voie nigrostriée qui contrôle une partie importante du système musculaire volontaire. Les symptômes cliniques cardinaux sont la perte de mobilité, la rigidité musculaire et la difficulté à initier un mouvement volontaire. L'étiologie de la maladie est incomprise jusqu'à ce jour. Tout au long de mes études, l'objectif principal de mes recherches était de démontrer que le stress oxydant est un joueur majeur de la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Mon travail de recherche s'est concentré, premièrement, à l'étude des mécanismes cellulaires engendrés par des agonistes dopaminergiques face à un traitement oxydant. Nous avons employé un modèle cellulaire dopaminergique, traité avec des agonistes dopaminergiques et le MPP+ , une neurotoxine dopaminergique connue. Nous avons constaté que non seulement les agonistes dopaminergiques utilisés n'offrent aucune protection contre l'effet oxydant de la neurotoxine, mais qu'ils renforcent la toxicité du MPP+ . Notre hypothèse comporte trois volets : l'activation du récepteur dopaminergique de type D2 (1) favorise l'expression du transporteur de la dopamine, (2) favorise la diminution de l'expression du récepteur de type D3 et (3) facilite l'entrée du MPP+ par le transporteur de la dopamine. Deuxièmement, mes recherches ont démontré que le traitement au MPP+ et/ou aux estrogènes altère l'activité transcriptionnelle des niveaux de neurofilaments. Mes résultats démontrent qu'il y a une corrélation entre l'effet cellulaire du traitement estrogénique et l'expression des protéines du cytosquelette des cellules suite à un traitement oxydant. Troisièmement, j'ai démontré que Nur77, un facteur de transcription nucléaire orphelin favorisant l'expression des gènes de survie de cellules, a la capacité de se transférer du noyau vers le cytoplasme, où il peut agir en tant qu'agent pro-apoptotique lors d'un traitement à la 6-hydroxydopamine. Nous avons également montré que le bêta-estradiol, une hormone neuroprotectrice, retarde la translocation de Nur77, retardant ainsi l'apoptose induite par la 6-hydroxydopamine. Puisque Nur77 est normalement vu comme un agent anti-apoptotique, mes résultats fournissent des nouvelles avenues au sujet du rôle de Nur77 et de sa translocation cytoplasmique sous effets oxydants. / Parkinson's disease is a neurodegenerative disease caused by a progressive cell loss in the striatum, mainly resulting from degeneration of the nigrostriatal pathways. This pathway, thoroughly dopaminergic, provides the necessary inputs to the striatum regarding voluntary muscle regulation. Cardinal symptoms observed in patients are loss of mobility, muscle rigidity and difficulty to initiate any voluntary movement. The etiology of the disease is poorly understood. Throughout my studies, the main objective of my research was designating oxidative stress as a potential lead player of dopaminergic cells' demise. In the first part, my work focused on the molecular players involved in dopaminergic agonist-treated cells undergoing oxidative stress. We used a cellular model of dopaminergic cells treated with dopamine agonists and with MPP+ , a known dopaminergic neurotoxin. Surprisingly, we found that dopamine agonists did not offer any protection against oxidative stress, and that they actually potentiate MPP+ toxicity. After three years of intensive research, we conclude that the D2 dopamine receptor sub-type activation promotes dopamine transporter expression, downregulates the D3 dopamine receptor subtype expression and thus promotes MPP+ -induced cytotoxicity. These in vitro experiments provide a better understanding of D2 dopamine receptor subtype activating cascade. Also, recent evidence suggests that the D3 dopamine receptor subtype is the only receptor offering real protection against oxidative stress. This may explains the discrepancies between in vivo and in vitro data on the neuroprotection conferred by dopamine agonists. My second research topic focused on transcriptional regulation of neurofilaments following MPP+ and/or estrogenic treatments. Our results demonstrate a relationship between estrogenic treatment and cytoskeletal strengthening of the cells. Upon treatment with estradiol, cells readily demonstrated an ability to replace the impaired neurofilaments when sustaining oxidative stress, possibly explaining part of the neuroprotective properties characteristic of estrogens. Thirdly, I demonstrated that Nur77 can translocate from the nucleus to cytoplasm, where it can act as a pro-apoptotic agent, when cells undergo 6-hydroxydopamine toxic treatment. We also showed that p-estradiol delays Nur77 translocation, thus preventing 6- hydroxydopamine-induced apoptosis. Because Nur77 is normally seen as an antiapoptotic agent, my results provide new insights about other roles for this protein and the regulation of its cytoplasmic translocation by oxidative stress.

