Les bactéries du genre Mycobacterium possèdent une enveloppe très caractéristique composée d'une membrane plasmique, une paroi et une capsule. Le compartiment pariétal est le plus remarquable, notamment grâce à la présence de lipides non liés de façon covalente à la structure : les lipides extractibles. Ubiquitaires ou spécifiques à une espèce, ces derniers sont retrouvés en surface, où ils peuvent jouer un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène. La synthèse et le transport de ces lipides nécessite l'intervention d'une enzyme modulaire appelée polykétide synthase (Pks), d'une enzyme activant le substrat de la Pks, d'une autre transférant le produit de la Pks sur une molécule acceptrice et enfin d'un transporteur de la famille RND (résistance, nodulation, division cellulaire). Un locus regroupant les gènes codant pour des protéines de biosynthèse et de transport de lipides extractibles a été retrouvé sur le chromosome de M. smegmatis entre les gènes MSMEG_0406 et MSMEG_0413. Nous avons alors entrepris de caractériser le rôle de chacun de ces gènes. Notre stratégie a consisté à inactiver ces gènes par recombinaison homologue puis à étudier la nature et la localisation des dérivés lipidiques de l'enveloppe des mutants. Suite à la caractérisation structurale des dérivés lipidiques affectés par ces mutations, nous avons montré que ce locus est lié aux polyphléates de tréhalose (PPT), auparavant décrits chez M. phlei. Le composé mature consiste en un tréhalose estérifié par sept acides gras polyinsaturés appelés acides phléiques. L'étude des génomes mycobactériens a montré que ces gènes sont conservés par un large panel de mycobactéries non tuberculeuses, en particulier M. avium et M. abscessus, deux pathogènes opportunistes. L'analyse du contenu lipidique de ces deux espèces a mis en évidence un composé possédant des propriétés similaires aux PPT. Par ailleurs, l'inactivation chez M. abscessus de l'orthologue du gène codant la Pks abolit la production de ces composés, confirmant ainsi le rôle de la Pks. Par analogie avec les voies de biosynthèse des glycolipides produits par M. tuberculosis, agent de la tuberculose, nous avons pu établir un modèle de la voie de biosynthèse des PPT chez les mycobactéries. / The unique mycobacterial envelope can be divided into three entities: a plasma membrane, a cell wall and a capsule. The parietal compartment is remarkable for its lipid content notably the extractible lipids, not covalently bound to the structure. Either ubiquitous or species-specific, these surface lipids can play key roles in host-pathogen interactions. The synthesis and transport of many extractible lipids require at least a modular enzyme called polyketide synthase (Pks), a protein allowing the activation of the Pks substrate, another transferring the Pks product onto an acceptor molecule and a RND transporter (resistance-nodulation-division). A locus containing synthesis and transport coding genes was found on the M. smegmatis chromosome between MSMEG_0406 and MSMEG_0413. We then undertook to characterize the role of each gene composing this locus. Our strategy was to disrupt these genes by homologous recombination and then to analyze the lipid content and localization of the mutant strain envelope. Structural characterization of the impacted lipids showed a link between this locus and trehalose polyphleates (PPT) synthesis. The mature compound is a trehalose acylated by seven polyunsaturated fatty acids called phleic acid and previously described in M. phlei. Analysis of mycobacterial genomes showed that these genes are conserved in several non tuberculous mycobacteria, including the opportunistic pathogens M. avium and M. abscessus. Analysis of the lipid content of both species showed a compound with the same properties than PPT. Moreover, inactivation of the M. abscessus pks orthologue abolished its production, thus confirming the Pks implication in the PPT synthesis. By analogy with M. tuberculosis glycolipid biosynthesis, we could propose a model of the PPT biosynthetic pathway in mycobacteria.

