L'étude de la ramification chez le pois, à partir des mutants hyper-ramifiés ramosus (rms) a permis de mettre en évidence l'existence d'une nouvelle famille d'hormones végétales : les strigolactones, inhibant la ramification des plantes à graines. La découverte de cette hormone végétale ouvre de nouvelles pistes de recherche sur la biosynthèse et la perception de cette nouvelle hormone. Nous avons montré le rôle du gène PsBRC1, codant un facteur de transcription de type TCP et homologue du gène TEOSINTE BRANCHED1 du maïs, dans la voie de signalisation des strigolactones. L’étude de ce gène nous a permis d'avoir une meilleure compréhension de l’interaction entre strigolactones et cytokinines dans le contrôle de la ramification, de la dynamique de la levée de dormance des bourgeons axillaires, et d'effectuer les premières études de relations structure-activité des strigolactones sur l’inhibition de la ramification chez le pois.Nous avons étudié et caractérisé d'autres éléments dans la voie de signalisation. Chez le pois, deux mutants, autres que Psbrc1, ne répondent pas à l’application de strigolactones, rms3 et rms4. Le gène RMS4 code pour une protéine à boîte F. Nous nous sommes focalisés ici sur le mutant hyper-ramifié rms3. Nous avons montré que RMS3 est l'homologue du gène D14 du riz, codant pour une protéine de la superfamille des α-β/hydrolases. Ces protéines peuvent avoir une activité enzymatique et ainsi pourraient modifier les strigolactones en un composé actif. Le récepteur des gibbérellines GID1 appartient aussi à cette famille, RMS3 est donc un bon candidat pour être le récepteur des strigolactones. Nous avons utilisé une strigolactone radiomarquée afin d’étudier le métabolisme de l'hormone. Nous avons découvert que la strigolactone synthétique, 3H-GR24 est clivée en un composé inconnu au contact des racines, indépendamment de l'activité de la protéine RMS3. Ce composé de structure inconnue se retrouve aussi dans la sève du xylème alors que 3H-GR24 y est absent.Outre un phénotype hyperbranché les mutants rms présentent une diminution de la taille de leurs entre-nœuds, qui n'est pas due à l’augmentation de la ramification. Nous avons étudié l'origine du nanisme des mutants déficients en strigolactones et affectés dans la réponse à l’hormone. Des approches génétiques et moléculaires ont été utilisées pour tester une interaction possible entre les strigolactones et les gibbérellines. Nous avons montré que les strigolactones régulaient l’élongation des entre-nœuds indépendamment des gibbérellines.Le pois est un excellent modèle en génétique et en physiologie. Avec le développement de nouvelles techniques à l'INRA (TILLING; UNIGENE : ensemble de plus de 40000 séquences exprimées de pois), nous avons pu identifier de nouveaux gènes de biosynthèse des strigolactones chez le pois et obtenir plusieurs nouveaux mutants de pois. Ces mutants seront essentiels pour les futures études du laboratoire et pourront permettre d'identifier de nouveaux intermédiaires dans la biosynthèse et le métabolisme des strigolactones. / The study of shoot branching in pea, using the high branching ramosus (rms) mutants has highlighted the existence of a new family of plant hormones: the strigolactones, inhibiting shoot branching in seed plants. The discovery of this novel plant hormone opens novel research areas in the deciphering of strigolactone biosynthesis and strigolactone perception. We have shown the role of the pea TCP transcription factor, PsBRC1, the homolog of the maize TEOSINTE BRANCHED (TB1) in strigolactone signaling. The PsBRC1 gene was shown to have a role in integrating strigolactone and cytokinin pathways, and allowed to have a better understanding of the dynamics of bud outgrowth, and to perform the first strigolactone Structure-Activity Relationship studies for branching inhibition in pea. We investigated and characterized other elements in the signaling pathway, including the strigolactone receptor. In pea, two mutants, other than Psbrc1, do not respond to the application of strigolactones, rms3 and rms4. The RMS4 gene encodes an F-BOX protein and here we focused on the high branching rms3 pea mutant. We have shown that RMS3 is the homolog of the rice D14 gene encoding a protein of the α-β/hydrolase superfamily. Consequently RMS3 may have an enzymatic activity to modify strigolactone into an active compound. The gibberellin receptor GID1 also belongs to this family, therefore RMS3 is also a good candidate for the strigolactone receptor. We used a radiolabeled synthetic strigolactone, 3H-GR24, to investigate the metabolism of the hormone. We discovered that the synthetic strigolactone, 3H-GR24 is cleaved in an unknown compound in the root media independently of RMS3 activity, compound which is also found in the xylem sap in contrast to 3H-GR24. The rms mutants exhibit not only a high branching phenotype but also a reduced height which is not due to this high branching. We investigated the origin of the dwarfism of strigolactone-deficient and response mutants in pea. Genetic and molecular approaches have been used to test a possible interaction between strigolactones and gibberellins. We have shown that strigolactones regulate stem elongation independently of gibberellin. Pea is a powerful model plant for genetics and physiology. With the development of new facilities at INRA (TILLING; UNIGENE set of more than 40000 expressed sequences), we were able to identify new biosynthesis genes in pea and to obtain several novel pea mutants. These mutants will be essential for future studies of the laboratory in particular to identify new intermediates in strigolactone biosynthesis and metabolism.

