La determinació de fluxos metabòlics constitueix una eina fonamental per a l'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel·lular, ja que ens proporciona una mesura del grau d’implicació de les diverses vies en els processos metabòlics així com una visió general del comportament cel·lular. La quantificació exacta de la magnitud dels fluxos de cadascuna de les diferents vies “in vivo” és, per tant, un objectiu important de la fisiologia cel·lular i l'enginyeria metabòlica, especialment en el context de la biotecnologia industrial, l'objectiu principal de la qual és maximitzar la producció del compost d’interès, com ara la producció de compostos químics, biopolímers o d’altres compostos bioactius com ara les proteïnes. Aquest projecte de recerca s’ha dirigit a contribuir a una millor comprensió de la fisiologia del llevat metilotròfic Pichia pastoris sota l’estrès ocasionat per la producció de proteïnes recombinants. Concretament, aquesta tesi s'ha centrat en l'anàlisi sistemàtica del metabolisme cel·lular a nivell fluxomic i metabolòmic, i com aquests conjunts de dades de diferents nivells poden integrar-se i contribuir a la comprensió dels efectes de la càrrega metabòlica potencialment imposada per la secreció d'una proteïna recombinant i l’efecte del tipus de font de carboni utilitzat. En el Capítol 2, s’obtingué una descripció consistent de la composició principal de la biomassa de P. pastoris per a cada condició de cultiu realitzada en aquest estudi. Els resultats obtinguts han estat utilitzats en els capítols següents per realitzar l'anàlisi de fluxos metabòlics. En el Capítol 3, es realitzaren experiments amb marcatge 13C fraccional biosintèticament dirigit (BDF). Els experiments es realitzaren en cultius operats en continu de P. pastoris creixent amb barreges de glucosa/metanol com a font de carboni, per tal d’obtenir informació sobre les relacions entre fluxos de les principals vies metabòliques del metabolisme central d'aquest llevat. Es desenvoluparen noves equacions pel cas de la mescla de font de carboni mixta glucosa/metanol utilitzada. Seguidament, aquestes relacions foren utilitzades per dur a terme l'anàlisi de fluxos metabòlics de les diferents soques de P. pastoris secretores d'una lipasa recombinant (les quals tenien 1 i 2 còpies del gen que codifica la lipasa). La principal característica obtinguda, reflectida en els diferents quocients de fluxos metabòlics i les dades macroscòpiques dels cultius, fou la similitud en les estimacions finals de fluxos entre les dues soques productores de lipasa. No obstant, s’observaren diferències estadísticament significatives al comparar ambdues soques amb la soca control de referència (no productora). Durant el Capítol 4, seguint la mateixa metodologia comentada en el capítol anterior, s’estudià l’efecte de la taxa de dilució i diferents relacions de barreges glicerina/metanol com a font de carboni en cultius en continu de P. pastoris amb una única còpia del gen de la lipasa . Concretament, es realitzaren cultius a dues velocitats de dilució per tal d’avaluar l'impacte combinat de la composició de les diferents mescles de fonts de carboni i velocitat de creixement sobre la distribució de fluxos intracel·lulars. Les dades experimentals obtingudes en aquest estudi es combinaren amb dades de marcatge 13C obtingudes en experiments previs sota les mateixes condicions. No obstant, com a conseqüència de la utilització de glicerina en lloc de glucosa, no fou possible la utilització de les equacions de flux formulades en el capítol anterior. Per tant, com a solució alternativa, s’implementà una metodologia basada en l'avaluació global de la xarxa metabòlica per tal de calcular la distribució de fluxos. Curiosament, no s’observaren diferències estadísticament significatives en la distribució de fluxos quan es compararen els diferents cultius amb diferent relació de glicerina/metanol realitzats sota la mateixa taxa de dilució. D’altra banda, si que s’observaren clares diferències en el moment de comparar els patrons de flux corresponents a diferents taxes de dilució. Les diferents anàlisis metabolòmiques es descriuen en els Capítols 4 i 5. En el Capítol 5, s’aplicà una anàlisi metabolòmica juntament amb una distribució de fluxos en condicions isotopomèriques no estables (condicions de marcatge 13C en dinàmic) per a caracteritzar el metabolisme central de carboni de la