Els telòmers són estructures ribonucleoproteiques formades per repeticions en tàndem TTAGGG, un complex proteic específic (shelterina), i RNA telomèric no codificant (TERRA), que es localitzen als extrems dels cromosomes eucariotes per prevenir la inestabilitat genòmica i les fusions entre cromosomes. En les cèl·lules germinals, el manteniment de l’estructura telomèrica és crucial per a la correcta progressió de la gametogènesi, ja que els telòmers participen en l’aparellament entre cromosomes homòlegs durant la profase I de la meiosi, i promouen la sinapsi i la recombinació entre ells. De fet, la disrupció de l’homeòstasi telomèrica provoca l’apoptosi de les cèl·lules germinals i/o la generació d’aneuploïdies, i està altament relacionada amb la senescència reproductiva. No obstant, poc se’n sap dels mecanismes encarregats de preservar l’estructura i longitud telomèrica al llarg de la gametogènesi dels mamífers. Per aquest motiu, tenint en compte que TERRA és un component integral de l’estructura telomèrica, i que la telomerasa és el complex enzimàtic que allarga els telòmers, en aquest treball es va plantejar l'estudi de la implicació d’aquestes dues molècules en la preservació de l’homeòstasi dels telòmers en les cèl·lules germinals de mamífer. Amb aquest objectiu, es van analitzar cèl·lules germinals humanes i de ratolí al llarg de la gametogènesi mitjançant tècniques citogenètiques i moleculars. Els nostres resultats mostraren que tant TERRA com el component proteic de la telomerasa (TERT) es localitzaven als telòmers de les cèl·lules germinals. La distribució nuclear de TERRA estaria subjecta a un llindar dependent dels nivells cel·lulars de TERRA i del gènere de la cèl·lula (oòcit o espermatòcit), mentre que la transcripció de TERRA dependria de l’estadi de la gametogènesi i de l’estat del mateix telòmer. D’altra banda, TERT es trobava majoritàriament als telòmers de les cèl·lules germinals, sobretot en ratolí, tot i que no s’observà l’elongació dels telòmers al llarg de la gametogènesi. Alhora, la (baixa) co-localització entre TERRA i TERT als meiòcits humans i de ratolí es produïa majoritàriament fora del complex telomèric. De la mateixa manera, es va analitzar la distribució de TERRA i TERT en espermatòcits de pacients diagnosticats amb infertilitat idiopàtica d’origen no obstructiu, els quals mostraren un menor nombre d’esdeveniments de recombinació en comparació amb els espermatòcits control. S’observà una reducció en els nivells de TERRA conjuntament amb una disrupció de la distribució telomèrica de TERRA i TERT en les cèl·lules dels individus infèrtils: mentre TERRA tendia a localitzar-se als telòmers, TERT tendia a dissociar-se’n. No obstant, ni el nombre de repeticions telomèriques ni l’associació de TERRA i TERT es veien afectades. Per tant, en base als nostres resultats, proposem que TERRA i TERT s’associarien amb els telòmers de les cèl·lules germinals humanes i de ratolí per tal de participar en el manteniment de l’estabilitat de l’estructura telomèrica durant els complexos esdeveniments cromosòmics que tenen llocs durant la meiosi i la gametogènesi. Alhora, donat que l’homeòstasi d’aquestes dues molècules es veu alterada a les cèl·lules germinals de pacients infèrtils, el seu anàlisi en meiòcits, conjuntament amb d’altres paràmetres, podria ser útil per a la determinació de l’origen de la infertilitat humana. / Telomeres are ribonucleoprotein complexes, composed by TTAGGG tandem repeats, a telomere-specific protein complex (shelterin) and telomeric noncoding RNA (TERRA) that cap the ends of eukaryote chromosomes preventing them from genomic instability and fusions. In mammalian germ cells, the maintenance of the telomeric structure is crucial for the proper progression of gametogenesis since telomeres are involved in homologous chromosomes pairing during the meiotic prophase I, also promoting their synapsis and recombination. In fact, disruption of telomere homeostasis leads to germ cells apoptosis and/or aneuploidy, and has been strongly related to reproductive aging. However, little is known on the mechanisms preserving telomere structure and length during mammalian gametogenesis so far. Thus, taking into account that TERRA is an integral component of the telomeric structure, and that telomerase is the enzymatic complex that elongates telomeres, the main objective of this work was to investigate whether these two molecules are implicated in the preservation of telomere homeostasis of mammalian germ cells. To this aim, mouse and human germ cells were analyzed by cytogenetic and molecular techniques throughout gametogenesis. Our results showed that both TERRA and the protein component of telomerase (TERT) localized at telomeres of germ cells. The distribution of TERRA in the nucleus would be subjected to a threshold that would depend on TERRA cellular levels and the cell gender (i.e. oocyte or spermatocyte), whereas TERRA transcription would be regulated according to the gametogenic stage and the telomere status per se. On the other hand, TERT highly localized at germ cells telomeres, especially in mouse, although no telomere elongation was observed in these cells throughout gametogenesis. Moreover, (scarce) TERRA and TERT co-localization occurred out of the telomeric complex in mouse and human meiocytes. In the same way, TERRA and TERT distribution was analyzed in human spermatocytes from patients diagnosed with idiopathic non-obstructive infertility, which showed fewer recombination events compared to spermatocytes of a control donor. A reduction in TERRA levels together with a disruption of the telomeric distribution of TERRA and TERT was observed in cells of infertile individuals. While TERRA was prone to localize at telomeres, TERT tended to dissociate from them. Nevertheless, neither the number of telomeric repeats nor TERRA-TERT association was affected in spermatocytes of infertile patients. Therefore, in the light of our results, we propose that TERRA and TERT would associate with telomeres of mouse and human germ cells to participate in the maintenance of the stability of telomere structure during the complex chromosome events taking place throughout meiosis and gametogenesis. Moreover, since the homeostasis of these two molecules is disrupted in germ cells from infertile patients, they could be useful to determine of the origin of human infertility by their analysis in meiocytes together with other parameters.

