Generalment el Càncer d’Endometri (EC) s’associa a bon pronòstic, no obstant el 20% dels EC associats a bon pronòstic recidiven. El propòsit d’aquesta tesi ha estat l’estudi de les principals diferències en l’expressió de gens implicats en el desenvolupament i progressió del CE i que estan relacionats amb la hipòxia, l’apoptosi i l’adaptació a la radioteràpia mitjançant la Immunohistoquímica i els Arrays matricials de teixit en CE primaris i recidives post radioteràpia. Les recidives presenten valors més elevats de p53, HIF-1α, FLIP, Ki67, p50, c-REL, Rel B i β-catenina. La hipòxia activa tant la via NF-κB canònica com l’alternativa i tant la cinasa IKKα com IKKβ són necessàries per l’acumulació de RelA (p65) i p100, mentre que el processament de p52 depèn de IKKα. La hipòxia també indueix l’expressió nuclear de HIF-1α, FLIP, β-catenina i l’augment de l’activitat de via NF-κB, en canvi això no s’observa quan la línia cel•lular Ishikawa es sotmet a radiació. Per la seva banda, ANXA2 juga un paper en promoure el procés de metàstasi en el EC i és un marcador predictiu de recidiva també en els EC de risc baix-intermedi. La classificació histològica del EC pot ser difícil en alguns carcinomes d’alt grau o mixtes. Per aquest motiu també hem determinat una firma de 9 biomarcadors que ajuda a predir el tipus histològic en el EC. / Generalmente el Cáncer de Endometrio (EC) se asocia a buen pronóstico, sin embargo el 20% de los EC asociados a buen pronóstico recidivan. El propósito esta tesis doctoral ha sido el estudio de las principales diferencias en la expresión de genes implicados en el EC y que están relacionados con la hipoxia, la apoptosis i la adaptación a la radioterapia mediante la Inmunohistoquímica y los Arrays matriciales de tejido en EC primarios y recidivas post radioterapia. Las recidivas presentan valores más elevados de p53, HIF-1α, FLIP, ki 67, p50, c-REL, Rel B y β-catenina. La hipoxia activa tanto la vía NF-κB canónica como la alternativa y tanto la cinasa IKKα como IKKβ son necesarias para la acumulación de RelA (p65) y p100, mientras que el procesamiento de p52 depende de IKKα. Además, la hipoxia induce la expresión nuclear de HIF-1α, FLIP, β-catenina y el aumento de la actividad de NF-κB aunque dichos cambios no se observan cuando la línea celular Ishikawa se somete a radiación. Por otro lado ANXA2 juega un papel en la promoción del proceso de metástasis en el EC y es un marcador predictivo de recidiva incluso en los EC de riesgo bajo-intermedio. La clasificación histológica del EC puede ser difícil en algunos carcinomas de alto grado o mixtos. Por ese motivo también hemos querido determinar una firma de biomarcadores que ayude a predecir el tipo histológico en el EC. / Endometrial Cancer (EC) is usually associated with good prognosis. However, 20% of the EC associated with good prognosis have recurrent disease. The aim of this work was the study of the expression of relevant genes involved in development, progression and recurrence of EC and those involved in resistance to apoptosis, hypoxia and adaptation to radiation, using Immunohistochemistry and Tissue Micro Arrays in primary EC and post radiation recurrences. Post radiation recurrences showed higher p53, HIF-1α, FLIP, Ki67, p50, c-REL, Rel B and β-catenin expression values. Hypoxia activates not only canonical NF-ΚB molecular pathway but also the alternative and both IKKα and IKKβ are necessary to RelA (p65) and p100 accumulation whereas p52 processing is IKKα dependent. Additionally, hypoxia induced nuclear expression of HIF-1α, FLIP, β-catenin and increased NF-κB activity. However, these changes were not observed when Ishikawa cell line was subjected to radiation. ANXA2 plays a role in promoting metastasis in EC and is a predictive biomarker of recurrent disease also among low-intermediate risk EC. Histological typing is difficult in some high grade or mixed endometrioid-non endometrioid EC. For this reason we have assessed an internally and externally 9-biomarker signature to predict histological type in EC.

- Introducció Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by early synaptic and late neuronal loss, affecting more than 26 million people worldwide. Among patients affected with dementia, more than half suffer from Alzheimer’s disease. The biggest risk factor for developing Alzheimer's disease is age. β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary p-Tau tangles accumulates in the brains of elderly patients playing a central role in the pathogenesis of AD. During the last years the fruit fly, Drosophila melanogaster has increasingly been used as a model for neurodegenerative disease. Although the adult fly has a simpler nervous system than those of vertebrates, it is capable of higher-order brain functions, including aversive and appetitive learning, and recalling learned information from prior experiences. - Contingut de la investigació This work has been focused on modeling Alzheimer's Disease in Drosophila by expressing two human genes associated with AD (Aβ42 and Tau) in the fly central nervous system. This model displays AD-like neuropathological as well as behavioral symptoms. The main goal of developing such a model is to analyse and study the effect of new synthetic fatty acids molecules in the pathogenesis of AD. Additionally, the model organisms established in this study could provide tools that help to understand disease-specific processes resulting in neuronal loss. This study argues that Drosophila can be used to study the behavioural basis of human neurodegenerative diseases and may provide a model to identify novel therapeutic avenues for neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease. In this work also was studied the effect of membrane lipid therapy on cognitive decline of a transgenic model of Drosophila. This model overexpresses the human amyloid peptide of 42 amino acids (Aβ42), and human Tau protein that play a key role in the development of this disease. - Conclusió The treatment has been based on the use of