soca de referència (control) de P. pastoris creixement amb glucosa/metanol com a font de carboni mixta. Una nova metodologia basada en les dades de marcatge obtingudes mitjançant GC-MS i LC-MS ens va permetre una quantificació més precisa dels diferents fluxos metabòlics per a les vies de les pentoses fosfat, la glucòlisi i la via d'assimilació del metanol. Posant com a referència els resultats obtinguts en el capítol 3, aquesta nova metodologia permeté determinar una distribució de fluxos més amplia i acurada. Així mateix, es realitzà una anàlisi termodinàmica de les dades de metabolòmica , la qual ens va permetre validar les concentracions de metabòlits mesurades i les direccions dels fluxos calculades. Finalment, en el Capítol 6, es realitzà una comparació fluxòmica i metabolòmica entre les diferents soques utilitzades en aquesta tesi, a més a més d'una altra soca amb més de 2 còpies del gen de la lipasa disponible en el Grup de recerca. Els resultats obtinguts no mostraren diferències estadísticament significatives entre les diferents soques productores en termes de distribució global dels fluxos. Ara bé, s'observaren diferències locals estadísticament significatives en alguns punts de la xarxa metabòlica. A més, l'anàlisi metabolòmica, revelà diferències clares entre la soca control i la productora, com ara la concentració de trehalosa, metabòlit estretament lligat a respostes d’estrès. En general, durant aquesta tesi s’ha portat a terme amb èxit la implementació de noves metodologies per a l'anàlisi dels fluxos metabòlics de P. pastoris. Aquestes metodologies han estat comparades i posteriorment validades. A més a més, utilitzant les diferents dades metabolòmiques obtingudes, ens ha permès expandir la xarxa metabòlica proposada durant els primer capítols d’aquesta tesi, ampliant així el coneixement sobre l’impacte de producció d’una proteïna recombinant sobre el metabolisme central del carboni de P. pastoris creixent sobre fonts de carboni mixtes. / Determination of metabolic fluxes constitutes a fundamental tool for quantitative analysis of cell physiology, as they provide a measure of the degree of engagement of various pathways in metabolic processes and overall cellular function. Accurate quantification of the magnitude of pathway fluxes in vivo is, therefore, an important goal of cell physiology and metabolic engineering, especially in the context of industrial biotechnology, where the aim is to convert as much substrate as possible into useful products such as chemicals, chemical building blocks, biopolymers or bioactive compounds such as proteins. This research project was aimed to contribute to the better understanding of the Pichia pastoris physiology under recombinant protein production stress. Specifically, this thesis was focused on the systematic analysis of cell metabolism at the fluxome and metabolome omics levels, and how datasets from these different levels can be integrated and contribute to the understanding of the impact of the potential burden imposed by the secretion of a recombinant protein and the type of mixed carbon source used. In Chapter 2, a consistent description of the biomass principal component of P. pastoris was obtained for each condition tested in this study, obtaining the best estimation of the biomass composition. The obtained results were afterwards used in the following chapters to perform the metabolic flux analysis. In Chapter 3, biosynthetically directed fractional 13C-labelling (BDF) experiments were performed in chemostat cultures of P. pastoris growing on a glucose/methanol mix, obtaining information about the principals metabolic flux ratios of the central carbon metabolism of this yeast. New equations were developed for the case of “glucose/methanol” as a mixed carbon source. Afterwards, these values were used to perform the metabolic flux analysis of two P. pastoris strains secreting different amounts of a recombinant lipase (corresponding to strains harbouring 1 and 2 copies of the lipase encoding gene). The most prominent feature obtained, already indicated by the metabolic flux ratios and the macroscopic data, was the similarity in flux estimations between the two lipase producing strains. Nevertheless, statistical differences were observed when comparing the control (non-producing) strain to the production strains. In Chapter 4, using the same experimental approach