Les membranes cellulaires sont des cibles préférentielles de la dégradation induite par les espèces réactives de l’oxygène produites durant la sécheresse et par la stimulation d’activités hydrolytiques. La biosynthèse des lipides des chloroplastes peut être importante pour la tolérance à la sécheresse ainsi que pour la reprise après réhydratation. Dans ce travail nous avons étudié le métabolisme des lipides des membranes chloroplastiques, monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyl-diacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG), phosphatidyl-glycerol (PG), dans le cadre de la sécheresse et de la reprise après la fin de la contrainte hydrique. Dans ce but, nous avons mesuré la teneur des lipides des feuilles, suivi l’incorporation du précurseur 14C-acétate dans les lipides et analysé l’expression des gènes codant les enzymes de biosynthèse des lipides (MGD1, MGD2, DGD1, DGD2, SQD2 et PGP1) durant le stress hydrique et après réhydratation. Afin de mieux comprendre le rapport entre le métabolisme de ces lipides et la tolérance à la sécheresse, nous avons travaillé sur deux cultivars de Vigna unguiculata L. Walp, un tolérant (cv. EPACE) et l’autre sensible (cv. 1183) à la sécheresse. Les séquences complètes des ADNc des gènes VuMGD1, VuMGD2, VuDGD1, VuDGD2, VuSQD2 et VuPGP1 ont été obtenues par le criblage d’une banque d’ADNc de V.unguiculata. Les résultats montrent qu’en condition de stress hydrique le cultivar tolérant, en plus de préserver la teneur en lipides, est capable de stimuler la biosynthèse du DGDG augmentant significativement le rapport DGDG:MGDG de ces membranes. Nous suggérons que le DGDG accumulé en sécheresse est exporté vers les membranes extrachloroplastiques et que cela contribue à la tolérance à la contrainte hydrique. Les effets de la perte d’eau cellulaire sur les membranes ont des conséquences directes sur la capacité des plantes à reprendre après réhydratation. 48 heures après réarrosage, le cv. sensible 1183 n’est pas capable de récupérer en termes de teneurs en galactolipides et incorporation de précurseur. Chez le cv. tolérant, par contre, la teneur en DGDG demeure élevé, même après réhydratation. En conclusion, nos résultats suggèrent l’importance des lipides membranaires dans la tolérance/sensibilité des plantes au déficit hydrique, en particulier la balance entre des classes lipidiques de propriétés physico-chimiques différentes (SQDG versus PG et DGDG versus MGDG) qui pourraient affecter la structure et le fonctionnement des membranes / Membranes are main targets of degradation by reactive oxygen species and hydrolytic activities induced by drought. Chloroplasts lipid biosynthesis, especially galactolipids monogalactosyl-diacylglycerol (MGDG) and digalactosyl-diacylglycerol (DGDG) are important for plant tolerance to water deficit and for recovery after rehydration. In this thesis, we studied the metabolism of the chloroplast membrane lipids, MGDG, DGDG, sulphoquinovosyl-diacylglycerol (SQDG), phosphatidyl-glycerol (PG) under drought and during recovery from drought. Aiming this, we measured leaf lipids content, followed 14Cacétate incorporation and expression of genes coding for chloroplast membrane lipid synthases (MGD1, MGD2, DGD1, DGD2, SQD2 and PGP1) during drought and recovery. In order to better understand the relationship between drought tolerance and lipid metabolism, two cultivars of Vigna unguiculata L. Walp, one drought tolerant (cv. EPACE) the other drought susceptible (cv. 1183) were compared. The cDNA complete sequences for VuMGD1, VuMGD2, VuDGD1, VuDGD2, VuSQD2 and VuPGP1 were obtained from screening of a V.unguiculata cDNA library. The results showed that under water stress conditions, the tolerant cultivar, besides its ability to preserve its lipids pool despites drought, is able to strongly stimulate the DGDG biosynthesis, increasing the DGDG:MGDG ratio in its membranes. We suggest that DGDG accumulated under drought condition, when phosphate is deficient, is exported for extrachloroplastic membranes, and thus contributes to plant drought tolerance. Effects of loss of water on cell membranes have direct consequences on plant capacity to recover from stress. 48 hours after rewatering, the susceptible cv. 1183 was not able to fully recover from a moderate stress in terms of leaf galactolipid content and acetate incorporation into MGDG. In EPACE-1, MGDG leaf content remained unchanged after rehydration and DGDG remained higher than in the control plants. In conclusion, our results highlight the importance of membrane lipids in plant adaptation to water deficit and in their capacity to recover from stress. Of particular importance is the balance between lipid classes with various physico-chemical properties (SQDG versus PG, DGDG versus MGDG), since they most likely have a profound influence on membrane structure and function