DHA and its hydroxylated derivate OHDHA, ARA and its hydroxylated form OHARA and EPA and its hydroxylated form OHEPA at 1, 3, 10, 30, 100 and 250 μg/ml of standard food. After testing the transgenes expression in the F1 generation by PCR analysis and Western blot it was evaluated the toxicity of the compounds, and it was demonstrated that food supplementation with OHDHA, OHARA, OHEPA partially restored the loss of locomotor activity and increased the life-span of the flies expressing the human transgenes whereas the DHA, ARA, EPA, form had not significant effects. It has been observed that the concentrations of 30 and 100 μg/ml of hydroxylated form, including the mixtures of (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA), and 30 μg/ml of TGMs, LP183A1, LP183A2, was used, have led to cognitive improvement and have maintained or increased the lifespan with respect to the control group. In addition it was analyzed the lipid content from Drosophila heads by using gas chromatography and it was found that the food supplementation with either hydroxylated or non-hydroxylated compounds induced changes in the fatty acid profile of Drosophila. Furthermore it was discovered that the amount of short chain fatty acids (SCFA), from the heads of F1 treated with ARA, EPA and DHA was less than that from untreated F1 flies. Concerning the hydroxylated fatty acids, the reduction in the levels of short chain fatty acid (SCFA) was similar to that of the non-hydroxylated fatty acids. All food supplement tested induced an increase of long chain fatty acids (≥ 18C). ARA, EPA and DHA were present in the fatty acid profile of flies treated with the respective non-hydroxylated food supplements. This fact proves the absorption and incorporation of dietary PUFAs into the Drosophila body tissues. / - Introducció La enfermedad de Alzheimer (AD, del inglés Alzheimer's disease) es una patología neurodegenerativa caracterizada por una pérdida temprana de conexiones sinápticas y, de manera tardía, de neuronas. Esta enfermedad afecta a unos 40 millones de personas en todo el mundo. Entre las personas con demencia, más de la mitad sufren AD. El mayor riesgo para desarrollar la enfermedad de Alzheimer es la edad. De hecho, las placas β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares de fosfo-Tau se acumulan en los cerebros de pacientes ancianos, jugando un papel central en la patogénesis de AD. Además, se han encontrado reducciones significativas en los niveles de los lípidos fosfatidiletanolamina y ácido docosahexaenoico (DHA) en el cerebro de pacientes con AD. Durante la última década, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) se ha utilizado como modelo para enfermedades neurodegenerativas, debido a que puede ser utilizada para el análisis de conductas como el aprendizaje aversivo y apetitivo, así como su capacidad de utilizar la información aprendida de previas experiencias, aunque la mosca adulta presenta un sistema nervioso mucho más simple que el de vertebrados. - Contingut de la investigació La presente investigación se centra en la utilización de Drosophila como modelo de AD mediante la sobreexpresión de los genes humanos asociados con AD (Aβ42 y Tau) en el sistema nervioso central de la mosca. El principal objetivo de desarrollar este modelo es analizar y estudiar el efecto de ácidos grasos sintéticos novedosos en la terapia de la AD. Conjuntamente, los organismos modelo establecidos en este trabajo pueden constituir un sistema que permita la comprensión de los procesos específicos de la enfermedad que desencadena la pérdida neuronal. Con todo ello, el presente trabajo demuestra que se puede usar Drosophila para estudiar las bases comportamentales de las enfermedades humanas neurodegenerativas y puede suponer un modelo para identificar nuevas terapias para dichas enfermedades, tales como AD. Además, se ha estudiado el efecto de la terapia lipídica de membrana en el declive cognitivo del modelo transgénico de AD de Drosophila. - Conclusió Los tratamientos empleados se basan en el uso de DHA y su derivado hidroxilado OHDHA, ARA y su forma hidroxilada OHARA y EPA y su forma hidroxilada OHEPA, así como derivados de triacilgliceroles (triacilglicerol miméticos, TGM) a dosis crecientes y añadidos en la comida. Tras confirmar la expresión de los transgenes en la generación F1 de las moscas por PCR y western blot, se analizó la toxicidad de los distintos compuestos y se demostró que la suplementación de comida con OHDHA, OHARA, OHEPA restauró la pérdida de actividad locomotora, parcialmente, además, aumentó la vida media de las moscas expresando los transgenes humanos, mientras que DHA, ARA, EPA no presentaron efectos significativos. Se observó que las concentraciones de 30 y 100 μg/ml de las formas hidroxiladas, incluyendo las mezclas de (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA) y 30 μg/ml de TGMs, LP183A1, LP183A2, mejoraron la capacidad cognitiva y aumentaron la vida media con respecto al grupo control no tratado. También se analizó el contenido lipídico en membranas de la cabeza de moscas mediante cromatografía de gases y se observó que la suplementación de la comida, tanto con los compuestos hidroxilados como los no-hidroxilados estudiados, indujo cambios en el perfil de ácidos grasos de Drosophila melanogaster. Entre ellos, se observó una menor cantidad de ácidos grasos de cadena corta en cabezas de moscas F1 tratadas con ARA, EPA and DHA en comparación con moscas no tratadas. En cuanto a los ácidos grasos hidroxilados, presentaron un nivel similar en la reducción de los niveles de ácidos grasos de cadena corta. Además, todos los suplementos añadidos a la comida indujeron un aumento de los ácidos grasos de cadena larga (≥ 18C). Finalmente, se observó la presencia de ARA, EPA y DHA en el perfil de ácidos grasos de las moscas tratadas con el correspondiente ácido graso no-hidroxilado. Este hecho prueba la absorción e incorporación de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la dieta en los tejidos de la Drosophila.