Les toxines phytoplanctoniques présentent une large diversité, tant du point de vue de leurs structures chimiques que de leurs effets biologiques. La multiplicité des familles de toxines ainsi que l'observation de plus en plus fréquente d'épisodes toxiques non expliqués ont rendu l'interprétation des tests in vivo très délicate. Des méthodes complémentaires aux tests in vivo telles que les analyses chimiques ont été développées et permettent une détection spécifique des toxines connues dans un cadre réglementaire. En vigilance, il est nécessaire de pouvoir détecter de nouvelles toxines et analogues. Les lignées cellulaires font partie des méthodes complémentaires prometteuses pour ce faire. Les réponses obtenues à l'échelle cellulaire donnent des informations sur les cibles moléculaires et les mécanismes de toxicité associés aux molécules ou extraits testés. Ces connaissances sont un support pour (i) la meilleure évaluation du risque pour l'homme et (ii) l'apport de connaissances sur les épisodes toxiques. Ce travail de thèse s'inscrit dans ce contexte en se focalisant spécifiquement sur l'analyse des réponses de modèles cellulaires exposés à des neurotoxines. La lignée cellulaire Neuro-2a a été sélectionnée comme modèle cellulaire pour étudier les réponses face à différentes neurotoxines pour lesquelles les niveaux de connaissances des modes d'action sont bien ou peu décrits. L'objet de la première partie de ce travail est de caractériser les réponses de ce modèle cellulaire exposé aux saxitoxines, neurotoxines agissant sur le site 1 de la sous unité α du canal sodium voltage-dépendant. Cette démarche nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois en France, des saxitoxines en eau douce et de discuter le risque pour l'homme. Ensuite, les réponses du modèle Neuro-2a exposé à la palytoxine et à ses analogues, neurotoxines émergentes agissant sur la pompe Na+, K+-ATPase, ont été caractérisées. Enfin, les effets à l'échelle cellulaire du 13-desméthyle-C spirolide, neurotoxine émergente sur les côtes françaises pour laquelle les études toxicologiques sont limitées, ont été investigués. La discussion générale replace l'ensemble des données acquises au cours de cette thèse dans un contexte plus général de l'utilisation des modèles cellulaires pour contribuer à une meilleure connaissance des épisodes de toxicité du phytoplancton et du risque qu'ils représentent pour l'homme.

Les venins sont des armes sophistiquées, utilisées par les organismes venimeux pour se défendre des prédateurs, ainsi que pour paralyser et tuer leurs proies. Mais dans la nature, le bien n’est jamais très loin du mal, les toxines venimeuses pouvant se révéler être des agents thérapeutiques efficaces. Les peptides de venins de fourmis ont donc été étudiés dans cette thèse afin de déterminer le potentiel de ces toxines pour la découverte de molécules thérapeutiques innovantes. A l’instar des autres venins d’insectes, les venins de fourmis restent peu étudiés, principalement en raison de la petite taille de ces insectes et des quantités limitées de venins disponibles. Cependant, les fourmis offrent l’avantage d’être des insectes sociaux très abondants dans tous les milieux terrestres. En collectant les venins de plusieurs individus, il est donc possible d’obtenir des quantités suffisantes de venin pour les analyses biochimiques et pharmacologiques.Afin d’assurer la reproductibilité des analyses, une identification taxonomique correcte est nécessaire. Dans cette optique, un outil de chimiotaxonomie a été développé durant cette thèse (permettant ainsi de regrouper les venins provenant de plusieurs colonies afin de compenser les faibles quantités de matériel biologique par individu ou par colonie).Ensuite, nous nous sommes intéressés aux facteurs écologiques impliqués dans la diversification des venins de fourmis. Pour cela, la toxicité et la composition des venins de fourmis ont été analysés en relation avec le polyéthisme, la spécialisation alimentaire et la spécialisation défensive.La diversité écologique des fourmis a amplement contribuée à la diversification des venins. En étudiant les venins de 82 espèces de fourmis, nous avons révélé la grande diversité structurale des toxines. Bien que la majorité des peptidomes sont composés par de petits peptides linéaires, des peptides structurés par des ponts disulfure ont été révélés dans de nombreux venins et constituent de nouvelles familles structurales de toxines.La purification de certains de ces peptides à ponts disulfure a permis leur caractérisation biochimique et l’évaluation de leur rôle biologique. Ainsi nous avons décrit un groupe de peptides neurotoxiques, baptisés les formicitoxines qui sont capables de bloquer les canaux calcium humains de type L. La commutatoxine est, quant à elle, un peptide avec un pont disulfure qui semble activer les récepteurs humains TRPV1 et TRPV3 et laisse supposer une implication dans l’induction de la douleur chez les mammifères.La grande diversité des peptides mise en évidence dans les venins, associée à la grande diversité écologique et taxonomique des fourmis, suggère que les venins de fourmis constituent un nouveau champ d’exploration prometteur pour la recherche de molécules thérapeutiques et insecticides. Les venins de fourmis s’ajoutent à la chimiothèque conséquente déjà représentée par les venins des autres animaux venimeux. / Venoms are sophisticated weapons employed by venomous organisms to ward off predators, as well as to subdue and kill prey. However, in nature, good is never far from bad and venom toxins may prove to be efficient therapeutic agents. Ant venom peptides were investigated in the course of this thesis to evaluate their potential in the discovery of novel drugs. Like other insect venoms, ant venoms remain understudied, mainly due to the small size of individual ants and, so, the limited a mount of venom available. The ecological diversity of ants has largely contributed to venom diversification. By studying the venom peptidomes from 82 ant species, we have revealed the great structural diversity of the toxins. Although the majority of the peptidomes are comprised of small and linear peptides, peptides structured by disulfide bonds were also brought to light in numerous venoms and constitute novel structural classes of toxins. The purification of some of these disulfided peptides permitted their biochemical characterization and the assessment oft heir biological functions. The enormous peptide diversity revealed among venoms combined with the great ecological and taxonomical diversity of ants suggests that ant venoms constitute a promising new source in the search for both novel drugs and insecticides. Ant venom augments the vast bioactive molecules library represented by venoms from other venomous animals.