as in chapter 3, chemostat cultures of the P. pastoris strain harbouring one copy of the lipase gene growing on 3 different “glycerol/methanol” and 2 dilution rates were performed to evaluate the impact of carbon mix compositions and growth rate on the flux distribution. Experimental data was combined with existing 13C-labelling datasets obtained from previous BDF experiments performed on replica experiments. However, due to the use of glycerol instead of glucose, it was not possible to use the equations formulated in the previous chapter. Hence, an alternative approach based on the global evaluation of the metabolic network was done in order to calculate the final flux distribution. Interestingly, no statistical differences were observed when the experiments were done under a given dilution rate varying the glycerol-methanol concentrations. Nevertheless, clear differences were observed when comparing flux patterns corresponding to different dilutions rates. The metabolome analyses were performed in Chapters 4 and 5. In Chapter 5, metabolomic and instationary 13C flux analysis was applied to characterize the central carbon metabolism under “glucose/methanol” co-assimilating conditions, using the same reference control strain from Chapter 3. A new methodology based on GC-MS and LC-MS derived data allowed for an accurate mapping of metabolic fluxes for the glycolytic, pentose phosphate and methanol assimilation pathways. Compared with the results obtained in Chapter 3, more fluxes could be determined. Furthermore, using thermodynamic metabolic network analysis of metabolome data allowed validating metabolite measurements and metabolic flux directions. Finally in Chapter 6, a fluxome and metabolome comparison between the strains used in this thesis plus another strain harbouring five copies of the lipase gene was performed. The results showed no statistical differences between the tested strains in terms of global flux distribution, however we observe statistical differences in some fluxes of the metabolic network. Nevertheless, metabolome analysis, revealed some clear differences for example in the trehalose pool, as a result of the impact of protein secretion in the metabolite concentration pools. Overall, during this thesis we have succeeded in establishing new methodologies for the analysis of Pichia pastoris flows. These methodologies have been compared and validated. Moreover using the metabolomics data obtained has allowed us to expand the metabolic network proposed in the early chapters increasing the knowledge about the impact of a recombinant protein production using different carbon sources as a mixed substrates.

No description available.

During mitotic spindle assembly, γ-tubulin ring complexes (γTuRCs) nucleate microtubules at the centrosome, around mitotic chromatin and, by augmindependent recruitment, from pre-existing microtubules. The analysis of these distinct pathways in somatic cells is challenging due to the predominance of centrosomal nucleation. It is also unknown how microtubules derived from different nucleation pathways are organized into the bipolar spindle structure. Minus ends were shown to be present throughout the spindle with a higher concentration near the poles. However, the analysis of minus end dynamics has been prevented by lack of a suitable probe. I have identified the γ-tubulin ring complex (γTuRC) as a reliable marker for noncentrosomal microtubule minus ends in the spindle and have confirmed the accumulation of minus ends in the pole-proximal region. Using cells stably expressing γ-tubulin fused to photoactivatable GFP and mutants of γTuRC subunits, I have demonstrated that the γTuRC is recruited preferentially in the poledistal spindle region, where it associates with microtubule minus ends and then moves poleward along the mitotic spindle. Poleward transport of γTuRC at minus ends depends on the molecular motors dynein, KIFC1 and KIF11. I also discovered that some of the γTuRC that reaches the poles is stably incorporated at the centrosomes, complementing the microtubule-independent centrosome targeting previously described. Using laser ablation of centrosomes, I studied non-centrosomal spindle assembly. At mitotic entry, in the absence of centrosomes, these cells could nucleate microtubules from the nuclear area. These microtubules formed multipolar spindles but cells eventually