Les motoneurones espinals requereixen factors neurotròfics per a la seva supervivència i diferenciació. L’efecte fisiològic dels factors neurotròfics és mediat per l’activació de diferents vies de senyalització i factors de transcripció entre els quals es troba la via NF-kB. S’ha relacionat la desregulació de l’activació d’aquesta via amb diferents patologies neuronals. S’ha proposat NF- kB com a diana terapèutica en diferents malalties neurodegeneratives. En el present estudi hem analitzat els mecanismes intracel·lulars involucrats en l’activació de la via NF-kB i la seva implicació en la supervivència de les motoneurones induïda pels factors neurotròfics. Els nostres resultats demostren l’habilitat dels factors neurotròfics de fosforil·lar el complex IKKs a través de l’activació de la via PI3K/Akt i d’induir la translocació nuclear de RelA. Per altra banda, s’ha demostrat que únicament l’activació de la via canónica d’NF-kB té un efecte regulador sobre la supervivència de les motoneurones. El bloqueig de la via canònica causa mort apoptòtica. Aquelles motoneurones que degeneren al inhibir la via es poden rescatar mitjançant la sobre-expressió de la proteïna Bcl-xL o bé inhibint la proteïna Bax. No obstant, els factors neurotròfics també activen la vía no canònica d’NF-kB tot hi que sense implicació en la supervivència. A les motoneurones, la inhibició de la via canònica comporta un augment de la proteïna pro-apoptótica Bim, la disminució de la proteïna Survival Motor Neuron (SMN) i del factor de transcripció CREB. La reducció dels nivells de proteïna SMN causa la malaltia neurodegenerativa hereditària Atròfia Muscular Espinal (AME), que afecta específicament a les motoneurones espinals. En el nostre laboratori hem desenvolupat un model in vitro d’AME. La reducció dels nivells d’SMN causa degeneració neurítica i mort de les motoneurones. Aquests dos processos es poden bloquejar amb la sobreexpressió de la proteïna Bcl-xL. En conclusió, el nostre treball demostra la implicació de la via NF-kB en la supervivència de les motoneurones i aporta nous avenços per a comprendre l’AME. / Las motoneuronas espinales requieren de los factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. El efecto fisiológico de los factores neurotróficos esta mediado por la activación de distintas vías de señalización y factores de transcripción entre los cuales está la vía NF-kB. La desregulación en la activación de esta vía se ha relacionado con distintas patologías neuronales. Se ha propuesto a NF-kB como una diana terapéutica en distintas enfermedades neurodegenerativas. En el presente estudio hemos analizado los mecanismos intracelulares involucrados en la activación de la vía NF-kB y su implicación en la supervivencia de las motoneuronas inducida por los factores neurotróficos. Nuestros resultados demuestran la habilidad de los factores neurotróficos de fosforilar el complejo IKKs a través de la activación de la vía PI3-K/Akt y de inducir la translocación nuclear de RelA. Por otro lado, se ha demostrado que únicamente la activación de la vía canónica de NF-kB tiene un efecto regulador sobre la supervivencia de las motoneuronas. El bloqueo de esta vía induce muerte celular apoptótica. Las motoneuronas que van a degenerar por la inhibición de la vía NF-kB, se pueden rescatar mediante la sobre-expresión de la proteína Bcl-xL o mediante la inhibición de la proteína Bax. Sin embargo, los factores neurotróficos también activan la vía no-canónica de NF-kB aunque sin implicación en la supervivencia. En las motoneuronas, la inhibición de la vía canónica conlleva el aumento de los niveles endógenos de la proteína pro-apoptótica Bim y la reducción de la proteína Survival Motor Neuron (SMN) y del factor de transcripción CREB. La reducción de los niveles de proteína SMN causa la enfermedad neurodegenerativa hereditaria Atrofia Muscular Espinal (AME), que afecta específicamente a las motoneuronas de la médula espinal. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo in vitro de AME. La disminución de los niveles de SMN causa la degeneración de las neuritas y la muerte de las motoneuronas. Estos dos procesos pueden ser bloqueados por sobre-expresión de la proteína Bcl-xL. En conclusión, nuestro trabajo demuestra la implicación de la vía NF-kB en la supervivencia de las motoneuronas y aporta nuevos avances para la comprensión de la AME. / The Spinal cord motoneurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation. The physiological effect of neurotrophic factors is mediated by activation of different signaling pathways and transcription factors including NF-kB. Deregulation in the activation of this pathway has been associated with different neural pathologies. NF-kB has been proposed as a therapeutic target in several neurodegenerative diseases. In this study we analyze the intracellular mechanisms involved in the activation of NF-kB pathway and its involvement in motor neuron survival induced by neurotrophic factors. Our results demonstrate the ability of neurotrophic factors to phosphorylate the IKKs complex through the PI3-K/Akt pathway activation and induce a nuclear translocation of RelA. On the other hand, it has been analysed the involvement of different forms of NF-kB activation pathway on motoneuron survival and the results demonstrate that only the canonical pathway has regulatory effects on the motoneuron survival. The blockade of this pathway induces apoptotic cell death. Motoneurons that will degenerate by inhibition of NF-kB, can be rescued by overexpression of Bcl-xL protein or by inhibiting Bax protein expression. However, neurotrophic factors also activate non-canonical pathway of NF-kB but this pathway does not modulate motoneuron survival. In motoneurons, inhibition of the canonical pathway leads to increased levels of the endogenous pro-apoptotic protein Bim and reduction of the Survival Motor Neuron Protein (SMN) and the transcription factor CREB. Reduced levels of SMN protein cause the hereditary neurodegenerative disease Spinal Muscular Atrophy (SMA), which specifically affects spinal cord motorneurons. In our laboratory, we developed an in vitro model of SMA. The decreased levels of SMN cause neurite degeneration and motorneuron death. These two processes can be blocked by overexpression of Bcl-xL protein. In conclusion, our study shows the involvement of NF-kB in the survival of motor neurons and provides new advances in the understanding of the SMA pathology.

Las neuronas tanto in vivo como in vitro requieren factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. En concreto, las motoneuronas(MNs) responden a diferentes factores neurotróficos, entre los que se encuentran la familia de ligandos del GDNF y la familia de las neurotrofinas. Estas células no sólo sobreviven en presencia de estos factores, sino que la propia actividad neuronal y por consiguiente la despolarización de membrana también promueve su supervivencia, incrementando los niveles de calcio intracelular ([Ca2+]i) y activando diferentes vías de señalización.En este trabajo se estudia el papel del calcio y la calmodulina (CaM) en la regulación de la vía de supervivencia PI3K/PKB, en un modelo de MNs deembrión de pollo tratadas con GDNF. Los resultados obtenidos demuestran que GDNF promueve incrementos moderados en la [Ca2+]i que pueden resultar en la activación de la CaM. El tratamiento con antagonistas de la CaM inhibe laactivación de la Pl3K y PKB in vitro, bloqueando la supervivencia inducida por GDNF. El mecanismo por el cual la CaM ejerce este efecto está pococaracterizado. Tanto la PI-3K como la PKB, proteína que actúa por debajo en la vía de señalización de la PI-3K, son importantes mediando la supervivencia por factores neurotróficos. De hecho, se ha demostrado que GDNF promueve lasupervivencia neuronal a través de la activación