Les chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) des protéoglycanes (PGs) jouent un rôle majeur dans la régulation de multiples événements cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus. Des perturbations de la synthèse des GAGs sont impliquées dans des pathologies d'origine dégénérative, tumorale et génétique, tel que le syndrome progéroïde d'Ehlers-Danlos (ED). Ce déficit résulte de mutations de la [bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([bêta]4GalT7) humaine associées à des atteintes sévères du système musculo-squelettique. En effet, cette enzyme catalyse une étape essentielle de l?initiation de la synthèse des GAGs à partir de la protéine "core" des PGs et de xylosides exogènes. Notre travail a porté sur l'étude structure-fonction de la [bêta]4GalT7 recombinante humaine. Nous avons associé des approches in vitro et ex vivo afin d?explorer le rôle des acides aminés des motifs 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 et 257HLH259, strictement conservés au sein des [bêta]4GalTs. L'étude des conséquences de mutations systématiques sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [bêta]4GalT7 recombinante a permis d'identifier des acides aminés essentiels du site actif. Nous avons montré que les résidus D165 et H257 forment des liaisons de coordination avec le cation Mn2+ et proposé le rôle du résidu D228 dans la catalyse. Nous avons mis en évidence un rôle central du résidu W224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nous avons également établi les bases moléculaires des mutations de la [bêta]4GalT7 associées au syndrome ED. Enfin, l'étude de mécanismes de régulation épigénétique des voies de biosynthèse des GAGs dans les cellules H-EMC-SS de chondrosarcome humain a mis en évidence une hyperméthylation spécifique des gènes de la famille des 3-O-sulfotransférases, associée à un phénotype invasif. L'ensemble de ce travail ouvre des perspectives vers de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des arthropathies / Proteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan chains (GAGs), play a major role in the architecture of extracellular matrices and are implicated in numerous cell events. The impairment of GAG synthesis and sulfation is involved in degenerative, tumor and genetic diseases, such as the progeroid form of Ehlers-Danlos (ED) syndrome. This inherited disorder is due to mutations of human [bêta]4GalT7 ([bêta]4GalT7) causing a defect in GAG synthesis, associated with severe musculo-skeletal alterations. Indeed, this enzyme catalyzes a key step in GAG synthesis linked to the core protein of PGs and from exogenous xylosides. Our work has been focused on the structural and functional characterization of human recombinant [bêta]4GalT7 enzyme. We combined in vitro and ex vivo approaches to explore the role of amino acids located in 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 and 257HLH259 motifs, which are highly conserved within [bêta]4GalTs. The study of the consequences of site-directed mutations on kinetic and functional properties of the [bêta]4GalT7 enzyme allowed us to identify key active site amino acids. Our results indicate that D165 and H257 residues form coordination bonds with Mn2+ divalent cations. Furthermore, we suggested a catalytic role for D228 residue and highlighted a central role of W224 residue via interactions with the donor and acceptor substrates. We also determined the molecular basis of [bêta]4GalT7 mutations associated with ED syndrome. Finally, the study of epigenetic regulation mechanisms by DNA methylation of GAG biosynthesis in human chondrosarcoma cells (H-EMC-SS) revealed the specific hypermethylation of the 3-O-sulfotransferase gene family, associated with the invasive phenotype of these cells. Together, this work paves the way towards innovative strategies in the treatment of arthropathies