La guia axonal i la migració són dos processos similars i crucials per al desenvolupament. Aquests dos elements permeten el correcte posicionament cel•lular i la selecció de dianes essencial per a la funcionalitat posterior del sistema nerviós central, i es fonamenten en la regulació de l’avanç del con de creixement o la cèl•lula, respectivament, en resposta a estímuls externs, quimioatraients i quimiorepulsius, proporcionats per molècules de guia. Un altre component clau del funcionament neuronal és l’exocitosi, que permet la propagació dels estímuls nerviosos entre cèl•lules a través de la fusió de vesícules amb la membrana plasmàtica i l’alliberament de neurotransmissors. L’exocitosi està vehiculada per les proteïnes SNARE, que es troben a la membrana cel•lular i de la vesícula i que, a través de la unió paral•lela dels dominis catalítics, aproximen les membranes plasmàtica i vesicular possibilitant-ne la fusió Malgrat posseir la maquinària necessària per a l’exocitosi, les neurones en desenvolupament no presenten estructures especialitzades per a la transmissió del senyal com són les sinapsis, i es creu que el paper de les proteïnes del complex SNARE rau en el manteniment de la homeòstasi de membrana. Conceptualment, és fàcil pensar que la guia axonal i la migració actuïn a través del control precís de la dinàmica de la membrana, augmentant localment la superfície de la neurona i expandint-la en la direcció del creixement. En aquesta tesi hem investigat el paper de la dinàmica de membrana en la guia axonal i la migració. Concretament, ens hem centrat en l’estudi de la interacció del receptor de la Netrina-1 amb les proteïnes del complex SNARE en dos sistemes bàsics per a l’establiment de connexions del cervell: la guia dels axons de neurones de l’hipocamp i la migració de les neurones del llavi ròmbic atrets cap a una font de Netrina-1. També hem estudiat l’efecte del silenciament de les proteïnes del complex SNARE en dos paradigmes de guia axonal in vivo: la navegació dels axons de les cèl•lules comissurals de la medul•la espinal cap a, a través i més enllà de la línia mitja, i la innervació de l’extremitat inferior per part de les motoneurones d’embrions de pollastre. El tercer focus d’atenció ha estat l’estudi de la dinàmica de membrana i l’exocitosi al con de creixement de neurones d’hipocamp murí en resposta a estímuls quimioatraients de Netrina-1. Els resultats obtinguts durant aquesta tesi han demostrat que el receptor de la atractiu de la Netrina-1 DCC interacciona in vivo amb les proteïnes del complex SNARE Sintaxina1 i TI-VAMP, però no amb SNAP25 o VAMP2 en cèl•lules d’hipocamp i neurones migrants del llavi ròmbic inferior. A més, la interacció de DCC amb Sintaxina1 està regulada pel lligand, però l’exocitosi del receptor de Netrina-1 no es veu afectada per tractaments amb toxines que proteolitzen Sintaxina1. Hem descrit que les proteïnes del complex SNARE són imprescindibles per a la guia dels axons de neurones comissurals i motoneurones , perquè el silenciament de Sintaxina1, SNAP25, VAMP2 o TI-VAMP causa defectes en la navegació dels seus axons compatibles amb alteracions de diversos sistemes (molècula guia-receptor) de guia axonal. Per últim, hem descrit la dinàmica de membrana i l’exocitosi a nivell del con de creixement amb una tècnica innovadora, que permet la monitorització de l’exocitosi en temps real, i, i hem descrit com la Netrina-1 incrementa l’exocitosi dependent de proteïnes SNARE a nivell del con de creixement i les vies de senyalització que hi estan implicades. / Role of Synaptic Proteins and Exocytosis in Axon Guidance and Migration. Axon guidance and migration are two similar processes which are key to the development of the nervous system by allowing the correct localization and innervation of neurons. They regulate the elongation of the axon and the movement of cells by the use of guidance molecules which act as chemoattractants or chemorepellents at short and long ranges. A second crucial component in the nervous system functionality is exocytosis. It allows the communication of neighboring cells by the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane and the release of the vesicle contents to the extracellular space, a process mediated by the SNARE proteins. SNARE proteins located at the vesicle and the plasma membranes interact and bring the two membranes into close apposition, thereby facilitation fusion. Developing neurons have a vast array of synaptic proteins whose function is thought to reside in the regulation of membrane homeostasis. It is plausible to think that axon guidance and migration may act thru the precise control of membrane dynamics at discrete locations of the growth cone/leading edge, thereby expanding the neuron on the direction of growth. In this thesis we have analyzed the role of SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration. We have focused our studies in the analysis of the interaction between the guidance receptor DCC and SNARE proteins in the attraction of hippocampal axons and migrating neurons of the lower rhombic lip towards a Netrin-1 source. We have also studied the role of SNARE proteins in two axon guidance paradigms such as the navigation of commissural axons of the spinal cord and motoneurons. Furthermore, we have also investigated Netrin-1-induced exocytosis in growth cones using live imaging techniques. Our results demonstrate the necessary participation of SNARE proteins and SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration; reveal a ligand-regulated interaction between the Netrin-1 receptor DCC and the SNAREs Syntaxin1 and TI-VAMP; and show that Netrin-1 triggers SNARE-mediated exocytosis in the growth cone.