de esta vía. Experimentos de inmunoprecipitación demuestran una interacción in vitro entre la subunidad reguladora de la PI-3K y CaM. Esta interacción es independiente de factor neurotrófico, pero se bloquea con el tratamiento con quelantes de calcio como EGTA. De estos resultados se concluye que los cambios producidos en [Ca2+]i inducidos por GDNF, promueven la supervivencia neuronal a través de un mecanismo que implica una regulación directa de la PI-3K por la CaM.Como segundo objetivo de este estudio, analizamos el papel de la quinasa regulada por calcio/CaM la CaMKIV en la supervivencia neuronal. Tras el clonaje y la caracterización de la CaMKIV de pollo (gCaMKIV), demostramos que la forma constitutivamente activa de la gCaMKIV es capaz de fosforilar a PKB, lo que se traduce en la supervivencia de las MNs en ausencia de factoresneurotróficos. Por contra, el bloqueo de la expresión endógena de la gCaMKIV,utilizando RNAs de interferencia, reduce el porcentaje de supervivencia mediado por GDNF y por la despolarización de membrana. Experimentos deinmunoprecipitación han demostrado una interacción in vitro entre la subunidad p85 de la PI-3K y la CaMKIV.En conclusión, se describe por primera vez, como GDNF induce incrementos en [Ca2+]i, activando CaM, que se encuentra unida a la PI-3K. Además, CaMKIV se puede unir a CaM y juntas regular la vía PI-3K/PKB promoviendo la supervivencia. Estos resultados aportan parte de las claves moleculares que regulan la supervivencia de estas neuronas, pudiendo así aplicar estos conocimientos para la comprensión y las posibles estrategias terapeúticas relacionadas con las enfermedades donde hay una degeneración de las MNs. / Neurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation both in vivo and in vitro. In particular, motoneurons respond to a series of neurotrophic factors such as the family of the neurotrophins and the Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) Family Ligands (GFLs). Moderate increases of intracellular calcium concentration induced by either the activation of tropomyosin receptor kinase (Trk) receptor for neurotrophins or by neuronal activity, regulate neuronal survival.In the present report we wanted to establish the role of calcium and calmodulin in the activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-K) pathway by GDNF. Our results demonstrate that GDNF treatment promotes moderate increases of intracelullar calcium concentration by mobilizing this cation from internal stores, resulting in the activation of calmodulin.The effects of [Ca2+]i increase after membrane depolarization are mainly mediated by calmodulin (CaM). We show that CaM antagonists inhibit PI 3-kinase and PKB activation as well as motoneuron survival induced by GDNF. It has been reported that (PI 3-K) and its downstream target protein kinase B (PKB) play a central role in cell survival induced by neurotrophic factors; in fact,GDNF promotes neuronal survival through the activation of the PI 3-kinase/PKB pathway. We also demonstrate that endogenous calcium/CaM associates with the 85-kDa regulatory subunit of PI 3-kinase (p85). This interaction is neurotrophic factor-independent, but it can be abolished with calcium chelators like EGTA.The second part of this work is focused on the analysis of proteins activated by calcium. We wanted to analyze the role of calcium and calmodulinrelated kinase, CaMKIV in cultured motoneurons. This work allowed us to cloneand characterize the Gallus gallus CaMKIV (gCaMKIV). We further demonstrate that the active form of gCaMKIV is able to phosphorylate PKB in the absence of neurotrophic factors and this activation can be blocked by PI3-kinase inhibitors.In addition, the active form of gCaMKIV promotes motoneuron survival in the absence of neurotrophic factors. Moreover, reduction of endogenous levels of CaMKIV by RNA interference results in a decrease of motoneuron survivalinduced by GDNF. A physical interaction between CaMKIV and the PI3-kinase regulatory subunit has been demonstrated by pull-down experiments.In conclusion, this study demonstrates that GDNF is able to promote increases in intracellular calcium concentration that leads to the activation of calmodulin thus regulating PI3-kinase pathway through interaction with p85 subunit. Moreover, CaMKIV is able to interact with calmodulin proposing a suitable model of cooperative effects in the regulation of motoneuron survival pathways.Therefore, these results will contribute to the understanding of the molecular basis for the regulation of MNs survival, thus contributing to the knowledge for prevention of MNs associated neuropathologies.

La identificació dels mecanismes moleculars que regulen la supervivència i mort de les motoneurones representa una informació important per a la comprensió funcional i l'establiment de potencials dianes terapèutiques per a les malalties que cursen amb degeneració i mort d'aquestes neurones. Per aquest motiu hem dedicat aquest treball a:a) L'estudi dels mecanismes intracel·lulars dependents de calci que modulen la supervivència de les motoneurones durant el desenvolupament.Com a efecte inductor de supervivència hem analitzat la participació de la proteïna quinasa dependent de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneurones embrionàries de pollastre, i demostrem que la seva activació calci dependent indueix la fosforilació d'Akt i la supervivència d'aquestes neurones. Per altra banda, com a efecte inductor de mort demostrem que els increments excessius de la concentració del calci intracel·lular induïts per la despolarització de la membrana, són responsables de l'activació de la proteasa Calpaïna i la conseqüent degeneració de les motoneurones de ratolí. Proposem la inhibició de Calpaïna com a mecanisme neuroprotector.b) La generació d'un model in vitro per a l'estudi dels mecanismes patològics que causen la degeneració específica de les motoneurones en Atròfia Muscular Espinal.En aquesta segona part del treball, amb la finalitat de contribuir a la comprensió de la fisiopatologia d'aquesta malaltia hem desenvolupat un model in vitro utilitzant tècniques d'interferència d'RNA. Reduïm l'expressió de la proteïna Survival Motoneuron (SMN) en les motoneurones fins a nivells representatius de la forma severa de la malaltia. L'estudi morfològic i de viabilitat en aquestes cèl·lules ens facilitarà la identificació dels mecanismes moleculars implicats en la malaltia.Els resultats presentats en aquesta tesi impliquen l'activació de CaMKIV en la regulació de la supervivència de les motoneurones; proporcionen nous coneixements sobre les vies de regulació que en provoquen la seva degeneració (nivells de potassi elevats al medi extracel·lular i Calpaïna), i demostren alteracions d'aquestes neurones en un models d'Atròfia Muscular Espinal (degeneració neurítica i mort). / La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y muerte de las motoneuronas representa una información importante de conocimiento básico y para el establecimiento de potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades que cursan con degeneración y muerte de estas neuronas. Por este motivo hemos dedicado este trabajo al estudio de:a) Mecanismos intracelulares básicos dependientes de calcio que modulan la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo.Como efecto inductor de supervivencia hemos analizado la participación de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneuronas embrionarias de pollo, y demostramos que su activación calcio dependiente, induce la fosforilación de Akt y supervivencia de estas neuronas. Por otro lado, como a efecto inductor de muerte demostramos que incrementos de la concentración del calcio intracelular inducidos por la despolarización de la membrana, son responsables de la activación de la proteasa Calpaína y la degeneración