Les bases fondamentales de la biologie suggèrent que tous les organismes actuels partagent un dernier ancêtre commun, le cenancêtre. Dès que la comparaison moléculaire des organismes des trois domaines du vivant (archées, bactéries et eucaryotes) est devenue possible, d’importants débats ont émergé sur l’habitat du cenancêtre, son rapprochement des origines de la vie, sa nature unique ou communautaire et ses relations avec les trois domaines du vivant. Cependant, jusqu’à il y a peu les informations disponibles sur les organismes modernes n’étaient pas suffisantes pour décrire précisément sa biologie. Notamment, la découverte chez les archées de membranes dont les composants principaux, les phospholipides, sont synthétisés par des mécanismes très différents de ceux des bactéries et les eucaryotes a conduit à proposer que chaque mécanisme de synthèse des phospholipides soit apparu indépendamment dans les lignées modernes. Dans ces hypothèses le cenancêtre aurait été dépourvu de phospholipides et, donc, de membranes. Cela met en cause la nature cellulaire du cenancêtre, qui semblait pourtant soutenue par d’autres indices indirects. Ces contradictions posent la question de l’existence de traces dans les organismes modernes d’une synthèse des phospholipides chez le cenancêtre. Dans cette thèse j’ai profité de l’explosion récente des données génomiques pour répondre à cette question. Il avait déjà montré que des membres de deux superfamilles protéiques universelles pouvaient avoir synthétisé de façon non spécifique chez le cenancêtre les énantiomères de glycérol phosphate servant d’ossature aux phospholipides. Les phospholipides archéens sont composés d’isoprénoïdes et les bactériens et eucaryotes d’acides gras. J’ai donc étudié l’évolution des voies de synthèse de ces molécules ainsi que celle de l’assemblage de tous les composants dans des phospholipides. Mes résultats montrent que la voie de synthèse des isoprénoïdes des eucaryotes et une voie hypothétique de synthèse des acides gras chez les archées avaient probablement des ancêtres moins spécifiques chez le cenancêtre. Une partie au moins de la machinerie d’assemblage des phospholipides semble aussi avoir été présente chez le cenancêtre.Ceci suggère que le cenancêtre avait probablement des mécanismes peu spécifiques de synthèse des phospholipides et que les différences entre les membranes actuelles sont dues à la spécialisation de la machinerie ancestrale dans chaque lignée. Mes observations soulignent aussi l’importance d’étudier le cenancêtre à partir des informations issues des organismes actuels pour éviter toute confusion avec les origines de la vie. / The main bases of Biology suggest that all extant organisms share a last common ancestor, namely the cenancestor. As soon as the comparison of molecular characters of organisms representative of the whole diversity of life became possible, hot debates emerged about the environmental conditions in which the cenancestor lived, its closeness to the origins of life, its single or community nature and its relationships with the three domains of life (Archaea, Bacteria and Eucarya). However, available information about current organisms was for a long time inadequate to precisely describe the biology of this organism. For instance, the observation that the main archaeal membrane components, called phospholipids, are synthesized by different means than their bacterial/eukaryotic counterparts was proposed to reveal that modern phospholipid biosynthesis pathways emerged late in independent lineages and were, therefore, absent in the cenancestor. This hypothesis argued that the cenancestor had no lipid membranes, so it could not be a cellular organism although other indirect clues indicated the opposite. These contradictions raise the question of the presence in modern organisms of traces that the cenancestor had a phospholipid biosynthesis machinery.In this dissertation, I took advantage from the recent accumulation of genomic data to address this issue. Previous work had shown that the members of two universal protein superfamilies could be present in the cenancestor to carry out the non-specific synthesis of the glycerol phosphate enantiomers that are the backbones of modern phospholipids. Bacterial and eukaryotic phospholipids use fatty acids whereas archaeal phospholipids are made up of isoprenoids. Thus, I studied the evolution of the metabolic pathways that synthesize these molecules and build up the phospholipids from their components. My results show that the eukaryotic isoprenoid biosynthesis pathway and a hypothetical archaeal fatty acid biosynthesis pathway are likely to have had less specific ancestors in the cenancestor. In addition, the phospholipid assembly machinery was also probably present in the cenancestor.These results suggest that the cenancestor was likely able to enzymatically synthesize its phospholipids by means less specific than modern ones. Dissimilarities in modern membrane phospholipids would result from the specialization of each biosynthesis system in each lineage. My work also stresses the fact that the cenancestor should be described on the basis of the comparison of modern organisms to avoid frequent confusions between the cenancestor and the origins of life.