En 2020, la malaria a provoqué 241 millions de cas d'infections et 627 000 morts. La faible efficacité du vaccin disponible et la résistance aux traitements rendent indispensable l'identification de cibles thérapeutiques. Plasmodium falciparum (Pf) envahit les érythrocytes pour s'y répliquer. Pour cela, de protéines contenues dans des organites d'invasion, tels que les micronèmes et les rhoptries rassemblés à un complexe apical, sont sécrétées. Le trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et les organites d'invasion est médié par la PfSortiline. Dans les organismes modèles, la sortiline est recyclée entre les organites cibles et l'appareil de Golgi via le complexe protéique rétromère composé des protéines de tri vacuolaire (Vps) Vps26-29-35. Ce complexe est recruté via les complexes VpsC, composé de Vps11-16-18-33, CORVET composé de Vps3-8 et HOPS, composé de Vps39-41. Chez Pf, l'ensemble des composants des complexes VpsC et rétromère sont conservés. Seulement PfVps3 du complexe CORVET est retrouvée et le complexe HOPS est absent. L'hypothèse du projet est que ces protéines conservées sont impliquées dans la biogenèse des organites du complexe apical via le recyclage de la PfSortiline vers l'appareil de Golgi. Pour vérifier cela, des souches de parasites exprimant les protéines de fusion PfVps3-11-16-18-29 étiquetées à un domaine GFP ont été construites. Des techniques de Western Blot et de microscopie à fluorescence ont montré que ces protéines de fusion sont exprimées lors du cycle érythrocytaire. Il semble que PfVps29-GFP localise à des structures semblables aux endosomes et partiellement aux micronèmes. Les protéines PfVps16-18-GFP semblent localiser aux micronèmes et partiellement aux rhoptries et à l'appareil de Golgi. Finalement, des souches dans lesquelles les protéines PfVps3-16-29-GFP peuvent être délocalisées de façon conditionnelle ont été construites. Il a été montré que PfVps16-GFP semble essentielle à la survie de Pf. Ce projet participe à la caractérisation de nouvelles pistes thérapeutiques antipaludiques. / Malaria was responsible for 627,000 deaths and 241 million infections in 2020 alone. Drug resistance, and the poor efficacy of the only available vaccine, are strong arguments supporting the need to identify therapeutic targets. The malaria parasite Plasmodium falciparum (Pf) invades erythrocytes and multiplies inside them. To do so, it secretes invasion proteins located inside organelles, like micronemes and rhoptries, which are localised at an apical complex. Protein trafficking from the Golgi apparatus to these organelles is dependent on PfSortilin. In model organisms, this protein is recycled between the target organelles and the Golgi Apparatus by a protein complex called retromer. This complex is composed of Vacuolar Sorting Proteins (Vps)-26-29-35. The retromer complex is recruited by complexes, composed of Vps11-16-18-33, CORVET, composed of Vps3-8, and HOPS, composed of Vps39-41. In Pf, all components of the retromer and the VpsC complexes are conserved. However, only PfVps3 of the CORVET complex is conserved and the HOPS complex is absent. We hypothesized that conserved proteins play a key role in apical complex biogenesis by recycling PfSortilin to the Golgi apparatus. To verify the hypothesis, parasite strains coding the fusion proteins PfVps3-11-16-18-29 tagged with a GFP were generated. Western Blot and fluorescence microscopy showed that those proteins are expressed during the erythrocyte life cycle. PfVps29-GFP seemed to localize at endosome-like structures and partially at micronemes. PfVps16-18 seemed to localise at micronemes too and partially at rhoptries and at the Golgi apparatus. Finally, strains where PfVps3-16-29 could be functionally mislocalized have been generated. This technique showed that PfVps16-GFP were essential for Pf survival. Our work could lead to the characterization of new antimalarial drug targets.

En 2020, la malaria a provoqué 241 millions de cas d'infections et 627 000 morts. La faible efficacité du vaccin disponible et la résistance aux traitements rendent indispensable l'identification de cibles thérapeutiques. Plasmodium falciparum (Pf) envahit les érythrocytes pour s'y répliquer. Pour cela, de protéines contenues dans des organites d'invasion, tels que les micronèmes et les rhoptries rassemblés à un complexe apical, sont sécrétées. Le trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et les organites d'invasion est médié par la PfSortiline. Dans les organismes modèles, la sortiline est recyclée entre les organites cibles et l'appareil de Golgi via le complexe protéique rétromère composé des protéines de tri vacuolaire (Vps) Vps26-29-35. Ce complexe est recruté via les complexes VpsC, composé de Vps11-16-18-33, CORVET composé de Vps3-8 et HOPS, composé de Vps39-41. Chez Pf, l'ensemble des composants des complexes VpsC et rétromère sont conservés. Seulement PfVps3 du complexe CORVET est retrouvée et le complexe HOPS est absent. L'hypothèse du projet est que ces protéines conservées sont impliquées dans la biogenèse des organites du complexe apical via le recyclage de la PfSortiline vers l'appareil de Golgi. Pour vérifier cela, des souches de parasites exprimant les protéines de fusion PfVps3-11-16-18-29 étiquetées à un domaine GFP ont été construites. Des techniques de Western Blot et de microscopie à fluorescence ont montré que ces protéines de fusion sont exprimées lors du cycle érythrocytaire. Il semble que PfVps29-GFP localise à des structures semblables aux endosomes et partiellement aux micronèmes. Les protéines PfVps16-18-GFP semblent