de las motoneuronas de ratón. Nuestros resultados apoyan el uso de inhibidores de Calpaína como estrategia neuroprotectora.b) Mecanismos patológicos que causan la degeneración específica de las motoneuronas en Atrofia Muscular Espinal.En esta segunda parte del trabajo, con la finalidad de contribuir a la comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad hemos desarrollado un modelo in Vitro utilizando técnicas de interferencia de RNA. Reducimos la expresión de la proteína Survival Motoneuron (SMN) en las motoneuronas hasta niveles representativos de la forma severa de la enfermedad. El estudio morfológico y de viabilidad en estas células nos facilitará la identificación de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad.Los resultados que presentamos en esta tesis implican la activación de CaMKIV en la regulación de la supervivencia de las motoneuronas; proporcionan nuevos conocimientos sobre las vías de regulación que provocan su degeneración (niveles de potasio elevados al medio extracelular y Calpaína), así como alteraciones específicas de estas neuronas en modelos de Atrofia Muscular Espinal (degeneración neurítica y muerte). / Identification of molecular mechanisms that regulate motoneuron survival and death represent valuable basic knowledge to elucidate potential therapeutic targets for those diseases that imply motoneuron degeneration and death. For this reason in the present work we studied:a) Basic calcium-dependent intracellular mechanisms which modulate motoneuron survival during development.As a pro-survival effect we analysed the role of the calcium/calmodulin dependent protein kinase IV (CaMKIV) in cultured chicken motoneurons. Results demonstrated that CaMKIV activation induces Akt phosphorylation and motoneuron survival. On the other hand, as a prodegenerative effect we demonstrate that in mouse motoneurons depolarization induced excessive calcium influx activates the protease Calpain and causes motoneurons death. Our results suggest that Calpain inhibitors may induce neuroprotective effects.b) Intrinsic motoneuron pathological mechanisms underlying Spinal Muscular Atrophy.In this second part, with the aim to facilitate the understanding of the physiopathology of SMA we developed an in vitro model using RNA interference techniques. We reduce Survival Motoneuron (SMN) protein expression in motoneurons to representative levels from severe Spinal Muscular Atrophy mouse models. Morphologic and survival analysis of these cultured neurons may contribute to the identification of pathologic molecular mechanisms implicated in the disease.Reported results, obtained from the morphological and molecular analysis of primary motoneuron cultures, provide new knowledge on motoneuron development and survival regulating pathways (implication of CaMKIV activation in motoneuron survival regulation), about regulation pathways involved in motoneuron degeneration (high potassium extracellular levels and Calpain activation), as well as motoneuron alterations in a severe SMA culture model (neurite degeneration and death).

En aquest estudi s'ha treballat amb diferents hipòtesis que avui en dia es consideren per explicar les causes de l'Esclerosi Lateral Amiotròfica.En primer lloc, s'ha estudiat la autoimmunitat sèriques (IgG) provinents de malalts d'ELA i d'altres malalties de la Motoneurona (MN). Tractant embrions de pollastre amb sèrums i IgG de pacients afectats per ELA s'obté un rescat significatiu en el nombre de la MN de la banya ventral de la medul·la espinal lumbar que d'altra manera moririen en un procés de mort cel·lular programada per apoptosi i un augment significatiu de la ramificació nerviosa en la musculatura inervada per aquestes MN. S'ha detectat la unió de les IgG a proteïnes del sistema nerviós de l'embrió de pollastre i s'ha identificat com a antígen una proteïna implicada en la regulació i la quimiotaxis del sistema nerviós embrionari, la Semaforina. No sabem, per ara, la significació d'aquests anticossos anti Sema 3A circulants en els pacients de malalts d'ELA ni la seva relació amb la patogènia de la malaltia.En segon lloc, s'ha traballat amb l'aspecte genètic de la malaltia. Utilitzant rosegadors transgènics amb una mutació en el gen de la SOD1 s'ha comprovat que diferents tipus de cèl·lules nervioses d'animals trangènics en estadis avançats de la malatia mostren ractivitat cap a l'anticòs anti P2X4. A part de la reactivitat mostrada en MNs degenerades al còrtex celebral i tronc de l'encèfal d'animals trangènics, fet que concorda amb l'afectació clàssica descrita en la ELA, s'ha vist també reactivitat a cèl·lules de Purkinje cerebelars.Posteriorment s'ha comprovat que aquesta reactivitat és deguda a un reconeixement per part d'aquest anticòs de formes mal plegades de la proteïna SOD1, formes que es van acumulant a mesura que la malaltia avança i que la neurona degenera. Aquestes formes malplegades de SOD1 s'ha comprovat que són capaces de d'activar la microglia in vivo en nivells significativament superiors que la proteöna SOD1 nativa.Per últim, s'ha estudiat l'efecte de la transfecció amb proteïna SOD1 mutada i fenomens autofàgics dins del model de línia cel·lular neuroal NSC-34. Tot i que s'ha comprovat que en aquest model no es repeteixen els resultats obtinguts per l'anticòs anti P2X4 en models de rosegadors transgènics, s'ha pogut estudiar l'autofàgia i l'efecte beneficiós del liti en aquest model, veient-se que el liti és capaç de disminuir el nombre d'agregats de SOD1 en aquest model quan les cèl·lules són transfectades amb diferents tipus de SOD1 mutada.

Desde su descubrimiento a finales de los 90, PTEN se ha convertido en uno de los genes supresores de tumores más importantes que se conocen. Se sitúa entre los 20 supresores tumorales mutados con mayor frecuencia, un fenómeno que llega a ocurrir hasta en el 80% de los casos, en función del tipo de cáncer. Una de las herramientas esenciales para el estudio de la biología de PTEN y su papel en el proceso tumoral es el empleo de modelos animales modificados genéticamente. Su uso permite estudiar los mecanismos moleculares de la enfermedad, pero también la evaluación a nivel preclínico de nuevas terapias y fármacos antineoplásicos. Dado que la deleción en homocigosis del gen resulta letal durante el desarrollo embrionario, el uso de modelos inducibles o específicos de tejido ha supuesto un gran avance en el campo. En la primera parte de este trabajo, se han generado dos nuevos modelos murinos para el estudio de neoplasias sólidas o hematopoyéticas causadas por la pérdida de PTEN. Una vez establecidos los modelos de estudio, se emplearon para evaluar inhibidores con potencial terapéutico sobre este tipo de neoplasia. El primero de éstos fue el inhibidor de mTORC1 Everolimus, el cual mostró efectos beneficiosos sobre tumores de endometrio e hiperplasia de tiroides. Por otro lado, se estudió la respuesta al Sorafenib, un inhibidor multiquinasa, el cual resultó efectivo para el tratamiento de lesiones de tiroides y próstata, pero no para neoplasias de endometrio. Si bien ambos fármacos permitieron ralentizar la progresión tumoral, ninguno de ellos eliminó la enfermedad. Durante los últimos años, ha ganado importancia la conexión entre el proceso inflamatorio y la patología tumoral. Una de las principales vías de señalización implicadas es NF-κB. Por este motivo, en la última parte del presente trabajo, se estudió el impacto de dicha vía en neoplasias inducidas por la pérdida de PTEN. La deleción simultánea de PTEN e IKKβ provocó una disminución de la incidencia de hiperplasia de tiroides en ratones, sin afectar a la progresión de neoplasias de endometrio y próstata. Sorprendentemente, la ablación de ambos genes en el sistema hematopoyético no impidió el desarrollo de neoplasias, pero afectó gravemente al fenotipo de las mismas.