Le groupe Substances Naturelles Marines du LCMBA (UMR 6001 CNRS-UNSA) se consacre à l'isolement et à la caractérisation de nouvelles molécules bioactives à partir d'invertébrés marins (spongiaires et cnidaires principalement). Suivant l'intérêt que ces molécules originales suscitent, leur valorisation peut concerner autant le domaine de la pharmaceutique que celui de la biosynthèse ou de l'écologie chimique. Ce manuscrit présente les travaux de recherche réalisés sur les deux éponges Pandaros acanthifolium et Agelas oroides, et sur les deux cnidaires Astroides calycularis et Parazoanthus axinellae. P. acanthifolium, très peu étudié, a permis l'isolement d'une nouvelle famille de saponines stéroïdiennes. La famille des orthidines et une nouvelle aplysinopsine, ont été isolées pour la première fois d'A. calycularis. Enfin, nous décrivons une nouvelle famille d'alcaloïdes isolée de P. axinellae qui nous a permis de distinguer deux morphotypes de P. axinellae d'après leurs profils chimiques. A. oroides a été choisi comme modèle d'étude pour la mise en place d'un nouveau protocole de biosynthèse in vivo des alcaloïdes de type pyrrole-2-aminoimidazoles (P2AI). Ces études permettent de confirmer l'utilisation de la proline dans la biosynthèse des P2AI.

Peu d'enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l'identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l'analyse de l'expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l'analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d'une rose parfumée à ceux d'une rose non parfumée a permis de corréler l'expression d'un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d'un rosier dont l'expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l'allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l'émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L'absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l'isoforme dans les cellules

Catharanthus roseus est une plante médicinale produisant divers types d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt en santé humaine. Ainsi, les AIM dimères comme la vinblastine et la vincristine sont utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et les alcaloïdes monomères de type hétéroyohimbine présentent diverses activités pharmacologiques. La fabrication de ces molécules dans la plante est fort complexe. Elle requiert un haut niveau de compartimentation tissulaire et subcellulaire et met en jeu plus d’une trentaine d’étapes enzymatiques, dont certaines sont encore très mal connues. Dans ce contexte, l’objectif de la thèse a consisté à élucider plusieurs étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse des AIM. Nos travaux ont permis de caractériser de nouvelles isoformes enzymatiques de la famille des cytochromes P450 ainsi que les réductases qui leur sont associées. Ils ont abouti à l’identification de nouvelles déshydrogénases et mis en évidence, in planta, leurs interactions avec la strictosidine synthase suggérant une biosynthèse orientée vers les divers alcaloïdes de type hétéroyohimbine. Enfin, en ayant recours à l’ingénierie métabolique, un segment de la voie de biosynthèse a été transféré dans la levure Saccharomyces cerevisiae, lui conférant la capacité de bio-transformer la tabersonine en vindoline, l’un des deux précurseurs finaux des alcaloïdes dimères. / Catharanthus roseus is a medicinal plant producing various types of monoterpene indole alkaloids (MIA) with a great interest in human health. Dimeric alkaloids such as vinblastine and vincristine are used in cancer chemotherapy and monomeric heteroyohimbine alkaloids exhibit various pharmacological activities. The production of these molecules in the plant is very complex. It requires a high level of tissular and subcellular compartmentalization and involves more than thirty enzymatic steps, some of which are largely unknown. In this context, the aim of this thesis was to elucidate several enzymatic steps of the MIA biosynthetic pathway. Our work allowed us to characterize new enzyme isoforms of cytochrome P450 and their associated reductases. They also resulted in the identification of new dehydrogenases and highlighted their interactions with the strictosidine synthase suggesting a directed biosynthesis towards various heteroyohimbine type of alkaloids. Finally, engineered yeast containing a segment of the MIA biosynthetic pathway was able to convert tabersonine into vindoline, one of the two final precursors of the dimeric alkaloids.