localiser aux micronèmes et partiellement aux rhoptries et à l'appareil de Golgi. Finalement, des souches dans lesquelles les protéines PfVps3-16-29-GFP peuvent être délocalisées de façon conditionnelle ont été construites. Il a été montré que PfVps16-GFP semble essentielle à la survie de Pf. Ce projet participe à la caractérisation de nouvelles pistes thérapeutiques antipaludiques. / Malaria was responsible for 627,000 deaths and 241 million infections in 2020 alone. Drug resistance, and the poor efficacy of the only available vaccine, are strong arguments supporting the need to identify therapeutic targets. The malaria parasite Plasmodium falciparum (Pf) invades erythrocytes and multiplies inside them. To do so, it secretes invasion proteins located inside organelles, like micronemes and rhoptries, which are localised at an apical complex. Protein trafficking from the Golgi apparatus to these organelles is dependent on PfSortilin. In model organisms, this protein is recycled between the target organelles and the Golgi Apparatus by a protein complex called retromer. This complex is composed of Vacuolar Sorting Proteins (Vps)-26-29-35. The retromer complex is recruited by complexes, composed of Vps11-16-18-33, CORVET, composed of Vps3-8, and HOPS, composed of Vps39-41. In Pf, all components of the retromer and the VpsC complexes are conserved. However, only PfVps3 of the CORVET complex is conserved and the HOPS complex is absent. We hypothesized that conserved proteins play a key role in apical complex biogenesis by recycling PfSortilin to the Golgi apparatus. To verify the hypothesis, parasite strains coding the fusion proteins PfVps3-11-16-18-29 tagged with a GFP were generated. Western Blot and fluorescence microscopy showed that those proteins are expressed during the erythrocyte life cycle. PfVps29-GFP seemed to localize at endosome-like structures and partially at micronemes. PfVps16-18 seemed to localise at micronemes too and partially at rhoptries and at the Golgi apparatus. Finally, strains where PfVps3-16-29 could be functionally mislocalized have been generated. This technique showed that PfVps16-GFP were essential for Pf survival. Our work could lead to the characterization of new antimalarial drug targets.

Les médiateurs lipidiques jouent un rôle central dans la régulation de l'inflammation. Ils induisent le recrutement et l'activation des leucocytes au site d'une infection ou d'un danger, en plus de participer à la résolution de l'inflammation, par leurs effets anti-inflammatoires et pro-résolution. Plusieurs enzymes produisent des médiateurs lipidiques, dont les lipoxygénases (LO), qui ont la capacité de métaboliser des acides gras, des endocannabinoïdes et des phospholipides en une grande variété de médiateurs lipidiques bioactifs, tant des médiateurs pro-inflammatoires et des médiateurs anti-inflammatoires. Les LO sont des cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires chroniques dues à cette grande polyvalence. Plusieurs LO existent chez l'humain, dont la 5-LO et la 15-LO, qui sont toutes les deux exprimées par les leucocytes humains. L'objectif de ce projet était de caractériser la production de médiateurs lipidiques dérivés des LO par les leucocytes. Par LC-MS/ MS, nous avons quantifié les médiateurs lipidiques dérivés des LO produits par les neutrophiles et les éosinophiles. Le projet a été séparé en quatre sections, avec des objectifs spécifiques pour chacune de ces sections. Premièrement, nous avons évalué la production de médiateurs lipidiques par la 15-LO par les neutrophiles et les éosinophiles humains. Nous avons montré que les neutrophiles et les éosinophiles ont la capacité de produire des médiateurs 15-LO-hydroxylés à partir d'acides gras (acide linoléique, acide dihomo-γ-linolénique, acide arachidonique, acide éicosapentaénoique et acide docosahexaénoique), et à partir d'endocannabinoïdes (2-arachidonoyl-glycérol et N-arachidonoyl-éthanolamine). De plus, nous avons décrit la production de deux nouveaux médiateurs dérivés de la 15-LO, soit le 13-HODE-G et le 13-HODE-EA. Nous avons également montré que les éosinophiles produisent des médiateurs 15-LO-hydroxylés par la 15-LO-1, alors que le mécanisme de la production de médiateurs 15-LO-hydroxylés par les neutrophiles n'a pas été identifié. Le deuxième objectif était d'identifier le rôle du LTB₄, un médiateur dérivé de la 5-LO, sur les fonctions des neutrophiles et des éosinophiles humains, et d'évaluer l'impact de sa dégradation. Le LTB₄ est un médiateur pro-inflammatoire qui est très rapidement dégradé par l'enzyme CYP4F3A, exprimée par les neutrophiles, pour former le 20-OH-LTB₄ et le 20-COOH-LTB₄. Nous avons montré que les métabolites du LTB₄ activent les fonctions des neutrophiles et des éosinophiles, mais avec une plus faible intensité que le LTB₄. De plus, ces métabolites inhibent les fonctions LTB₄-dépendantes des neutrophiles et des éosinophiles, en induisant l'internalisation du récepteur BLT₁. Nous avons également identifié un nouvel inhibiteur du CYP4F3A, le PF-4708671. Cet inhibiteur était plus efficace que l'inhibiteur commercial du CYP4F3A, et pourrait servir de base pour le développement d'inhibiteur plus spécifique du CYP4F3A. Le troisième objectif était de comparer les médiateurs lipidiques produits par les éosinophiles humains et murins. Puisque plusieurs modèles murins existent pour l'étude de l'inflammation et le rôle des médiateurs lipidiques, nous avons directement comparé la capacité biosynthétique entre les deux espèces. Nous avons souligné plusieurs différences majeures entre la production de médiateurs lipidiques