divided into two daughter cells. However, cells derived from these abnormal mitoses were typically not viable. In summary, by revealing the dynamics of the minus ends of non-centrosomal microtubules, I have provided novel insight into assembly and architecture of the mitotic spindle. In addition, I have shown that centrosomes, even though not essential for somatic cell division, play an important role in the fidelity of spindle assembly and function. / Durante la formación del huso mitótico, los complejos anulares de γ-tubulina (γTuRCs, del ingles γ-tubulin ring complexes) nuclean microtúbulos alrededor de la cromatina mitótica y, mediante la interacción con el complejo de la Augmina, a partir de otros microtúbulos ya existentes. El estudio de estos mecanismos en células somáticas es complejo, debido a la predominancia de la nucleación centrosomal de los microtúbulos en estas células. En la actualidad, aun no se sabe como microtúbulos procedentes de distintas vías de nucleación se organizan en la estructura bipolar del huso mitótico. Se ha observado que los extremos (-) están presentes a lo largo del huso, detectándose una mayor concentración cerca de los polos. A pesar de esto, no se conocen estudios detallados acerca de la dinámica del extremo (-) debido a la ausencia de marcadores adecuados. He observado que el complejo anular de γ-tubulina (γTuRC) es un marcador fiable de los extremos (-) en los microtúbulos acentrosomales presentes en el huso mitótico. Además, he confirmado la acumulación de estos extremos (-) en la región próxima a los polos del huso. Utilizando líneas celulares que expresan de forma estable γ-tubulina fusionada a un GFP foto-activable, y que además han sido transfectadas con isoformas mutantes de subunidades del γTuRC, he demostrado que el γTuRC se recluta preferentemente en regiones del huso alejadas de los polos. Allí el γTuRC se asocia con los extremos (-) de los microtúbulos, para ser transportado a lo largo del huso mitótico en dirección a los polos. El transporte del γTuRC presente en los extremos (-) en dirección a los polos lo realizan los motores moleculares Dineina, KIFC1 y KIF11. También he descubierto que una parte de las moléculas de γTuRC que alcanzan los polos del huso se integran de forma estable en los centrosomas, complementando la vía de incorporación al centrosoma independiente de microtúbulos que ha sido previamente descrita. Usando la técnica de ablación de centrosomas con laser, he estudiado la formación acentrosomal del huso. Cuando estas células entran en mitosis en ausencia de centrosomas, pueden nuclear microtúbulos desde el área nuclear. Estos microtúbulos forman husos multipolares, aunque las células finalmente se dividen en dos células hijas. Las células procedentes de estas mitosis anormales no suelen ser viables. En conclusión, mediante el revelado la dinámica de los extremos (-) de los microtúbulos no centrosomales, he proporcionado nueva información acerca del ensamblaje y arquitectura del huso mitótico. Además, he demostrado que los centrosomas, aunque no son esenciales para la división celular somática, juegan un papel importante en el correcto ensamblaje y función del huso mitótico.

Partitioning of chromatids during mitosis requires that chromosome compaction and spindle length scale appropriately with each other. However, it is not clear whether chromosome condensation and spindle elongation are linked. Here we have used chromosome fusions to examine the impact of increased chromosome length during yeast mitosis. We find that yeast cells could cope with a >50% increase in the length of their longest chromosome arm by decreasing the physical length of the mitotic chromosome arm through 1) reducing the number of copies of the repetitive rDNA array and 2) by increasing the level of mitotic condensation. Consistently, cells carrying the fused chromosomes became more sensitive to loss of condensin- and its regulator polo kinase/Cdc5. Length-dependent stimulation of condensation took place during anaphase and depended on aurora/Ipl1 activity, its localization to the spindle midzone, and phosphorylation of histone H3 on Ser10, a known Ipl1 substrate. The anaphase spindle therefore may function as a ruler to adapt the condensation of chromosomes to spindle length. Consistent with this, chromosome condensation levels correlate with the length of anaphase spindles.