Los síndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) son dos síndromes de desarrollo y conducta que ocurren con una frecuencia 1/15.000-20.000 recién nacidos. Resultan de la pérdida física o funcional de genes regulados por la impronta dentro de la región 15q11-q13. SPW está asociado con la perdida de expresión de alelos paternos, mientras que el SA está asociado con la perdida de expresión de alelo materno. Aproximadamente el 70% de los pacientes SPW presentan deleción en el cromosoma paterno, el 20-30% disomía uniparental materna y el 1% defecto de impronta. En los pacientes SA el 70% presentan deleción en el cromosoma materno, el 6% disomía uniparental paterna, el 2-7% defecto de impronta, el 4-10% mutación del gen UBE3A y en el 10-12% la etiología es desconocida. El diagnóstico citogenético molecular de estos síndromes se realiza normalmente usando la combinación de varias técnicas debido a que la base genética es compleja. Nuestro laboratorio en 1991 inició los estudios de citogenética, en 1993 los estudios de FISH, en 1994 el análisis de microsatélites y en 1996 el análisis de metilación. De nuestra experiencia proponemos un algoritmo de diagnóstico molecular. Se han analizado entre los años 1991-2000, 151 pacientes y seis líquidos amnióticos con sospecha de SPW y 147 pacientes y dos líquidos amnióticos con sospecha de SA procedentes del territorio español. Las técnicas empleadas han sido el estudio del cariotipo mediante bandas G, la hibridación in situ fluorescente, el análisis de microsatélites y el análisis de metilación con detección quimioluminiscente. El diagnóstico de SPW se ha confirmado en 40 pacientes, 28 causado por deleción, cinco por disomía uniparental, dos por defecto de impronta y en cinco no se ha determinado la etiología. El SA se ha confirmado en 47 pacientes, 39 por deleción, cuatro por disomía uniparental y en cuatro no se ha determinado la etiología. Quince pacientes con sospecha de SA y estudio molecular normal han presentado una clínica típica SA, por lo que han sido considerados candidatos a presentar una mutación en el gen UBE3A o ser pacientes de etiología desconocida.Las características clínicas de los pacientes han sido recogidas por médicos especialistas, correlacionándola con la etiología. Los pacientes SPW con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a los otros grupos en hipotonía neonatal, obesidad, hiperfagia, retraso del desarrollo, hipogonadismo, manos y pies pequeños, anomalías dentales, saliva viscosa, alteraciones de comportamiento y problemas de sueño. Solo se han observado diferencias en problemas de alimentación (93% vs 50%, p=0.070) entre deleción y disomía uniparental, y en facies característica (100% vs. 50%, p= 0.069) entre pacientes con deleción y defecto de impronta. Los pacientes SA con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a las otras etiologías en retraso en el desarrollo y del lenguaje, ataxia, risa frecuente, aleteo de manos, hipermotricidad, poca atención, microcefalia, convulsiones, EEG anormal, occipital plano, boca ancha, babeo e hipopigmentación. Las frecuencias observadas han sido semejantes a las de estudios previos. En cambio, se han observado diferencias entre deleción y disomía uniparental en problemas de alimentación (100% vs. 0%, p=0.008), protusion de la lengua (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) y comunicación por gestos (23% vs. 75%, p=0.060). Estos resultados señalan que el dismorfismo facial y la comunicación por gestos son menos severos en los pacientes con disomía. Sin embargo, no podemos concluir que el fenotipo de estos pacientes sea menos severo que el de los pacientes con deleción.Este trabajo ha permitido un mayor conocimiento molecular y clínico de estos dos síndromes que ha llevado a que seamos centro de referencia y asesores de familias afectas. / Prader-Willi (PWS) and Angelman (AS) syndromes are distinct developmental and neurobehavioral syndromes that occur at a frequency of 1/15.000-20.000 live births. Both are a results of a loss of function of imprinted genes mapped to the chromosome region 15q11-q13. PWS is associated with a loss of expression of paternally derived alleles, whereas AS is associated with a loss of expression of maternal allele. The etiology is heterogeneous: approximately 70% of PWS patients present deletion in the paternal chromosome, 20-30% maternal uniparental disomy and 1% imprinting defect. In AS, 70% present deletion in the maternal chromosome, 6% paternal uniparental disomy, 2-7% imprinting defect, 4-10% mutation of the gene UBE3A and 10-12% have an unknown etiology. Molecular and cytogenetic diagnosis is currently performed using a combination of several techniques due to the complexity of the genetic basis of these syndromes. Our laboratory began in 1991 cytogenetics studies, in 1993 studies of FISH, in 1994 microsatellites analysis and in 1996 methylation analysis. Due to our experience an algorithm for molecular diagnostic was proposed. Between the years 1991-2000, we analyzed 151 patients and six amniocentesis with suspicion of PWS and 147 patients and two amniocentesis with suspicion of AS from Spain. The techniques used were G-banding karyotype, the fluorescent in situ hybridization (FISH), microsatellite analysis and methylation analysis with chemiluminescent detection. The diagnosis of PWS was confirmed in 40 patients, 28 with deletion, five with uniparental disomy, two with imprinting defect and in five the etiology was not been determined. AS diagnosis was confirmed in 47 patients, 39 with deletion, four with uniparental disomy and in four the etiology was not determined. Fifteen patients with suspicion of AS and normal molecular study had classical AS phenotype, and they were considered candidates to present a mutation in the gene UBE3A or unknown etiology. The clinical characteristics of the patients were registered by the specialist physician. The received information was correlated with the etiology. The PWS patients with deletion did not present significant differences from the other groups regarding neonatal hypotonia, obesity, hyperphagia, developmental delay, hypogonadism, small hands and feet, dental anomalies, viscous salivates, behavioural disorders and sleep disturbance. The only differences observed were in feeding problems (93% vs 50%, p=0.070) between deletion and uniparental disomy, and in facies characteristic (100% vs. 50%, p = 0.069) among patients with deletion and imprinting defect. AS patients with deletion did not present significant differences from the other etiologies in developmental delay, absent speech, ataxia, frequent laughing, flapping of hands, hypermotricity, little attention, microcephaly, seizures, abnormal EEG, occipital groove, macrostomia, drooling and hypopigmentation. The observed frequencies were similar to those of previous studies. On the other hand, differences were observed between deletion and uniparental disomy in feeding problems (100% vs. 0%, p=0.008), protruding tongue (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) and communication through gestures (23% vs. 75%, p=0.060). These results point out that the facial dismorfism and communication by gestures are less severe in the patients with disomy. However, we cannot conclude that the phenotype of these patients is less severe than that of the patients with deletion. This work gave us a greater molecular and clinical knowledge of these two syndromes allowing us to become a reference and advisory centre for affected families.