dérivés des LO par les éosinophiles humains et murins. Par rapport aux éosinophiles humains, les éosinophiles murins produisent majoritairement du LTB₄ (et très peu de LTC₄), produisent plus de 12-HETE (et moins de 15-HETE), et produisent environ 10 fois plus de médiateurs spécialisés dans la résolution. Finalement, le dernier objectif de ce projet était de caractériser la production de médiateurs lipidiques dérivés des LO en contexte d'inflammation aiguë. Puisque ce projet a été effectué en partie pendant la pandémie de COVID-19, nous avons quantifié les médiateurs lipidiques dans les lavages bronchoalvéolaires de patients atteints de la COVID-19 sévère et comparé les niveaux avec des donneurs sains. Nous avons montré que tous les médiateurs lipidiques dérivés des LO ainsi que leurs substrats étaient augmentés chez les patients atteints de la COVID-19 sévère. De plus, presque tous les médiateurs lipidiques corrélaient entre eux, soulignant la présence d'une tempête lipidique, à l'image de la tempête cytokinique présente chez ces patients. En conclusion, ce projet a permis de caractériser la production de médiateurs lipidiques dérivés des LO, et de mieux comprendre comment il est possible de moduler leurs niveaux. L'étude de ces médiateurs est très importante, puisqu'ils jouent des rôles variés et peuvent être synthétisés très rapidement en contexte inflammatoire. Une meilleure compréhension de leur synthèse pourrait permettre le développement de traitement qui modulerait les niveaux de ces médiateurs lipidiques de façon transitoire dans diverses pathologies inflammatoires chez l'homme. / Lipid mediators play a central role in the regulation of inflammation. Some induce the migration and activation of leukocytes at the site of an infection or a danger, while others are involved in the resolution of inflammation, acting as anti-inflammatory and pro-resolving mediators. Many enzymes are responsible for the biosynthesis of these lipid mediators. Lipoxygenases (LO) metabolize fatty acids, endocannabinoids, and phospholipids into both pro- and anti-inflammatory bioactive lipid mediators, making LOs very interesting therapeutic targets for the treatment of chronic inflammation. In humans, there are many LOs, including 5-LO and 15-LO, both enzymes expressed in leukocytes. The main objective of the project was to characterize the production of LO-derived lipid mediators by leukocytes. Using LC-MS/MS, we quantified the production of LO-derived mediators by neutrophils and eosinophils. This project was divided in four sections with specific objectives. First, we characterized the production of 15-LO derived lipid mediators by human neutrophils and eosinophils. We demonstrated that both eosinophils and neutrophils can produce 15-LO-hydroxylated mediators from fatty acids (linoleic acid, dihomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid), and from endocannabinoids (2-arachidonoyl-glycerol and N-arachidonoyl-ethanolamine). Moreover, we characterized two new 15-LO-derived mediators, 13-HODE-G and 13-HODE-EA. We also showed that eosinophils produced 15-LO-hydroxylated metabolites through 15-LO-1, but the mechanism behind the production of these metabolites by neutrophils has not been defined. The second objective of the project was to identify the role of the 5-LO-derived mediator LTB₄, and the impact of its degradation. LTB₄ is a pro-inflammatory lipid mediator and is rapidly degraded into 20-OH- and 20-COOH-LTB₄ by CYP4F3A, an enzyme expressed in human neutrophils. We showed that LTB₄ metabolites are less effective than LTB₄ at inducing neutrophil functions. Moreover, these metabolites inhibited the LTB₄-dependent neutrophil and eosinophil functions. The metabolites induced the internalization of BLT₁, explaining the inhibition of the LTB₄-dependent functions. We also identified PF-4708671 as a new CYP4F3A inhibitor, that was more potent than the CYP4F3A commercial inhibitor 17-ODYA. PF-4708671 could therefore be used as a template to produce more specific CYP4F3A inhibitors. The third objective was to compare lipid mediator production between mouse and human eosinophils. Mouse models are widely used to investigate inflammatory diseases and the role of lipid mediators. We directly compared the biosynthetic ability of these cells to produce LO-derived lipid mediators. We found major differences in the production of these lipid mediators. Compared to human eosinophils, mouse eosinophils biosynthesized mainly LTB₄ (and almost no LTC₄), more 12-HETE (and less 15-HETE), and around 10 times more specialized pro-resolving mediators. Lastly, the fourth objective was to investigate the LO-derived lipid mediators in the context of acute inflammation. Because part of this project was done during the COVID-19 pandemic, we quantified the LO-derived mediators in the bronchoalveolar lavage fluids of severe COVID-19 patients and compared the levels with healthy donors. We found that all the LO-derived mediators and their substrates were increased in the lung of COVID-19 patients. Moreover, almost all the lipid mediators we quantified correlated with each other, showing that there is a lipid storm in the lungs of severe COVID-19 patients. In conclusion, this project increases the knowledge of LO-derived lipid mediator biosynthesis in neutrophils and eosinophils and on how to modulate their levels. Lipid mediators are complex and can have both pro- and anti-inflammatory effects. A better understanding of the biosynthesis of these lipids is highly important and could lead to the development of new anti-inflammatory therapies modulating their levels.