To ensure faithful segregation of the genetic material, during mitosis the cell assembles the mitotic spindle, a macromolecular machine made of dynamic microtubules and associated proteins. Spindle microtubules are assembled de novo by the centrosomes and through the RanGTP pathway that is sufficient for spindle self-organization. In this thesis I used a proteomics approach to study the RanGTP pathway induced microtubules and spindle self-organization and I propose that it occurs through a multi-step mechanism. I then addressed how the centrosomal and acentrosomal microtubule assembly pathways are integrated to build the bipolar spindle. My data suggest that, in small cells, centrosome maturation defines an optimal and essential balance between these two pathways due to a competition for limiting amounts of tubulin. Interestingly in big cells, I found that centrosome maturation ensures the correct positioning of each centrosome to a spindle pole and thereby assures proper centrosome segregation to the daughter cells. Finally, I present molecular insights about the interaction of the microtubule polymerase XMAP215 with its mitotic interactor TACC3. / Durant la mitosi, per assegurar que el material genètic es segrega correctament, la cèl•lula construeix el fus mitòtic, una maquinària macromolecular formada de microtúbuls dinàmics i proteïnes associades. Els microtúbuls del fus són formats de novo pels centrosomes o a través de la “RanGTP pathway”, la qual és autosuficient per promoure l'autoorganització del fus mitòtic. En aquesta tesi he utilitzat tècniques de proteòmica per estudiar com la “RanGTP pathway” indueix l'autoorganització dels microtúbuls i del fus mitòtic a través d’un procés amb múltiples passos (tal i com indiquen els resultats obtinguts). Paral•lelament he estudiat com els microtúbuls formats per ambdues vies (centrosomes i “RanGTP pathway”) es coordinen per la construcció del fus bipolar. Els meus resultats suggereixen que, en cèl•lules petites, la maduració dels centrosomes defineix un equilibri òptim i essencial entre els dos sistemes, com a conseqüència de la disponibilitat limitada de tubulina. Per altra banda, en cèl•lules grans la maduració dels centrosomes condiciona la correcta localització d’aquests als pols del fus mitòtic, assegurant-ne la segregació a les dues cèl•lules filles. Finalment, exposo els detalls moleculars de la interacció entre la polimerasa de microtúbuls XMAP215 i el seu interactor mitòtic TACC3.

The marginal zone (MZ) of the spleen contains an innate-like subset of B cells that mount rapid protective antibody responses to polysaccharides and lipids from bloodborne viruses and bacteria. These antigens activate MZ B cells by engaging somatically recombined B cell receptors (BCRs) and germline-encoded patternrecognition receptors, including Toll-like receptors (TLRs). MZ B cells receive additional co-stimulatory signals from a proliferation-inducing ligand (APRIL) and B cellstimulating factor of the TNF family (BAFF), two tumor necrosis factor (TNF)-related cytokines released mainly by macrophages, dendritic cells and neutrophils in response to microbes. BAFF and APRIL stimulate MZ B cells through a poorly characterized receptor called transmembrane activator and CAML interactor (TACI). Here we show that TACI induces antibody production and class switching by activating the kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) through MyD88, an adaptor protein usually associated with TLRs. The discovery of this rapamycin-sensitive signalling pathway may facilitate the development of novel strategies for the modulation of protective or pathogenic antibody responses emanating from MZ B cells. / La zona marginal (ZM) de la melsa conté un subgrup de cèl∙lules B de tipus innat que organitzen de forma ràpida respostes d’anticossos protectors contra polisacàrids i lípids de virus i bacteris transmesos per la sang. Aquests antígens activen les cèl∙lules B de la ZM en interaccionar amb receptors de les cèl・lules B (BCR) que han patit recombinació somàtica i receptors de reconeixement de patrons, incloent els receptors de tipus Toll (TLR). Les cèl・lules B de la ZM reben senyals co-estimuladores addicionals del lligand inductor de proliferació (APRIL) i el factor estimulant de cèl・lules B de la família del TNF (BAFF), dos citocines relacionades amb el factor de necrosis tumoral (TNF) alliberades principalment per macròfags, cèl∙lules dendrítiques i neutròfils en desposta a microbis. BAFF i APRIL estimulen les cèl∙lules B de la ZM mitjançant un receptor poc caracteritzat anomenat activador de transmembrana i interactor de CAML (TACI). En aquest estudi demostrem que TACI indueix producció d’anticossos i canvi de classe de la cadena pesada de les immunoglobulines activant la quinasa diana de la rapamicina dels mamífers (mTOR) mitjançant MyD88, una proteïna adaptadora habitualment associada amb els TLRs. El descobriment d’aquesta via de senyalització sensible a la ramapicina podria facilitar el desenvolupament de noves estratègies per la modulació de les respostes protectores o patogèniques dels anticossos produïts per les cèl・lules B de la ZM.