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan tanto animales como humanos. Están causadas por unas partículas proteicas denominadas “priones”, resultantes de la transformación de la proteína priónica celular (PrP(C)) a una forma patogénica denominada PrP(SC), que se acumula en el cerebro en forma de agregados e induce la transformación de más moléculas a expensas de la reducción de los niveles de PrP(C). Hasta el día de hoy, el estudio de las prionopatías se ha centrado en la bioquímica, toxicidad y transmisibilidad de PrP(SC). Sin embargo, la pérdida de la proteína endógena puede también contribuir al desarrollo de la enfermedad. A día de hoy, la función fisiológica de PrP(C) está aún por esclarecer, aunque los análisis realizados la involucran en procesos de: i) ciclo celular y proliferación, ii) homeostasis del cobre, iii) neuroprotección, iv) transmisión sináptica y v) señalización intracelular, entre otros. Esta Tesis Doctoral aborda la función de PrP(C) en la regulación del ciclo celular y la neuroprotección, ampliando los conocimientos existentes mediante la descripción de las vías moleculares implicadas en ambos procesos. Nuestros datos describen a PrP(C) como una proteína capaz de integrar gran variedad de señales extracelulares y generar respuestas a través de la modulación de diferentes vías de señalización asociadas. Hemos observado como la modulación transitoria de los niveles de PrP(C) en una línea celular de neuroblastoma produce cambios dosis-dependientes sobre los mecanismos de proliferación celular. Estas alteraciones son debidas a la interacción de la proteína con EGFR y la consiguiente activación de las vías ERK1/2 y AKT, que incluyen entre sus dianas a elementos reguladores del ciclo celular. PrP(C) también parece ejercer cierta influencia sobre la formación de filopodios en este tipo celular, regulando la dinámica del citoesqueleto de actina por su acción sobre las Rho GTPasas, concretamente, vía Cdc42-N-WASP. Por otro lado, el uso de un modelo in vivo de excitotoxicidad por KA nos ha permitido entrar en detalle en la función neuroprotectora de PrP(C). Se conoce que tanto la susceptibilidad incrementada de los ratones Prnp-knockout a agentes convulsionantes como el daño neurotóxico derivado a nivel del hipocampo, son debidos a la activación de la vía JNK3 de muerte celular. Sin embargo, nuestros resultados obtenidos in vivo de ratones Prnp0/0 Jnk3+/+ y Prnp0/0 Jnk30/0 describen por primera vez la participación de PrP(C) en la modulación de esta vía de señalización. Hemos descrito como la proteína priónica interactúa a nivel postsináptico con la subunidad GluR6/7 de los receptores de glutamato, bloqueando por un lado la formación del complejo trimérico GluR6/7-PSD-95-MLK3 que lleva a la activación de la vía JNK3 y, por otro, modulando la actividad del receptor, que es un factor determinante de la excitabilidad neuronal incrementada propia de un episodio epiléptico. Esta Tesis Doctoral supone, por lo tanto, un avance en el conocimiento de la función fisiológica de PrP(C) y, consecuentemente, en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad priónica. La implicación de esta proteína en procesos proliferativos esenciales durante la neurogénesis así como en la regulación de la transmisión sináptica, deja entrever que PrP(C) es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los circuitos neuronales. Probablemente, las alteraciones derivadas de la reducción de los niveles de PrP(C) se suman a los efectos neurotóxicos de la agregación de PrP(SC), dando lugar al desarrollo de la enfermedad. Asimismo, la descripción de los mecanismos moleculares y vías de señalización reguladas por PrP(C) también abre las puertas a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de las EETs. / Transmissible spongiform encephalopathies constitute a group of fatal neurodegenerative disorders affecting both animals and humans. The causative agents of these diseases are “prions”, which are defined as proteinaceous infectious particles that result from an abnormal conformational folding of the cellular prion protein (PrPC) into a pathogenic form called PrPSC. Although the role of PrPSC has been intensively studied, the physiological function of PrPC still remains unclear. Several evidences support the notion that PrPC plays a role in different cellular processes including: i) cell cycle and proliferation, ii) copper homeostasis, iii) neuroprotection, iv) synaptic transmission and v) intracellular signaling, among others. Here we expand previous data concerning PrPC function by describing the molecular mechanisms by which PrPC regulates cell proliferation in vitro and excitotoxic cell death in vivo. First, we describe how transient overexpression of PrPC in Neuro2a cells enhances cell cycle progression after mitogenic stimulation, while the opposite effect is observed when PrPC is silenced. These effects are due in part to the interaction of PrPC with the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the cell membrane and the consequent downstream activation of ERK1/2 and protein kinase B (AKT) pathways. We also describe PrPC-dependent filopodia formation in Neuro2a cells through the modulation of AKT-Cdc42-N-WASP pathway. In a second study, we took advantage of the Prnp0/0Jnk3+/+ and Prnp0/0Jnk30/0 mice models to analyze the neuroprotective role of PrPC against kainate-induced epileptic seizures and cell death. Our results indicate that PrPC regulates kainate receptor-mediated neurotransmission through its interaction with the GluR6/7-PSD-95-MLK3 complex and the downstream modulation of JNK3 neurotoxic signaling. These new insights into the molecular functions of PrPC help us to understand the physiopathological events underlying prion disease and other related neurodegenerative pathologies.