Les flavan-3-ols appartiennent à la famille des polyphénols retrouvés dans diverses plantes et majoritairement dans le raisin. Ils jouent un rôle primordial dans les mécanismes de défense des plantes, influent sur les propriétés organoleptiques du vin et sont potentiellement bénéfiques au niveau de la santé humaine. La voie de biosynthèse des flavanols monomères est décrite dans la littérature. Cependant, les mécanismes de formation des proanthocyanidines (polymères) sont inconnus à ce jour. Des études ont montré que les flavanols glycosylés sont des intermédiaires potentiels dans la biosynthèse des PA et permettent le transport des unités de flavanols du cytoplasme vers la vacuole de la cellule, où a lieu la polymérisation. Un criblage global des flavanols glycosylés présents dans des raisins à trois stades de développement et dans des vins de différents cépages a été réalisé en analysant séparément les pellicules et les pépins de raisin par une méthode d’UPLC-DAD-ESI-MS. La teneur de ces composés dépend de paramètres de type variété du raisin, tissu biologique étudié et stade de maturité. La présence de dimères de flavanol glycosylés a été montrée pour la première fois dans le raisin. Grâce à l’hémisynthèse de la (+)-catéchine 4’-O--glucoside et 7-O--glucoside, certains monomères ont été caractérisés comme appartenant à la classe des -glucosides. Une étude quantitative a montré l’évolution des flavanols glycosylés au cours du développement de la baie de raisin (pépins et pellicules séparés) provenant de trois cépages différents. Les monomères et dimères d’ (épi) catéchine diglycosylés ont été découverts pour la première fois et uniquement dans les pépins. Une diminution en monomères d’ (épi) catéchine monoglycosylés a été observée dans la pellicule au cours de la maturation du raisin. Les dimères d’ (épi) catéchine monoglycosylés s’accumulent un peu après le stade de véraison et diminuent ensuite à maturité. Les monomères et dimères d’ (épi) catéchine diglycosylés s’accumulent dans les pépins au cours de la maturation. Finalement, l’évolution des teneurs en flavanols mono et diglycosylés au cours de microvinifications a été étudiée. On observe des profils d’extraction similaires pour les deux variétés utilisées (Grenache et Syrah). La quantité totale des différentes familles de composés augmente au cours de la vinification, et ensuite diminue en fin de FA. Certains composés sont dégradés préférentiellement, suggérant la présence d’activités glycosidases spécifiques du raisin ou de la levure. / Flavan-3-ols belong to a group of polyphenols present in a wide variety of plants, and particularly in grapeberries. They play an important role in defense mechanisms in plants, have a significant impact on wine organoleptic properties; and their beneficial effects on human health may help to protect against chronic diseases such as atherosclerosis. The sequence of common flavanol monomer biosynthesis is widely described in the literature, but the formation mechanisms of proanthocyanidins (PA) remain unknown. Studies show that flavanol glycosides are potential intermediates in PA polymerization and have transporter roles of monomeric units from cytoplasm to vacuole in cell, where polymerization takes place. Global screening of grapeberry flavanol glycosides were carried out at three stages of grape development and in wines of different varieties; skin and seeds were measured separately using an UPLC-DAD-ESI-MS method. The composition of the target isomers depends on different parameters such as tissue type or stage of development. The presence epi catechin monoglycoside is reported here for the first time in grapes. Using (+)-catechin 4’-O--glucoside and 7-O--glucoside hemisynthesis, several monomers were shown to -glucosides. Quantitative analysis demonstrates the evolution of flavanol glycosides in both skin and seeds during the development of three grapevine varieties. For the first time monomeric and dimeric (epi) catechin diglycosides were revealed and shown accumulate only in grape seeds during ripening. A reduction in the concentration of monomeric (epi) catechin monoglycoside was observed during grape skin development. Dimeric (epi) catechin monoglycosides accumulate after veraison and then decrease at the end of grape ripening. The extraction profiles of flavanol glycosides during red grape fermentation showed similar evolution patterns for both varieties used. The total concentration of different compound families increases during winemaking, and then decreases at the end of fermentation. Degradation of specific compounds was observed at the end of fermentation which may be explained by the activity of glycosidases from grape extracts released during fermentation and pressing.