Ret és un Receptor Tirosina Cinasa (RTK) que regula el desenvolupament del sistema genito-urinari i el desenvolupament del sistema nerviós perifèric. A més, les mutacions de guany de funció d’aquest receptor cursen amb el desenvolupament del Carcinoma Medul•lar de Tiroide (MTC), una neoplàsia de la glàndula tiroide que deriva de les cèl•lules C, productores de calcitonina. En mamífers, la família de Sprouty (Spry) està composta per quatre gens diferents (Spry1-4). Diferents anàlisis genètics en ratolins demostren que els gens Spry són inhibidors de la senyalització de Ret durant el desenvolupament dels ronyons i del sistema nerviós entèric. D’altra banda, alguns membres de la família de Spry s’han proposat com a possibles gens supressors de tumors en una gran varietat de patologies cancerígenes. A la primera part del nostre treball, hem volgut estudiar si la proteïna Sprouty1 pot actuar com un gen supressor de tumors al MTC. En primer lloc hem analitzat les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 i observem que desenvolupen una hiperplàsia de les cèl•lules C, una lesió precancerosa al desenvolupament del MTC. A més a més, demostrem que l’expressió de Spry1 redueix la proliferació d’una línia cel•lular derivada d’un MTC humà, la línia TT, degut a la inducció de la senescència cel•lular. Finalment, hem descobert que el promotor de Sprouty1 es troba freqüentment metilat en mostres humanes de MTC, cosa que provoca la disminució dels nivells d’expressió de Spry1 en aquest tipus de càncer. A la segona part del nostre treball, hem observat que la pèrdua de Spry1 provoca un augment del tamany de la tiroide dels ratolins a causa d’un increment de la proliferació de les cèl•lules fol•liculars. D’altra banda, les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 mostren una disminució dels marcadors de senescència cel•lular, on s’hi inclou la reducció de la secreció dels factors que activen i mantenen el fenotip secretor associat a la senescència cel•lular (SASP). Finalment, hem observat una disminució de l’activació de la via NF-kB a la tiroide dels ratolins Spry1-/-, fet que correlaciona amb la disminució de la secreció dels factors IL-6 i KC. Com que la senescència cel•lular s’ha proposat com una potent barrera pel desenvolupament tumoral, hem volgut analitzar si la pèrdua de Spry1 pot accelerar el procés de tumorigènesi en ratolins susceptibles al desenvolupament tumoral. Els ratolins doble mutants per Pten i Spry1 mostren un augment de la incidència de tumors a la tiroide i a la glàndula adrenal si ho comparem amb els ratolins Pten+/-. Tot i que la pèrdua de Sprouty1 per si sola no és suficient per promoure la formació de tumors, accelera la tumorigènesi en el context d’una haploinuficiència de Pten. / Ret es un Receptor Tirosina Quinasa (RTK) que regula el desarrollo del sistema genitourinario y del sistema nervioso periférico. Además, las mutaciones de ganancia de función de estos receptores cursan con el desarrollo del Carcinoma Medular de Tiroides (MTC), una neoplasia de la glándula tiroides que deriva de les células C, productoras de calcitonina. En los mamíferos, la familia de Sprouty (Spry) está compuesta por cuatro genes distintos (Spry1-4). Análisis genéticos en ratones demuestran que los genes Spry son inhibidores de la señalización por Ret durante el desarrollo de los riñones y del sistema nervioso entérico. Por otra parte, algunos miembros de la familia de Spry se han propuesto como posibles genes supresores de tumores de una gran variedad de patologías cancerígenas. En la primera parte de nuestro trabajo, hemos querido estudiar si la proteína Sprouty1 puede actuar como un gen supresor de tumores del MTC. En primer lugar hemos analizado las tiroides de los ratones knockout para Spry1 y observamos que desarrollan una hiperplasia de las células C, una lesión precancerosa al desarrollo del MTC. Además, hemos demostrado que la expresión de Spry1 reduce la proliferación de una línea celular derivada de un MTC humano, la línea TT, por causa de la inducción de la senescencia celular. Finalmente, hemos descubierto que el promotor de Sprouty1 se encuentra frecuentemente metilado en muestras de MTC humanas, hecho que provoca la disminución de los niveles de expresión de Spry1 en este tipo de cáncer. En la segunda parte de nuestro trabajo, hemos observado que la perdida de Spry1 provoca un aumento del tamaño de la tiroides de los ratones a causa de un incremento de la proliferación de les células foliculares. Por otra parte, las tiroides de los ratones knockout para Spry1 muestran una disminución de los marcadores de senescencia celular, dónde se incluye la reducción de la secreción de los factores que activan y mantienen el fenotipo secretor asociado a la senescencia celular (SASP). Finalmente, hemos observado una disminución de la activación de la vía NF-kB a la tiroides de los ratones Spry1-/-, que correlaciona con la disminución de la secreción de los factores IL-6 i KC. La senescencia celular se ha propuesto como una potente barrera para el desarrollo tumoral, por eso hemos querido analizar si la pérdida de Spry1 puede acelerar el proceso de tumorigénesis en ratones susceptibles al desarrollo tumoral. Los ratones doble mutantes por Pten i Spry1 muestran un aumento de la incidencia de tumores a la tiroides y a la glándula adrenal si se compare con los ratones Pten+/-. La pérdida de Sprouty1 por si sola no es suficiente para promover la formación de tumores, pero acelera la tumorigénesis en el contexto de una haploinuficiencia de Pten. / Ret is a Receptor Tyrosine Kinase (RTK) that regulates several aspects of the development of the genito-urinary system and the peripheral nervous system. Moreover, gain-of-function mutations of this receptor cause the development of Medullary Thyroid Carcinoma (MTC), a rare neoplasm arising from the calcitoninproducing C-cells of the thyroid gland. Sprouty (Spry) family of genes is composed of four members in mammals (Spry1-4). Genetic analyses on mice demonstrate that Spry genes are inhibitors of Ret signalling during the development of kidneys and enteric nervous system. Moreover, some Spry family members have been proposed as candidate tumour-suppressor genes in a variety of cancerous pathologies. In the first part of our work, we wanted to elucidate whether Spry1 could act as a tumour suppressor gene in MTC. We analysed the thyroid gland of Spry1 null-mice and found that they develop C-cell hyperplasia, a precancerous lesion preceding MTC. In addition, we demonstrate that expression of Spry1 restrains proliferation of the MTCderived cell line TT by inducing cellular senescence. Finally, we found that the Spry1 promoter is frequently methylated and its expression decreased in human MTC. In the second part of our work, we found that Spry1 knockout mice present enlarged thyroid glands due to increased proliferation of follicular cells. Moreover, thyroids from Spry1 knockout mice show decreased markers of cellular senescence, including a reduction in secretion of factors that activate and maintain the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Finally, we determine that a defective activation of NF-kB signalling in Spry1 null thyroids underlie the observed effects on secretion of SASP factors IL-6 and KC. Since cellular senescence has been proposed as a potent barrier to tumorigenesis, we wanted to assess whether loss of Spry1 could accelerate the onset of tumorigenesis in a tumour-prone mouse. Pten and Spry1 double mutant mice show increased incidence of tumours of the thyroid and adrenal glands when compared to Pten+/- mice. Thus, although loss of Spry1 by itself might not be sufficient to promote tumour formation, it does accelerate tumorigenesis in the context of Pten haploinsufficiency.