Las biomembranas constituyen la estructura de separación fundamental en las celulas animales, y son importantes en el diseño de sistemas bioinspirados. Su simulación presenta desafíos, especialmente cuando ésta implica dinámica y grandes cambios de forma o se estudian sistemas micrométricos, impidiendo el uso de modelos atomísticos y de grano grueso. El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de un marco computacional para entender la dinámica de biomembranas inmersas en fluido viscoso usando modelos de campo de fase. Los modelos de campo de fase introducen un campo escalar contínuo que define una interfase difusa, cuya física está codificada en las ecuaciones en derivadas parciales que la gobiernan. Estos modelos son capaces de soportar cambios dramáticos de forma y topología, y facilitan el acoplamiento de distintos fenómenos físicos. No obstante, presentan desafíos numéricos significativos, como el alto orden de las ecuaciones, la resolución de frentes móviles y abruptos, o una eficiente integración en el tiempo. En esta disertación abordamos estos puntos mediante la combinación de una discretización espacial con métodos sin malla usando las funciones base locales de máxima entropía, y una formulación variacional Lagrangiana para acoplamiento elástico-hidrodinámico. La suavidad del método sin malla genera una aproximación precisa del campo de fase y puede lidiar fácilmente con adaptatividad local, la aproximación Lagrangiana extiende de manera natural esta adaptividad a la dinámica, y la formulación variacional permite una integración variacional temporal no linealmente estable y robusta. La implementación numérica de estos métodos en un entorno de computación de alto rendimiento ha motivado el desarrollo de un nuevo código computacional. Este código integra el estado del arte de las librerías en paralelo e incorpora importantes contribuciones técnicas para solventar cuellos de botella que aparecen con el uso de métodos sin malla en computación a gran escala. El código resultante es flexible y ha sido aplicado a otros problemas científicos en varias colaboraciones que incluyen flexoelectricidad, conformado metálico, fluidos viscosos o fractura en materiales con energía de superficie altamente anisotrópica. / Biomembranes are the fundamental separation structure in animal cells, and are also used in engineered bioinspired systems. Their simulation is challenging, particularly when large shape changes and dynamics are involved, or micrometer systems are considered, ruling out atomistic or coarse-grained molecular modeling. The main goal of this thesis is to develop a computational framework to understand the dynamics of biomembranes embedded in a viscous fluid using phase-field models. Phase-field models introduce a scalar continuous field to define a diffuse moving interface, whose physics is encoded in partial differential equations governing it. These models can deal with dramatic shape and topological transformations and are amenable to multiphysics coupling. However, they present significant numerical challenges, such as the high-order character of the equations, the resolution of sharp and moving fronts, or the efficient time-integration. We address all these issues through a combination of meshfree spacial discretization using local maximum-entropy basis functions, and a Lagrangian variational formulation of the coupled elasticity-hydrodynamics. The smooth meshfree approach provides accurate approximations of the phase-field and can easily deal with local adaptivity, the Lagrangian approach naturally extend adaptivity to dynamics, and the variational formulation enables nonlinearly-stable robust variational time integration. The numerical implementation of these methods in a high-performance computing framework has motivated the development of a new computer code, which integrates state-of-the-art parallel libraries and incorporates important technical contributions to overcome bottlenecks that arise in meshfree methods for large-scale problems. The resulting code is flexible and has been applied to other scientific problems in a number of collaborations dealing with flexoelectricity, metal forming, creeping flows, or fracture in materials with strongly anisotropic surface energy.