Les pyrrolamides constituent une famille de produits naturels dotés de diverses activités biologiques et synthétisés par des actinobactéries. La congocidine et la distamycine, les molécules les plus connues de cette famille, sont capables de se lier à l'ADN de façon non covalente selon une certaine spécificité de séquence (succession de 4 paires de base A/T). Récemment, les gènes et la voie de biosynthèse de la congocidine ont été identifiés et caractérisés chez S. ambofaciens. Ceci a révélé un mécanisme original impliquant notamment de nouvelles enzymes et de nouvelles voies pour la biosynthèse des trois précurseurs nécessaires à l’assemblage de la congocidine. Nous avons entrepris d’étudier la régulation de la biosynthèse de la congocidine chez S. ambofaciens et d’isoler et de caractériser les groupes de gènes de biosynthèse de deux autres pyrrolamides, la distamycine et les pyrronamycines (produites respectivement par S distallicus et un streptomyces non caractérisé). L'objectif de cette étude est, dans un premier temps, d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués lors de la biosynthèse de ces molécules (comme le mécanisme d’incorporation des pyrroles) et, par la suite, de manipuler les gènes identifiés pour synthétiser de nouvelles molécules pyrrolamides hybrides. / Pyrrolamides constitute a family of natural products with various biological activities, synthesized by actinobacteria. Congocidine (also called netropsin) and distamycin are the best characterized pyrrolamides, largely studied due to their ability to bind into the minor groove of the DNA double helix in a sequence specific manner (succession of four A/T bases). Recently, the congocidine biosynthetic pathway has been characterized in Streptomyces ambofaciens. We showed that an iterative Non Ribosomal Peptide Synthetase with an unusual architecture assembles congocidine, using precursors with undocumented biosynthetic pathways. With the aim of developing a combinatorial biosynthesis approach for the development of new pyrrolamides, we undertook the study of the regulation of congocidine biosynthesis in S. ambofaciens and the isolation of the distamycin and pyrronamycins biosynthetic gene clusters. Characterization of these clusters will result in a more detailed understanding of pyrrolamide biosynthesis (e.g. mechanism of pyrrole polymerization), and provide new tools (enzymes) and building blocks (precursors) necessary for combinatorial biosynthesis.

L'obésité est maintenant perçue comme un problème de santé majeur dans notre société. C'est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires liés au développement de cette maladie est primordiale. Des études comparatives entre des poulets de lignées grasses et des poulets de lignées maigres ont montré que la lipogénèse hépatique était plus élevée chez les animaux gras. La Synthétase des Acides Gras (FAS) est connue comme étant responsable de la synthèse des lipides saturés à longues chaînes. Des études antérieures ont démontré que ce gène est régulé à la fois par l'état nutritionnel et hormonal. Dans ce contexte, l'objectif de la présente étude était d'examiner le rôle de l'hormone thyroïdienne (T3), et aussi d'un mélange de T3 et d'insuline, sur l'activité transcriptionnelle du gène aviaire de la FAS. Certains des éléments agissant au niveau de la réponse à l'insuline ont déjà été identifiés chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Afin d'identifier l'effet de la T3 et d'un mélange de T3 et d'insuline, un fragment d'ADN de 1,6 Kpb de la partie promotrice de FAS a été isolé, séquencé et cloné dans un vecteur contenant le gène rapporteur codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT). Cette construction nommée 1.6FAS-pJFCAT1 a ensuite été transfectée de façon transitoire dans les cellules HepG2 et les hépatocytes embryonnaires de poulet. Les analyses d'expression ont démontré une augmentation de l'activité du gène rapporteur codant pour CAT de 2.5 fois, suite à une stimulation de 48 heures avec 1.6µM de T3. Ce promoteur posséderait donc un élément de réponse nécessaire à la modulation par cette hormone. Des constructions contenant des délétions successives de ce grand fragment d'ADN et des alignements de séquences ont permis l'identification de la région interne localisée entre -902/ -577 pb où se retrouve l'élément de réponse à la T3, appelé TRE pour 'Thyroïd Hormone Response Element'. Des analyses de retard sur gel (EMSA) utilisant comme TRE un oligonucléotide contenant les bases -732 à -692 ont ensuite permis d'identifier des protéines se fixant sur ce fragment d'ADN en réponse à la T3, renforçant ainsi la présence possible d'un TRE. Une augmentation de l'activité CAT de 2.3 fois a d'ailleurs aussi été obtenue après 48 heures de stimulation à la T3 lors d'expériences de transfections transitoires avec la construction contenant le fragment -765/-663 placé devant le promoteur TK. Le TRE correspondrait donc à la séquence CGCCCTgtggTAACCT, séquence très différente du consensus établi et très différente des T3RE retrouvés dans la partie promotrice du gène de l'enzyme malique. Il a toutefois une forte homologie avec un TRE retrouvé dans le gène FAS chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Ceci semble démontrer la forte variation de ces éléments de réponse. L'analyse par retard sur gel révèle qu'en présence de T3 seulement il y a fixation du récepteur TR alors que lorsque l'insuline est aussi présente, il semble que le facteur de transcription RXR se fixe aussi. Ceci suggérerait l'idée que la formation d'hétérodimères TR/RXR serait grandement favorisée en présence d'insuline. Ces informations, en combinaison avec les résultats récents obtenus par d'autres équipes sur la régulation de la FAS, serviront à la compréhension des mécanismes de régulation de la transcription d'un gène clé de la lipogenèse hépatique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hormone thyroïdienne, TRE, Synthétase des acides gras, FAS, Lipogenèse.