El carcinoma d'endometri (CE) és la neoplàsia més freqüent del tracte genital femení en els països desenvolupats. El CE és una malignització de les cèl·lules epitelials que revesteixen l'úter en el seu interior. Tot i que quan està confinat l’úter té bon pronòstic, quan surt de la cavitat uterina es torna una malaltia pràcticament incurable, per la qual cosa requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques a més dels mecanismes moleculars d’actuació d’aquests fàrmacs en aquesta neoplàsia, té una gran rellevància translacional. Si es compara amb els tractaments tradicionals, quimioteràpia o radioteràpia, la teràpia contra dianes moleculars presenta un gran avantatge per la seva especificitat, tant en la relació fàrmac‐diana com diana‐tumor. Això permet reduir la toxicitat indiscriminada dels tractaments anticancerosos, i addicionalment, actuar de forma dirigida contra determinats subgrups de tumors. Per altra banda, aquests fàrmacs poden actuar de forma sinèrgica entre ells o en combinació amb tractaments clàssics. L’augment del coneixement sobre l’etiologia del càncer ha permès descobrir noves dianes alterades específicament en les cèl·lules tumorals, com és el cas de les HDACs. Aquest fet ha motivat, per exemple, el desenvolupament del Vorinostat, un inhibidor de les HDACs. Els resultats obtinguts en aquesta tesi demostren que el Vorinostat és efectiu i selectiu per a les cèl·lules tumorals de CE. A nivell molecular, el Vorinostat en el CE indueix l’acetilació de les histones i altres proteïnes cooperant en el procés d’apoptosi caspasa-dependent. A més a més, el Vorinostat és eficient a l’hora de reduir la viabilitat, proliferació i induir una parada en el cicle cel·lular. El tractament juntament amb antioxidants rescata la mort induïda pel Vorinostat, fet que conclou que l’efecte letal del Vorinostat està relacionat amb l’estrès oxidatiu a través de la producció de ROS. Estudis previs demostren que la vitamina D (VD) és un factor d’inhibició tumoral en molts tipus de neoplàsies, però, la relació causa-efecte de presentar baixos nivells de VD en sèrum i desenvolupar càncer segueix estan incompleta. Els nostres estudis fets amb tissues microarrays (TMA) demostren que els casos de CE presentaven nivells baixos de CYP24A1 (enzim mitocondrial que degrada els metabòlits de la VD) juntament amb nivells baixos de VDR (receptor de la VD) nuclear i citoplasmàtic; els casos més agressius de CE, el tipus III, podien presentar nivells baixos de CYP27A1 (enzim que converteix la VD en 25(OH)D) o nivells alts de CYP24A1 en comparació amb els endometris normals (EN) analitzats. El tractament amb VD3, colecalciferol, de les línies cel·lulars de CE va ser suficient a l’hora de disminuir la capacitat clonogènica de les cèl·lules i la seva viabilitat a més d’induir efectes antiproliferatius. Globalment, els treballs que constitueixen aquesta tesi doctoral suposen una contribució important en el coneixement del mecanisme molecular d’acció del Vorinostat, antioxidants i la VD, fàrmacs que podrien ser efectius pel tractament/prevenció/atenuació del CE. / El carcinoma de endometrio (CE) es la neoplasia más frecuente del aparato genital femenino en los países desarrollados. El CE incluye un conjunto de variantes malignas que provienen de las células epiteliales que revisten el útero en su interior. Aunque cuando se encuentra confinado en el útero, tiene buen pronóstico, cuando sale de la cavidad uterina se transforma en una enfermedad prácticamente incurable, por lo que requiere la búsqueda de nuevos fármacos. La identificación de nuevas dianas terapéuticas además de los mecanismos moleculares de actuación de estos fármacos en esta neoplasia, tiene una gran relevancia translacional. Si se compara con los tratamientos tradicionales, quimioterapia o radioterapia, la terapia contra dianas moleculares presenta una gran ventaja por su especificidad, tanto en la relación fármaco-diana como diana-tumor. Esto permite reducir la toxicidad indiscriminada de los tratamientos anticancerosos, y adicionalmente, actuar de forma dirigida contra determinados subgrupos de tumores. Por otra parte, estos fármacos pueden actuar de forma sinérgica entre ellos o en combinación con tratamientos clásicos. El aumento del conocimiento sobre la etiología del càncer ha permitido descubrir nuevas dianas alteradas específicamente en las células tumorales, como es el caso de las HDAC. Este hecho ha motivado, por ejemplo, el desarrollo del Vorinostat, un inhibidor de las HDACs. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que el Vorinostat es efectivo y selectivo para las células tumorales de CE. A nivel molecular, el Vorinostat en el CE induce la acetilación de las histonas y otras proteínas cooperando en el proceso de apoptosi caspasa-dependiente. Además el Vorinostat es eficiente a la hora de reducir la viabilidad, proliferación e inducir una parada en el ciclo celular. El tratamiento junto con antioxidantes revierte la muerte inducida por el Vorinostat, hecho que sugiere, que el efecto letal de Vorinostat está relacionado con el estrés oxidativo de las células mediante la producción de ROS. Estudios previos demuestran que la vitamina D (VD) es un factor de inhibición tumoral en muchos tipos de neoplasias, sin embargo, la relación causa-efecto de presentar bajos niveles de VD en suero y desarrollar cáncer sigue siendo incompleta. Nuestros estudios hechos con tissues micro arrays (TMA) demuestran que los casos de CE presentaban niveles bajos de CYP24A1 (enzima mitocondrial que degrada los metabolitos de la VD) junto con niveles bajos de VDR (receptor de la VD) nuclear y citoplasmático; los casos más agresivos de CE, el tipo III, podían presentar niveles bajos de CYP27A1 (enzima que convierte la VD 25(OH)D) o niveles altos de CYP24A1 en comparación con los endometrios normales (EN) analizados. El tratamiento de las líneas celulares de CE con VD3, colecalciferol, es suficiente para disminuir la capacidad clonogénica de las células y su viabilidad además de inducir efectos antiproliferativos. Globalmente, los trabajos que constituyen esta tesis doctoral suponen una contribución importante en el conocimiento del mecanismo molecular de acción