La conexión GABAérgica septohipocámpica es un elemento crucial para el correcto funcionamiento del hipocampo y, en concreto, para determinados procesos de aprendizaje y memoria. La exquisita especificidad de contacto de este componente es la piedra angular que determina su función, pero los datos existentes sobre los mecanismos que rigen la selección de diana y sinaptogénesis de estos axones son escasos. Aunque esta conexión desempeña un papel elemental en procesos cognitivos que están afectados durante el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer, en el momento en que iniciamos este proyecto había un sorprendente vacío en la literatura sobre el estado de la vía GABAérgica septohipocámpica en estas situaciones. Hemos establecido el modelo in vitro del desarrollo de la conexión septohipocámpica, mediante cultivos organotípicos que constan de septum, hipocampo y corteza entorrinal obtenidos de animales neonatales. La conexión septohipocámpica se forma en nuestro modelo in vitro manteniendo la exquisita especificidad de contacto de su componente GABAérgico. Hemos comprobado, mediante el uso de tejido proveniente de ratones knock-out para Semaforina 3C y mediante la aplicación de ectodominios bloqueantes de los receptores de Semaforina 3C, que esta molécula es prescindible para el proceso de sinaptogénesis específica de los axones GABAérgicos septohipocámpicos in vitro. Utilizando el cultivo puesto a punto también hemos demostrado que las aferencias de corteza entorrinal a hipocampo no son necesarias para que la conexión se forme de manera específica. Se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de la inervación y complejidad de las sinapsis de la conexión GABAérgica septohipocámpica sobre diferentes tipos de interneuronas del hipocampo de ratones wild-type a diferentes edades (2, 8 y 18 meses), así como de ratones de la cepa transgénica J20 (modelo murino de enfermedad de Alzheimer) a 2 y 8 meses de edad. Los resultados de estos experimentos muestran que durante el envejecimiento normal, en ratones wild-type de 18 meses, se produce una disminución tanto en el número de fibras GABAérgicas septohipocámpicas como en la complejidad de sus contactos sinápticos. Estos déficits de la conexión GABAérgica septohipocámpica se producen de manera acelerada en ratones J20, modelo de enfermedad de Alzheimer. En esta cepa transgénica, los déficits histológicos observados van acompañados de alteraciones funcionales: disminución en la potencia de los ritmos theta y gamma hipocámpicos. El análisis del estado funcional del hipocampo de ratones J20 demuestra que la sinapsis CA3-CA1 funciona normalmente en los animales transgénicos J20, aunque con alteraciones sutiles en la facilitación sináptica a corto plazo. Los procesos de potenciación a largo plazo (LTP) de esta sinapsis están aumentados en el modelo de EA. En un paradigma de condicionamiento operante de autoestimulación, en que los animales pueden autoadministrarse estímulos eléctricos reforzantes en el septum medial, los animales J20 presentan peor aprendizaje y ejecución de la tarea. Hemos demostrado que, en animales WT, este refuerzo operante se correlaciona con una disminución de la respuesta obtenida en la sinapsis CA3-CA1. Los transgénicos J20 no presentan tal disminución, especialmente durante los primeros días del test, y por tanto muestran peor aprendizaje y ejecución del paradigma de refuerzo operante, como se observa en nuestros resultados. En estos mismos animales, además, la inducción de LTP afecta negativamente la ejecución de la tarea reforzante ya adquirida, seguramente porque la excesiva respuesta de la sinapsis una vez potenciada cancela esa disminución de la respuesta en CA3-CA1 que es necesaria para que tenga lugar el refuerzo operante. / The septohippocampal connection is a crucial element for some learning and memory processes which are affected during aging and in Alzheimer’s disease. The GABAergic component of this pathway displays an exquisite target selection, contacting only the interneurons of the hippocampus, but the mechanisms responsible for this target selection are poorly known. In this work we have created an organotypic in vitro model of the septohippocampal connection, which has allowed us to demonstrate that neither Semaphorin 3C nor the entorhinal input to the hippocampus are factors needed for the establishment of proper contacts of the GABAergic septohippocampal pathway. The in vitro model created here also serves as a tool for studying developmental and degenerative processes of the nervous system. We have carried out an exhaustive analysis of the innervation and synapse complexity of the GABAergic septohippocampal pathway in wild-type mice during the aging process and in a mouse model of Alzheimer’s disease (J20 line). Our results show that both the number and complexity of the GABAergic septohippocampal contacts decrease during aging, and this process is accelerated in the J20 Alzheimer’s mouse model. In this transgenic strain, the histological deficits are accompanied by functional alterations: a diminution in the theta and gamma rhythms of the hippocampus. The function of the CA3-CA1 synapse of the hippocampus is normal in the J20 mice, except for subtle alterations in the short-term synaptic plasticity. The long-term potentiation processes (LTP) of this synapse are increased in the Alzheimer model. In an operant conditioning paradigm in which mice can self-stimulate the septohippocampal connection, transgenic mice of the J20 line show poorer learning and performance of the task than do wild-type mice. In nontransgenic mice, the reward in this task correlates with an increase in the CA3-CA1 response which J20 transgenic mice lack, possibly explaining their poorer performance.

S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat. / La levadura S. cerevisiae es un organismo modelo muy utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el citoesqueleto actina y su función biológica, ya que los mecanismos moleculares que controlan la organización del citoesqueleto de actina están conservados, por lo que muchos de los descubrimientos realizados en S. cerevisiae son aplicables también en eucariotas superiores. Una de las principales funciones biológicas de la actina en S. cerevisiae es la formación de una vesícula endocítica. En este organismo, la formación de los perfiles endocíticos primarios ocurre de forma simultánea con el ensamblaje de una estructura de actina compleja (módulo de actina) que incluye al complejo nucleador de actina Arp2/3. Diferentes estudios indican que la miosina-I Myo5 junto su co-activador Vrp1 activan al complejo Arp2/3 produciendo la elongación del perfil endocítico. Nuestro laboratorio ha demostrado que el dominio C-terminal de Myo5 inmovilizado en la superficie de bolas de sefarosa induce el ensamblaje del módulo de actina en presencia de extracto de levadura. El análisis del ensayo demostró además que Myo5 está fosforilada por la quinasa CK2 en la S1205. En este estudio hemos caracterizado la actividad CK2 que fosforila a Myo5 en la S1205 y hemos investigado el significado funcional de dicha fosforilación in vivo e in vitro. Nuestros resultados indican que una actividad CK2 asociada a partículas, que incluye la subunidad catalítica Cka2 pero no Cka1 ni las subunidades reguladoras Ckb1 y Ckb2 fosforila la S1205 de Myo5. Esta fosforilación perturba la interacción entre Myo5 y su co-activador Vrp1, regulando negativamente la formación de las estructuras de actina complejas in vitro, y consistentemente, disminuyendo la velocidad de la internalización endocítica in vivo. Además, nuestros resultados también sugieren que Cka2 seguramente tiene otras dianas además de Myo5, y que su actividad podría regular otras fases iniciales durante la formación de la vesícula endocítica.