Les cyanobactéries sont des procaryotes photosynthétiques ubiquitaires qui produisent un grand nombre de métabolites secondaires, dont des toxines. Parmi ces cyanotoxines, l'anatoxine-a est une neurotoxine puissante qui provoque une mort rapide après ingestion. La mort est causée par asphyxie car ces alcaloïdes sont de puissants agonistes du récepteur nicotinique de l'acétylcholine.L'équipe, au sein de laquelle j'ai effectué ma thèse, étudie la biosynthèse de l'anatoxine-a et de ses dérivés, chez les cyanobactéries. Des travaux précédents de l'équipe ont permis d'identifier le cluster de gènes responsable de la biosynthèse de l'anatoxine-a et de l'homoanatoxine-a, dans le génome de la cyanobactérie Oscillatoria sp. PCC 6506, une souche productrice d'homoanatoxine-a. Une voie de biosynthèse, à partir de la proline a été proposée par l'équipe.J'ai travaillé sur l'étude des dernières étapes de cette voie de biosynthèse, qui met probablement en jeu une polyketide synthase (PKS) AnaG et une thioestérase AnaA. Lors de ces étapes le précurseur de l'homoanatoxine-a est condensé à une unité acétate, puis subirait une méthylation, une hydrolyse et une décarboxylation, pour donner l'homoanatoxine-a. Néanmoins, la PKS AnaG ne possède ni domaine thioestérase ni domaine décarboxylase, et les dernières étapes de la biosynthèse sont donc mal définies. Nous avons décidé d'exprimer différents domaines d'AnaG chez Escherichia coli pour obtenir plus d'informations sur ces étapes. Nous avons également tenté de préparer un analogue du substrat putatif d'AnaG par synthèse chimique.Par ailleurs, nous avons étudié la biosynthèse de la dihydroanatoxine-a chez Cylindrospermum stagnale PCC 7417. / Cyanobacteria are photosynthetic ubiquiterious prokaryotes which produce a high range of secondary metabolites including toxins. Among these cyanotoxins anatoxin-a is a potent neurotoxin which causes the rapid death on ingestion. The death is caused by respiratory failure because these alkaloid are potent agonists of the nicotinic alcetylcholine receptor. The team in which I did my PhD thesis studies the biosynthesis of anatoxin-a and of its derivatives in cyanobacteria. Preceding works by our team have permitted the identification of the cluster of genes that is responsible for the biosynthesis of anatoxin-a and homoanatoxin-a in the cyanobacterium Oscillatoria sp. PCC 6506. A biosynthetic pathway from proline was also proposed by the team. I have worked on the final stages of this biosynthesis pathway which probably involves a polyketide synthase (PKS), AnaG, and a thioesterase, AnaA. During these stages, the homoanatoxin-a precursor is likely condensed to one acetate unit, and then it is subjected to a methylation, a hydrolysis and a decarboxylation , to yield homoanatoxin-a. The PKS AnaG possesses neither a thioesterase domain nor a decarboxylase domain, and the last steps of the biosynthesis are therefore not well defined. We have chosen to express different domains of AnaG in Escherichia coli to obtain more information on these steps. We have also attempted by chemical synthesis to prepare an analog of the substrate of AnaG. With these tools in hand and with the use of mass spectrometry we hope to be able to confirm the biosynthetic pathway we have put forth. We have also studied the biosynthesis of dihydroanatoxin-a in Cylindrospermum stagnale PCC 7417.