Les composés de type pyrrocidine sont des polykétides PKS-NRPS possédant des activités biologiques intéressantes comme antifongique ou antibiotique. La synthèse totale de ces composés est un réél challenge comme il est constitué de 10 centres chiraux et d'un macrocycle complexe. L'étude de leur biosynthèse pourrait être d'une aide importante afin de comprendre le mécanisme de formation de cette structure spéciale, et en particulier l'étape de la cyclisation complexe.Le précurseur linéaire de ces polykétides étant composé par une chaine nonakétide (partie PKS) et d'une L-tyrosine (partie NRPS), des hypothèses sur leur biosynthèse ont été émises dans cette thèse. Des expériences d'incorporation de précurseurs marqués ou non vont être réalisées dans différents milieux de culture en vue d'obtenir des informations sur cette biosynthèse, et plus précisément le passage du précurseur linéaire vers la structure polycyclique complexe. En parallèle, des supplémentations des cultures d'A. zeae avec des dérivés de la tyrosine seront faites dans le but d'obtenir des analogues pouvant avoir des activités biologiques nouvelles ou meilleures que les pyrrocidines. / Pyrrocidine and its related compounds are PKS-NRPS polyketides having biological interests such as antifungal or antibiotic activities. The total synthesis of these entities has been challenging since the family of hirsutellone is composed by 10 chiral centers and a complex macrocycle. Studying the biosynthesis of these compounds can be an asset for the comprehension of this special molecular structure, especially for the complex cyclization step. Knowing that the linear precursor of these molecules is constituted by a nonaketide chain (PKS part) and by an L-tyrosine (NRPS part), hypotheses about the biosynthesis of hirsutellone-related compounds have been developed in this thesis. Some incorporation experiments of labeled or unlabeled compounds has been done in different culture media in order to have more information about this biosynthesis, in particular the conversion of the linear precursor into this complex polycyclic structure. In parallel, the supplementation of L-tyrosine derivatives will help us to get some analogs of pyrrocidine which can have new or better activities than natural products.

Ki-67 maintient l'hétérochromatine constitutive lors de la prolifération cellulaire. La protéine Ki-67 est fortement exprimée dans le noyau des cellules de mammifères en prolifération. Sa présence est devenue un marqueur de référence en histopathologie diagnostic dans le cancer avec 330 millions de références sur des sites Internet et plus de 18 000 articles indexés avec le mot clé Ki-67 dans PubMed. Malgré son utilisation comme référence incontestable de la prolifération cellulaire, les rôles fonctionnels, les régulations et les mécanismes moléculaires où Ki-67 est impliquée demeurent obscurs. Depuis l'identification de Ki-67 en 1983, les différentes études avec l'utilisation d'outils moléculaires (anticorps, oligonucléotide antisens, shRNA, siRNA) qui inhibent l'expression de Ki-67 dans des cellules cancéreuses de tous types ont mis en évidence une forte régression à leur prolifération. La localisation prédominate de Ki-67 est dans le nucléole, son inactivation photodynamique abroge la transcription de l'ARN ribosomal qui est requis pour la prolifération cellulaire. Le consensus est que Ki-67 favorise la prolifération cellulaire, mais à ce jour aucune étude n'a mis en évidence ni un mécanisme d'action, ni un rôle essentiel de Ki-67 dans la prolifération cellulaire in vivo. Dans notre travail, nous abordons la question du rôle de Ki-67 dans les cellules humaines cancéreuses non transformées en culture ainsi qu'in vivo chez la souris. Nous avons montré que Ki-67 n'est pas nécessaire pour la prolifération cellulaire. En revanche, Ki-67 est indispensable pour maintenir la structure de l'hétérochromatine constitutive. Nous avons mis en évidence des nouveaux mécanismes de régulation de l'expression de Ki-67 au cours du cycle cellulaire, sa transcription étant contrôlé par CDK4/6 via la phosphorylation de la protéine rétinoblastome, et sa dégradation en G1 tardive via APC/C-Cdh1. Après extinction de l'expression de Ki-67 par ARNi ou par ablation du gène de Ki-67 par la nouvelle approche TALEN, nous n'avons observé aucun effet sur la synthèse de l'ARN ribosomique, sur le déroulement normal du cycle cellulaire, sur le développement embryonnaire ou la fertilité de la souris. Par contre, son extinction inhibe la progression des tumeurs dans des modèles de Xénogreffes, et induit un remodelage du paysage de l'expression de certain gènes. Notre étude par protéomique des protéines interragissant avec Ki-67 a identifié des protéines nucléolaires à l'interface entre l'hétérochromatine périnucléolaires et les composants granulaires nucléolaires. Ces complexes protéiques empêchent la dispersion de l'hétérochromatine constitutive au cours du cycle cellulaire. Au vu de nos résultats, nous concluons que dans les cellules non-proliférantes l'anémie de Ki-67 est associée à la