Les glutaredoxines són enzims que intervenen en reaccions redox i que la sevafunció principal consisteix en protegir les cèl·lules contra estrès oxidatiu mitjançant elmanteniment de l'estat redox adequat dels grups sulfidril de les proteïnes cel·lulars.Treballs anteriors han descrit l'existència de dues glutaredoxines en el llevatSaccharomyces cerevisiae, Grx1 i Grx2, que contenen dues cisteïnes en el seu centreactiu les quals són essencials per a mantenir la seva funció. Aquestes duesglutaredoxines juguen diferents papers en la cèl·lula en la protecció contra estrèsoxidatiu.Aquest treball consisteix en l'estudi i caracterització d'una nova família deglutaredoxines en S. cerevisiae, formada per Grx3, Grx4 i Grx5, que es diferencia de laja descrita perquè les proteïnes tenen una única cisteina en el seu centre actiu. S'harealitzat un anàlisi comparatiu de les seqüències de les dues famílies de glutaredoxinesde llevat amb les existents en altres organismes, i s'ha vist que l'estructura bàsica de lesmateixes està conservada des de bacteris a humans. L'anàlisi funcional dels mutantsd'aquesta nova família ha revelat que, de les tres glutaredoxines monotiòliques, Grx5 ésla que desenvolupa una funció més important en la protecció contra estrès oxidatiu,clarament diferenciada de Grx3 i Grx4. Grx5 s'ha vist localitzada en la mitocòndria,essent aquesta localització indispensable per al normal funcionament de l'enzim. Grx3 iGrx4, en canvi, es troben al nucli. D'acord amb la sublocalització cel·lular, es mostrendiferents evidències de què Grx5 es troba directament implicada en la biosíntesi delscentres Fe/S, que en llevats té lloc a la mitocòndria. Els mutants mancats de Grx5 sóndefectuosos en l'activitat d'enzims amb centres Fe/S i acumulen en excés de ferro, tantal citosol com a la mitocòndria. Estudis mitjançant la tècnica del doble-híbrid handemostrat una interacció física entre Grx5 i Isa1, una altra proteïna de la matriumitocondrial que intervé en la síntesi dels centres Fe/S. Les dades existents indiquenque les glutaredoxines monotiòliques poden portar a terme funcions especialitzadescada una d'elles en diferents compartiments del llevat, sense excloure la possibleredundància funcional entre Grx3 i Grx4. / Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacciones redox y cuyafunción principal consiste en proteger las células contra estrés oxidativo a través delmantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínascelulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en lalevadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en sucentro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dosglutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrésoxidativo.El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familiade glutaredoxinas en S. cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia dela ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se harealizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias deglutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que laestructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisisfuncional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tresglutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en laprotección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se havisto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normalfuncionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. Enconcordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levadurastiene lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en laactividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en elcitosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido handemostrado una interacción física entre Grx5 e Isa1, otra proteína de la matrizmitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntana que las glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cadauna de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posibleredundancia funcional entre Grx3 y Grx4. / Glutaredoxins are enzymes involved in redox reactions, whose main functionconsists of protecting cells against oxidative stress through maintaining a normal redoxstatus of sulfhydril groups in cellular proteins. Previous work has described twoglutaredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Grx1 and Grx2, that contain twocysteines residues in their active site, which are essential for their enzymatic function.These two glutaredoxins play different roles in protecting cells against oxidative stress.The present work consists of the study and characterisation of a new family ofglutaredoxins in S. cerevisiae, composed by Grx3, Grx4 and Grx5. These have a singlecysteine in the active site of the protein, in contrast to the previous glutaredoxins. Acomparative analysis of the sequences of the two families of the yeast glutaredoxinsand the glutaredoxins of other organisms has been carried out, and the basic structure ofthese enzymes is indeed conserved from bacteria to humans. The functional analysis ofmutants of this new family reveals that Grx5 is the most important monothiolicglutaredoxin in protecting cells against oxidative stress, and that its function is differentfrom that of Grx3 and Grx4. Grx5 is located in mitochondria and this localisation isneeded for the normal function of the enzyme. In contrast, Grx3 and Grx4 are located atthe nucleus. According to the subcellular location, several evidences are showndemonstrating that Grx5 is directly involved in the biosynthesis of Fe/S clusters, whichtakes place at the mitochondrial matrix in yeast. The grx5 mutants are defective in theactivity of Fe/S enzymes and accumulate iron both in mitochondria and cytosol. Twohybridassays show that there is a physical interaction between Grx5 and Isa1, anothermatrix mitochondrial protein that participates in the synthesis of Fe/S clusters. All thesedata suggest that monothiolic glutaredoxins play specialised functions in differentcompartments of yeast, which does not exclude the possibility that Grx3 and Grx4 couldbe functionally redundant.