Les ARN constituent des cibles thérapeutiques extrêmement intéressantes bien qu’encore assez peu exploitées. En effet, les obstacles pour la conception de ligands spécifiques de ces cibles non traditionnelles, polyanioniques et très flexibles, sont encore loin d’être levés. Les aminoglycosides, utilisés depuis longtemps pour leurs propriétés antibiotiques, sont souvent décrits comme des « ligands universels » d’ARN. Leur structure constitue donc une architecture favorable pour l’élaboration de nouveaux ligands spécifiques des ARN.Le but de cette thèse a été de développer une méthode systémique originale combinant chimie organique et microbiologie pour synthétiser de nouvelles molécules de structure analogue aux aminoglycosides, se fixant de façon spécifique sur des cibles ARN. Ce travail repose sur la compréhension récente des voies de biosynthèse des aminoglycosides permettant leur ingénierie rationnelle selon une stratégie de mutasynthèse. Cette approche expérimentale s’appuie sur la conception de mimes de métabolites naturels pouvant être transformés par des bactéries génétiquement modifiées. Le développement de méthodologies novatrices en ingénierie métabolique, synthèse organique et chimie analytique nous a permis de concevoir des analogues d’aminoglycosides fluorés qui se sont avérées être d’excellentes sondes dans l’étude des ARN par RMN du fluor. / Pas de résumé en anglais

Les membranes des chloroplastes sont riches en monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) et digalactosyldiacylglycérol (DGDG), deux galactolipides essentiels pour la biogenèse de ces organites et le fonctionnement de la machinerie photosynthétique. MGD1 est la galactolipide synthase majeure chez Arabidopsis thaliana. C’est une protéine monotopique, localisée dans l’enveloppe interne des membranes des chloroplastes, qui transfère un résidu galactose à partir d’UDP-galactose sur le diacylglycérol (DAG) pour former le MGDG. MGD1 a besoin de lipides anioniques tels que le phosphatidylglycérol (PG) pour être active, mais le mécanisme d’activation reste à ce jour inconnu. Des études antérieures ont permis d’identifier le résidu P189 comme étant potentiellement impliqué dans la liaison au PG, et le résidu H155 comme base catalytique potentielle. Le but de ma thèse a été d’obtenir plus d’informations sur le mécanisme de régulation de la MGD1, enzyme clé de la biogenèse des chloroplastes. Mon étude s’est portée sur la protéine native MGD1 et deux de ses mutants, H155A et P189A. Ces protéines ont été exprimées chez Escherichia coli et purifiées jusqu’à homogénéité. Une nouvelle méthode de dosage de l’activité MGDG synthase, adaptée de la technique de bioluminescence UDP-GloTM de Promega, a été mise au point. Cette méthode présente de nombreux avantages en termes de rapidité et de sensibilité comparée à la technique classiquement utilisée qui nécessite l’utilisation d’un UDP-Galactose radiomarqué. L’étude des propriétés d’association de MGD1 et des mutants à des membranes modèles, à l’aide de la technique des monocouches de Langmuir, a permis de proposer un mécanisme réactionnel inédit, impliquant une dyade catalytique de type PG-His, qui permet d’expliquer le rôle d’activateur du PG. Un nouveau test d’activité, basé sur cette même technique de Langmuir, qui présente l’avantage de pouvoir discriminer la capacité de liaison de MGD1 à la membrane et sa capacité à transférer un galactose sur son accepteur DAG a été mis en place. Il s’agit du premier exemple de synthèse d’un galactolipide sur une membrane biomimétique constituée d’un mélange DAG-PG. / The membranes of chloroplasts are enriched in monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), two essential galactolipids to the biogenesis of these organelles and the functioning of photosynthetic machinery. MGD1 is the major galactolipid synthase in Arabidopsis thaliana. It is a monotopic protein, located in the inner envelope of chloroplast membranes, which transfers a galactosyl residue from UDP-galactose to diacylglycerol (DAG) to form MGDG. MGD1 needs anionic lipids such as phosphatidylglycerol (PG) to be active, but the activation mechanism is still unknown. Previous studies identified the P189 residue as potentially involved in PG binding, and H155 as the putative catalytic base. The aim of my thesis was to progress in our understanding of the regulation of MGD1 activity, a key enzyme in the biogenesis of chloroplasts. My study focused on the native protein MGD1 and two mutants, H155A and P189A. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. A new method for assaying MGDG synthase activity, adapted from the Promega UDP-GloTM bioluminescent technique has been developed. This method has many advantages in terms of speed and sensitivity compared to the conventionally used technique which requires the use of a radiolabeled UDP-Galactose. Furthermore, the study of the association properties of MGD1 and mutants with model membranes, using the Langmuir monolayer technique, led us to propose a novel reaction mechanism, involving a PG-His type catalytic dyad, which may explain the role of PG as activator. A new activity test, based on the Langmuir technique, which has the advantage to discriminate the MGD1 binding capacity to the membrane and its ability to transfer a galactose to its acceptor DAG has been set up. This is the first example of galactolipid synthesis on a biomimetic membrane formed of a DAG-PG mixture.