Cell growth and division requires delivery of new membrane and remodelling factors to the cell surface. In budding yeast, this involves actin-dependent transport of secretory vesicles to sites of growth, followed by vesicle fusion to the plasma membrane. Rho-type GTPases regulate actin polarization and vesicle fusion, but how they signal to diverse effectors controlling these separate processes is not well understood. Here, we show that the cortical proteins Boi1 and Boi2 work together with Rho GTPase signalling to regulate the exocyst, a complex that mediates the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. Cells lacking both Boi proteins show normal actin polarity but are defective in bud emergence, bud growth, and fusion of Bgl2-containing vesicles to the plasma membrane. A gain-of-function version of Exo70, a component of the exocyst and effector of Cdc42 and Rho3, restores growth of boi1 boi2 mutant cells. Furthermore, hyperactivation of Rho-GTPase signalling rescues boi defects, suggesting that the essential function of Boi proteins is to mediate Rho-dependent activation of the exocyst during cell growth. Finally, we find that Boi1 and Boi2-dependent inhibition of abscission in cells with chromatin bridges, via their function in the NoCut checkpoint, is bypassed by expression of gain-of-function EXO70, suggesting the NoCut pathway also involves regulation of the exocyst. / Tant el creixement com la divisió cel·lular requereix el transport de membrana i altres factors a la superfície cel·lular. En cèl·lules de S. cerevisiae, aquests processos necessiten el transport de vesícules de secreció a través dels cables d’actina fins a les zones de creixement actiu, on es fusionen. Les Rho GTPases regulen la polarització de l’actina i la fusió de vesícules, però es desconeix com les GTPases senyalitzen els diversos efectors i com regulen els dos tipus de funcions. En aquest estudi, demostrem que les proteines Boi1 i Boi2 treballen conjuntament amb la senyalització de les Rho GTPases, per tal de regular la funció del complexe “exocyst” que media els contactes inicials entre vesícules de secreció i la membrana plasmàtica. Cèl·lules sense Boi1/2 tenen el citoesquelet d’actina polaritzat, però la cèl·lula filla no pot emergir ni créixer. Un al·lel d’Exo70, una subunitat de l’”exocyst”, que és efector de les GTPases Rho3 i Cdc42, restaura el creixement de cel·lules defectuoses en la funció de Boi1/2. A més a més, l’hiperactivació de GTPases rescata defectes dels mutants de Boi1/2, suggerint que la funció essencial de Boi1 i Boi2 és promoure l’activació de l’”exocyst”, depenent de Rho, durant el creixement cel·lular. Finalment, hem demostrat que la inibició de la divisió cel·lular que controlen via NoCut els efectors Boi1/2 en cèl·lules amb defectes en la segregació de cromosomes, es rescata amb l’al·lel d’Exo70 descrit anteriorment. Aquestes observacions suggereixen que NoCut podria funcionar també a través de la regulació de l’”exocyst”.

La senescencia celular es una detención irreversible del ciclo celular que tiene lugar en respuesta a diversos estímulos de estrés, actuando como un mecanismo supresor de tumores para impedir la proliferación de células con riesgo de transformación maligna. Así, mutaciones que interfieren con el proceso de la senescencia pueden favorecer la formación tumoral. De todas formas, cada vez hay más pruebas que sugieren que las células senescentes también pueden ejercer efectos pro-tumorigénicos en el tejido circundante mediante el fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). Así, descifrar los mediadores moleculares de la senescencia y el SASP es crítico para entender los estadios tempranos de la formación y progresión tumoral. Aquí mostramos que la isoforma ΔNα de p63, un factor de transcripción relacionado con p53, es un oncogén que promueve la iniciación tumoral en colaboración con Ras mediante la inhibición de la senescencia inducida por oncogenes (OIS). Efectivamente, el incremento en la expresión de ΔNp63α en queratinocitos primarios de ratón bloquea la OIS y directamente conduce a la formación de un carcinoma de células escamosas (SCC). También identificamos la Helicasa Específica Linfoide (Lsh), un miembro de la familia SNF2 de remodeladores de la cromatina, como nueva diana de p63 necesaria para la inhibición de la senescencia. Posteriormente, demostramos que Lsh es suficiente para iniciar la formación tumoral independientemente de p63, y que el aumento en su expresión conduce a un desarrollo tumoral más agresivo. Sorprendentemente, mostramos que Lsh tiene un papel en la inducción de la linfangiogénesis, un proceso característico de la progresión maligna y la metástasis. Es interesante notar que las pruebas apuntan hacia Lsh actuando sobre el SASP para dirigir la formación y la progresión tumoral. En conjunto, en este trabajo se identifican nuevos