del Vorinostat, antioxidantes y la VD, fármacos que podrían ser efectivos para el tratamiento/atenuación/prevención del CE. / Endometrial carcinoma (EC) is the most common malignancy of the female genital tract in developed countries. EC implicates the epithelium inside the uterine cavity, and has a good prognosis when confined to the uterus. However, once outside the uterine cavity, EC becomes an incurable disease by current available drugs. Therefore, the identification of new therapeutic targets for this neoplasm as well as the molecular mechanisms of action of these drugs in this neoplasm is an issue of high translational relevance. Indeed, therapy against specific molecular targets presents an important advantage over chemotherapy or radiotherapy for their specificity. Thereby reducing their indiscriminate cellular toxicity and, more significantly, acting against specific subsets of tumors, or acting synergistically when administered in combination with traditional treatments. Increased understanding of the etiology of cancer has uncovered new targets specifically altered in tumor cells, such as the HDACs. This has led to the development of drugs as Vorinostat, an inhibitor of HDCAs. This thesis work demonstrates that Vorinostat is an effective and selective anti EC agent. At the molecular level, Vorinostat induces acetylation of histones and other proteins helping in the process of caspase-dependent apoptosi. Besides Vorinostat treatment is efficient in reducing the viability, proliferation and induces cell cycle arrest. Co-treatment with antioxidants rescues Vorinostat-induced cell death suggesting that the lethal effect of Vorinostat results from oxidative stress caused by ROS production. An additional contribution of this thesis work is the anti-EC actions of vitamin D (VD). Numerous epidemiological studies have linked VD deficiency with a higher cancer risk, but the cause-effect link low serum levels of VD and an accelerated development of cancer is still incomplete. In vitro studies in EC cell lines demonstrated that VD3 (cholecalciferol) treatment was sufficient to reduce their viability, proliferation rates and clonogenic capacity because these cells express CYP27A1 and CYP2R1, the enzymes that can convert VD3 into 25-hydroxyVD3/25(OH)D, a direct activator of VDR antiproliferative actions. Furthermore, tissue micro arrays (TMA) analysis revealed higher expression of both CYP27A1 and CYP2R1 but low VDR in EC compared to normal endometrium. These findings together with the low levels of CYP24A1 (the enzyme that degrades VD metabolites) in early stages of EC support the potential for effective antiproliferative actions with appropriate VD supplementation. Both reductions in CYP27A1 and CYP2R1 and increases in CYP24A1 limit VD inhibition of EC growth in more advanced stages. Overall, this thesis work provides an important contribution to our understanding on the molecular mechanisms of action of Vorinostat, antioxidants and VD, all of which might be effective for the treatment/attenuation/prevention of EC.

El objetivo de este estudio es la generación ex-vivo de eritrocitos a partir de la maduración y diferenciación de células CD34+ purificadas de sangre de cordón umbilical. El desarrollo de la terapia celular y la generación de diferentes tipos celulares a partir de células madre ha abierto el campo a la producción de diferentes componentes sanguíneos, entre ellos los eritrocitos, a partir de células madre hematopoyéticas (células CD34+). Existen diferentes fuentes de células CD34+, siendo el cordón umbilical una fuente de fácil acceso y donde éstas presentan una mayor capacidad de expansión. La necesidad de incrementar la tasa de expansión y el paso de enucleación celular son los puntos clave para hacer realidad la posibilidad de generar sangre en el laboratorio que sea equiparable a una unidad de sangre donada. Se han diseñado diferentes estrategias para generar eritrocitos a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical. Estas estrategias se han basado en la utilización de diferentes medios de cultivo, citocinas, concentraciones celulares y estrategias de cultivo. Para el paso final de enucleación se ha pasado de un co-cultivo sobre capa estromal de células mesenquimales a un cultivo en suspensión celular. Se ha puesto a punto una metodología de cultivo consistente en la combinación de un medio específico con estrategias de alimentación que permiten la expansión y diferenciación de células CD34+ de cordón umbilical a eritrocitos maduros. Todavía son necesarios más ajustes para incrementar la tasa de expansión y optimizar la fase de maduración final. / The aim of this study was the in vitro generation of red blood cells (RBC) from CD34+ cells purified from human umbilical cord blood, offering an alternative to classical transfusion products. Within the hematopoietic stem cell sources, umbilical cord is readily available and it has a greater expansion capacity. Such increase of the expansion capacity and the terminal differentiation efficiency are the key points in the generation of blood in the laboratory. We have tested different methodologies to generate erythrocytes from CD34+ cells from human umbilical cord blood. The parameters investigated related with the increase of the expansion capacity involved the use of different culture media, cytokines, cell seeding density and dilution steps. For the terminal differentiation and enucleation steps, the stromal layer co-culture was switched into a suspension culture with erythropoietin. The erythroid progenitors were characterized by the expression of the surface markers CD45, CD36, CD235 (glycophorin A) and CD71 (transferrin receptor). Enucleated cells were discriminated from nucleated cells by labeling the genetic content. May-Grünwald-Giemsa staining was used for morphological analyses. A culture methodology that combines a specific medium formulation and feeding strategy has been successfully developed in bioreactors allowing the expansion and differentiation of CD34+ cord blood to mature red blood cells. Further improvements are still needed in order to increase the expansion rate and to optimize terminal differentiation step.