diffusion de l'hétérochromatine constitutive. Ki-67 est indispensable à la maintenance de cette hétérochromatine qui serait essentielle pour le développement des tumeurs. / Ki-67 links constitutive heterochromatin maintenance to cell proliferation.Ubiquitous nuclear expression of Ki-67 in proliferating mammalian cells has led to its use as a benchmark diagnostic marker for cell proliferation, especially in cancer histopathology. Its importance is reflected by over 330 million hits when searching using the keyword “Ki-67” on Google, and over 18,000 papers on PubMed. In spite of its use as a surrogate marker for cell proliferation, the mechanisms of regulation of Ki-67 expression and its physiological functions in cell proliferation remain obscure. Early functional studies found that inhibition of Ki-67 expression by injection of antisense oligonucleotides or inactivating antibodies into cultured cancer cells inhibited cell proliferation. This is in agreement with later results obtained by peptide-nucleic acid, antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA experiments in various cancer cell lines. Photodynamic inactivation of Ki-67 abrogates ribosomal RNA transcription, consistent with its predominantly nucleolar localisation and apparent requirement for cell proliferation. However, a recent study in HeLa cells found only minor effects on the cell cycle distribution upon Ki-67 knockdown. Nevertheless, Ki-67 is required for localising several nucleolar proteins to the mitotic chromosome periphery, potentially providing a mechanism for nucleolar assembly, as previously suggested by segregating nucleolar components upon cell division and chromosome segregation. Therefore, although the consensus is that Ki-67 promotes cell proliferation, this has not been clearly demonstrated, and no studies have ascertained requirements for Ki-67 in vivo.In this work, we address these questions in non-transformed human cells and cancer cells in culture and in vivo in mice. We have shown that Ki-67 is dispensable for cell proliferation but is required to maintain constitutive heterochromatin. We found that Ki-67 expression is cell cycle-dependent due to dynamic control by CDK4/6 and Cdh1. However, silencing of Ki-67 by RNAi or a TALEN-mediated Ki-67 gene ablation had no effect on ribosomal RNA synthesis, cell cycling, mouse development or fertility, but prevented tumour progression and led to remodelling of the gene expression landscape in cycling cells. Interaction proteomics and functional assays revealed that Ki-67 defines the boundary between perinucleolar heterochromatin and the nucleolar granular components, and prevents dispersal of constitutive heterochromatin during cell cycling. Conversely, Ki-67 downregulation in non-proliferating cells is associated with constitutive heterochromatin dispersal. The results suggest that Ki-67 mediates organisation of heterochromatin, and allows efficient tumour progression.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) possèdent deux propriétés fondamentales : l'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en lignées hématopoïétiques de tout type. Les CSH se maintiennent dans la moelle osseuse et se renouvellent par division asymétrique. En revanche, les divisions symétriques caractérisent les cellules qui s'engagent dans la différenciation. L'environnement pauvre en oxygène de la moelle osseuse favorise la glycolyse anaérobique et l'oxydation des acides gras, préservant, respectivement, la quiescence et les divisions asymétriques. Que l'engagement des CSH vers la différenciation lymphoïde, myéloïde ou érythroïde dépende ou entraîne une reprogrammation métabolique n'est toujours pas connu. En effet, de nombreuses études ont montré que cytokines et contacts cellulaires sont indispensables pour l'engagement des CSH vers une lignée donnée, alors que l'impact potentiel des nutriments et du métabolisme sur ce processus reste très peu étudié. La différenciation est associée à une prolifération qui nécessite des besoins métaboliques accrus pouvant être supportés par diverses sources d'énergie, telles que le glucose, les acides gras, le lactate ou la glutamine. Le glucose et la glutamine sont des précurseurs de l'ATP, des lipides et des nucléotides. Toutefois, leurs contributions relatives aux voies métaboliques contrôlant l'engagement des CSH n'ont pas été évaluées. Pour autant, nos études ainsi que celles menées par d'autres laboratoires ont montré que l'expression du transporteur de glucose Glut1 n'augmente qu'au cours des dernières étapes de la différenciation érythroïde, suggérant l'implication potentiel d'autres nutriments dans la régulation des étapes précoces de l'engagement vers la voie érythroïde. Ainsi, mon travail de thèse a consisté à déterminer si la disponibilité et l'utilisation des nutriments régulent la différenciation des CSH vers la lignée érythroïde. De fait, j'ai montré que le transporteur de glutamine ASCT2 est hautement exprimé dans les CSH et que la répression d'ASCT2 ou le blocage du métabolisme de la glutamine empêche la différenciation