mediadores críticos de la senescencia y funciones de la desregulación de la senescencia durante la formación y la progresión tumoral. / Cellular senescence is an irreversible cell cycle arrest that occurs in response to various stresses, acting as a tumor-suppressive mechanism to impede the proliferation of cells at risk for malignant transformation. As such, mutations that interfere with the senescence process can favor tumor formation. However, increasing evidence suggests that senescent cells can also exert pro-tumorigenic effects on the surrounding tissue, through the senescence-associated secretory phenotype (SASP). As such, understanding the molecular mediators of senescence and the SASP is critical to unravel the early stages of tumor formation and progression. Here we show that the ΔNα isoform of p63, a p53-related transcription factor, is an oncogene that promotes tumor initiation in cooperation with Ras, through the inhibition of oncogene-induced senescence (OIS). Indeed, increased expression of Np63 in primary mouse keratinocytes blocks OIS and directly leads to the formation of squamous cell carcinoma (SCC). We also identify Lymphoid Specific Helicase (Lsh), a member of the SNF2 family of chromatin remodelers, as a novel target of p63, required for senescence bypass. Subsequently, we demonstrate that Lsh is sufficient to initiate tumor formation independently of p63, and that its increased expression leads to aggressive tumor development. Surprisingly, we show a role for Lsh in the induction of lymphangiogenesis, a hallmark of malignant progression and metastasis. Interestingly, the evidence points towards Lsh acting on the SASP to instruct tumor formation and progression. Together, this work identifies critical new mediators of senescence, and functional roles for senescence deregulation during tumor formation and progression.

Hydrogen peroxide (H2O2), a reactive oxygen species (ROS), is involved in both oxidative stress and signaling cascades in a dosage dependent manner. Its toxicity is partially explained through reactivity with iron via the Fenton reaction. Iron, indispensible for many cellular processes, is thus tightly regulated to balance between need and toxicity. Using fission yeast as a model system, we explored the relationship between H2O2 and the iron starvation response system, specifically whether cross-talk allowed mutual regulation that could prevent synergistic toxicity of ROS via diminishing iron quantity. We screened around of 2700 haploid Schizosaccharomyces pombe deletion mutants in different oxidative stress agents, identifying new genes amongst which fep1, pcl1 and sib2 are involved in iron homeostasis. H2O2, unexpectedly, triggers transcriptional iron starvation response, including enhanced iron import and decreased iron consumption. Over-expression of several antioxidant proteins, in particular heme-containing catalase, causes strong iron consumption within the cell, triggering the iron starvation pathway accidentally. Furthermore, glutaredoxin Grx4 contains an iron-sulfur cluster (ISC) involved in iron sensing, underpinning regulation of the iron starvation response. Finally, we identify and characterize the frataxin homolog gene in S. pombe, pfh1. Deficiencies in frataxin provoke a neurodegenerative disease called Friedreich ataxia; the function of this protein remains controversial. We create ∆pfh1 strain as a new model system to elucidate the molecular events leading to the disease. / El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un agente oxidante que además de participar en cascadas de señalización produce toxicidad por daño oxidativo. Parte de su toxicidad se explica por su reactividad con hierro. Así, las concentraciones de hierro en el interior celular han de estar estrictamente reguladas. Usando la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, como un sistema modelo, estudiamos las relaciones entre H2O2 y el sistema de respuesta a déficit de hierro. Genes como fep1, pcl1 y sib2, importantes para mantener su homeostasis, fueron encontrados en un análisis de 2700 mutantes de S. pombe, tras tratamiento con diferentes agentes oxidantes. Inesperadamente encontramos que H2O2 desencadena una respuesta transcripcional de déficit de hierro, incluyendo aumento de su entrada y disminución de su consumo. Ésta es una respuesta accidental debido a la sobreexpresión de proteínas como catalasa, una hemoproteína, consumidoras masivas de hierro. Encontramos además que la glutaredoxina Grx4 contiene un clúster de hierro-azufre implicado en sensar hierro. Finalmente, identificamos, caracterizamos y delecionamos el homólogo de frataxina en S. pombe, pfh1. Deficiencias en frataxina provocan ataxia de Friedreich. Los mecanismos por los cuales se desencadena esta enfermedad están todavía por elucidar, pero S. pombe es un buen sistema modelo para su estudio.

The embryo of Caenorhabditis elegans is a model system in which development can be studied at single cell resolution. In this thesis I describe the use of a semi-automatic nuclear tracking algorithm to analyze cellular movements in the early embryo, as well as how embryos respond to mechanical deformation and to genetic perturbation. During gastrulation cells were observed to not only ingress into the interior of the embryo, but also to egress onto the surface. Moreover, cell lineages were identified that undergo both directional movements, i.e. first internalize and then continue to move until finally reemerging on the surface, “transgressing” or “tunnelling” through the embryo. The previously described stereotypical early rotation movements in compressed embryos were found to be highly variable in uncompressed embryos, with this variable global rotation largely determining the final embryonic axes. In addition to constraining this early rotation, compression of the embryo was found to alter the relative positions of cell groups. A compensatory mechanism was identified consisting of a global rotation of cells initiating more than an hour after the four-cell stage that realigns the relative positions of cell groups and results in a further rotation of the embryonic axes. Possible mechanisms that drive these corrective cell movements are discussed. Inhibiting the expression of 20 general regulators of chromatin and analyzing the phenotypic consequences at single cell resolution revealed functions in chromosome segregation, mitotic cell cycle progression, cellular movements and lineage-specific development, and suggested the existence of functionally diverse chromatin-modifying protein complexes in the embryo. Moreover, a global re-arrangement of nuclear architecture was observed upon the inhibition of zygotic gene expression. Taken together, these analyses illustrate the power of single cell resolution phenotyping, identify previously unrecognized cell behaviors during early development, and identify regulative cell movements as a mechanism that confers robustness to the effects of mechanical deformation. / El nemátodo Caernorhabditis elegans ofrece la posibilidad de estudiar el desarrollo embrionario con una resolución celular. En esta tesis, describo el uso de un algoritmo semi-automático de seguimiento nuclear para analizar movimientos celulares en el embrión temprano, así como la manera en que el embrión responde a deformaciones mecánicas y a perturbaciones genéticas. Durante el proceso de gastrulación, observamos que ciertas células no solo ingresan al interior del embrión, pero también egresan hasta la superficie. Asimismo, identificamos linajes celulares que llevan a cabo ambos tipos de movimientos direccionales, esto es, primero internalizan y luego la continuan su movimiento hasta finalmente re-emerger en la superficie, “transgressing” o “tunneling” a través del embrión. Hemos descubierto que los movimientos estereotípicos de rotación en el embrión temprano, descritos previamente, son altamente variables en ausencia de compresión y esta variabilidad total en la rotación determina los ejes finales del embrión. Además de limitar esta rotación temprana, la compresión del embrión altera la posición relativa de grupos celulares. Hemos identificado un mecanismo compensatorio que consiste en la rotación global de células el cual tiene lugar mas de una hora después del estadio de cuatro células. Ese mecanismo re-alinea la posición relativa de los grupos celulares resultando en una rotación adicional de los ejes embrionarios. Posibles mecanismos responsables de estos movimientos correctivos son discutidos. La inhibición de la expresión de 20 reguladores generales de la cromatina y el análisis de las consecuencias fenotípicas con resolución celular ha revelado funciones en la segregación de cromosomas, la progresión mitótica del ciclo celular, movimientos celulares y desarrollo linaje-especifico, sugiriendo la existencia de diversos complejos de proteínas modificadoras de la cromatina en el embrión. Además, hemos observado una re-organización global de la arquitectura nuclear al inhibir la expresión zigótica en el embrión. En conclusión, estos análisis han permitido ilustrar el poder de la fenotipificación con resolución celular, así como la identificación de comportamientos celulares previamente desconocidos durante el desarrollo temprano y movimientos celulares regulativos como un mecanismo que confiere robustez a los efectos de deformaciones mecánicas.