érythroïde des CSH, les détournant vers la voie myéloïde, même en présence d'érythropoïétine. Dans ces conditions, nous avons montré que la différenciation érythroïde ne pouvait pas être restaurée par l'ajout d'intermédiaires du cycle de Krebs, alors que qu'elle était dépendante de la biosynthèse de novo de nucléotides. Étonnamment, le 2-désoxyglucose (2-DG), un analogue du glucose inhibant la glycolyse, accélérait l'érythropoïèse. Nous avons aussi mis en évidence in vivo, en condition de stress érythropoïétique, des influences différentes du catabolisme de la glutamine et celui du glucose dans la modulation de l'érythropoïèse. Afin de mieux élucider les mécanismes par lesquels la glutamine module la différenciation érythroïde des CSH, nous avons étudié les voies métaboliques qu'elle emprunte. Des expériences de suivi de la glutamine marquée ont montré que l'entrée de la glutamine dans le cycle de Krebs est requise pour une érythropoïèse efficace. Par contre, nous avons montré que la synthèse de novo des nucléotides était l'étape limitante de la différenciation érythroïde. De plus, nous avons observé que la différenciation érythroïde accélérée en présence du 2-DG était associée à une augmentation importante du niveau des pentoses phosphates, précurseurs des nucléotides. Ainsi, l'utilisation de la voie des pentoses phosphates par le glucose, plutôt que la glycolyse, était essentielle pour l'érythropoïèse. En conclusion, mon travail de thèse a montré que la production de nucléotides via le métabolisme coordonné du glucose et de la glutamine est la condition sine qua non pour l'engagement des CSH vers la lignée érythroïde. / Hematopoietic stem cells (HSCs) possess two fundamental characteristics; self-renewal capacity and the ability to give rise to all blood cell lineages. Before their commitment to a specific lineage, these cells are maintained in a quiescent state in the bone marrow. Asymmetric division is essential for the maintenance of the stem cell compartment while symmetric division results in HSC differentiation. The hypoxic environment of the bone marrow is conducive to anaerobic glycolysis and fatty acid oxidation, preserving stem cell quiescence and asymmetric division, respectively. However, it is not known whether the commitment of an HSC to a lymphoid, myeloid or erythroid lineage fate, is regulated by a metabolic switch. Indeed, while much research has shown a critical role for cytokines and cell-cell contacts in the commitment of HSCs to distinct hematopoietic lineages, the possibility that nutrient entry and metabolism may contribute to this process was not considered until very recently. Cell differentiation is associated with proliferation resulting in increased metabolic requirements that can be met by energy sources such as glucose, fatty acids, lactate, or glutamine, amongst others. While glucose and glutamine are both precursors for the production of ATP, lipids and nucleotides, their relative contributions to metabolic pathways driving HSC lineage commitment have not been evaluated. Interestingly, we and others previously found that the Glut1 glucose transporter is highly upregulated only during the final mitoses of HSC-driven erythroid differentiation, suggesting that other nutrients may regulate early stages of erythroid lineage commitment. During my PhD, I was interested in determining whether nutrient availability and utilization regulate HSC differentiation to the erythroid lineage. Interestingly, I found that the ASCT2 glutamine transporter is expressed at high levels on HSCs. Downregulation of ASCT2 or blocking glutamine metabolism abrogated erythroid differentiation of HSCs and diverted erythropoietin-signaled HSCs towards a myeloid fate. Under conditions where glutamine utilization was blocked, erythroid differentiation was not restored by directly replenishing the tricarboxylic acid cycle but rather, was dependent on de novo nucleotide biosynthesis. Surprisingly, 2-deoxyglucose, a glucose analogue that inhibits glycolysis, enhanced erythropoiesis. Glutamine and glucose catabolism also differentially modulated erythropoiesis in vivo, under stress conditions. To better elucidate the mechanism(s) via which glutamine supports the erythroid lineage specification of HSCs, we evaluated the metabolic pathways fueled by glutamine. Carbon/nitrogen-labeled glutamine tracing experiments showed that the rate-limiting step in EPO-induced erythroid differentiation is glutamine-dependent de novo nucleotide biosynthesis while glutamine entry into the TCA cycle (anaplerosis) is not required. Furthermore, the accelerated erythroid differentiation in the presence of 2-DG was associated with a striking increase in pentose phosphates, precursors of nucleotides. Notably, the shunting of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP), rather than glycolysis, was essential for erythropoiesis. In conclusion, my research shows that the coordinated redirection of glucose and glutamine into the production of nucleotides is the sine qua non condition for the erythroid differentiation of HSCs.