La apoptosis es un mecanismo fisiológico que contribuye a regular el número de células de un organismo de tal forma que aquéllas que realizan funciones transitorias, que están lesionadas, o en exceso, serán eliminadas. Éste es un proceso estrictamente regulado durante el desarrollo embrionario e íntimamente ligado con el inicio o progresión de determinadas patologías. Así pues, el exceso de apoptosis contribuye al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas mientras que su defecto sería el origen de neoplasias. El principal regulador del proceso apoptótico es la activación de las caspasas, cisteína-proteasas con especificidad para residuos de aspartato. Los principales mecanismos que activan las caspasas son la salida de citocromo C de la mitocondria por una alteración de la función mitocondrial, y la activación de proteínas de membrana denominadas receptores de muerte (DRs, Death Receptors). Estos últimos han sido ampliamente caracterizados en el sistema inmune, mientras que en tejidos como el sistema nervioso sus funciones están en las fases iniciales de caracterización.El objetivo del presente trabajo es contribuir a esclarecer los mecanismos moleculares que regulan la actividad de estos receptores en el sistema nervioso, a través de la caracterización funcional de dos nuevas proteínas, FAIM y Lifeguard, propuestas inicialmente como antagonistas del receptor de muerte CD95/Fas/APO-1. Para ello se han usado las líneas celulares PC12 y SH-SY5Y, ampliamente utilizadas en modelos de diferenciación y muerte celular, junto con cultivos primarios de neuronas corticales y neuronas granulares de cerebelo.En la primera parte de este trabajo se describe la clonación del ortólogo de ratón de Lifeguard, y su caracterización como antagonista funcional de CD95 en el sistema nervioso. Hemos demostrado que su sobreexpresión es capaz de bloquear la muerte inducida por CD95 en el modelo del neuroblastoma humano SH-SY5Y así como en neuronas corticales murinas. También hemos comprobado que la disminución de sus niveles endógenos sensibiliza a las neuronas granulares y las corticales de ratón. Además, se ha constatado que su mecanismo molecular de acción depende de su localización exclusiva en microdominios de membrana llamados Lipid Rafts, donde puede interaccionar con CD95 e inhibir la activación de caspasas iniciadoras.De los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo se deduce que los niveles de la isoforma larga del antagonista FAIM, FAIML, específica del sistema nervioso, aumentan durante el desarrollo embrionario. Su máxima expresión es en los períodos del desarrollo en los que se modelan y ajustan las estructuras neurales que darán lugar al cerebro adulto. Funcionalmente, hemos demostrado que no participa en procesos de neuritogénesis (a diferencia de la isoforma corta de FAIM, FAIMS) y que no bloquea la muerte apoptótica inducida a través de estímulos mitocondriales. Sin embargo, FAIML es capaz de antagonizar la apoptosis inducida a través de los DRs CD95 y TNFR1. Los ensayos >con RNA de interferencia nos han permitido elucidar que FAIML es, al menos en parte, responsable del bloqueo de la actividad de caspasas iniciadoras activadas por DRs.Por tanto, este trabajo aporta claves sobre las bases moleculares que regulan la actividad de los DRs en el sistema nervioso y que pueden constituir una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas en neuropatologías en las que los DRs participan de forma relevante. / Apoptosis is a physiological process by which the number of cells in metazoan organisms is regulated. Thus, cells with transient function, supranumerary cells or damaged ones are selectively eliminated by this process. Apoptosis is strictly regulated and recently it has been suggested that it could be involved in the pathogenesis of some nervous system diseases. In that sense, an excess of cell death could contribute to neurodegenerative disorders and, on the other hand, a defect could be one of the reasons for neoplasia development. The main regulator of apoptosis is the activation of caspases. These are cysteine-proteases which have cleavage specificity for aspartic residues. Caspases are activated by two main mechanisms: (1) release of citocrome C from altered mitochondria to the cytoplasm and (2) activation of membrane receptors called death receptors (DRs). These proteins have been widely characterized in the immune system, whereas in the nervous system their functions are at the initial stages of characterization.The present project is focussed on the characterization of two novel antagonists of the death receptor CD95/Fas/APO-1 which are specifically expressed in the nervous system, Lifeguard and FAIM. For this purpose PC12 and SH-SY5Y cell lines, widely used in models of differentiation and cell death, have been used along with primary cultures of cortical neurons and cerebellar granule neurons.Results obtained in the first part of this study allowed us to clone mouse Lifeguard, and describe its function as an antagonist of CD95 in the nervous system. We have demonstrated that its overexpression is able to block CD95 induced cell death in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, and in mouse embryonic cortical neurons. Furthermore, reduction of Lifeguard endogenous levels sensitizes both, mouse granular and cortical neurons to CD95 induced apoptosis. In addition, it has been stated that the molecular mechanism of action of Lifeguard depends on its exclusive location in plasma membrane microdomains called Lipid Rafts, where it can interact with CD95 and inhibit the activation of initiator caspases.In the second part of this study, our results demonstrate that the expression of the long form of the CD95 antagonist FAIM, FAIML, specific of the nervous system, increases during the embryonic development. It reaches maximum levels in the periods of the development in which the neural structures are being defined, thus creating adult brain structures.Functionally, we have demonstrated that FAIML, in contrast to the short form of FAIM (FAIMS), does not participate in neurotrophic factor induced neurite outgrowth and it is not able to block apoptotic induced cell death through mitochondrial stimuli. Nevertheless, FAIML is able to antagonize the apoptosis induced through DRs CD95 and TNFR1. FAIML RNA interference efficiently reduced its endogenous levels and allowed us to conclude that FAIML is one of the molecules responsible for maintaining initiator caspases inactive upon receptor engagement.Therefore, this work will contribute to the understanding of the molecular basis for DRs activity regulation in the nervous system, and it could constitute a starting point for the development of new therapeutic strategies for DRs associated neuropathologies.

L’endometri és el revestiment interior de la mucosa de l’úter. Histològicament, en l’endometri podem diferenciar dos tipus cel·lulars epitelials: l’epiteli luminal i l’epiteli glandular. Els teixits epitelials es caracteritzen per ser teixits polaritzats que presenten unes característiques morfològiques distingibles com són: polarització apico-basal, contactes cèl·lula - cèl·lula específics i adhesió a la membrana Basal. El primer objectiu d’aquest treball va ser la creació d’un cultiu en tres dimensions (3D) de cèl·lules epitelials d’endometri de ratolí, que permetés la possibilitat d’estudiar els diferents processos relacionats amb la morfogènesi i carcinogènesi endometrial. Un cop desenvolupat el sistema de cultiu, vam estudiar els factors extracel·lulars que influïen en la correcta formació del lumen glandular, així com l’establiment de la polaritat de les cèl·lules epitelials que formen les glàndules. D’aquesta manera hem pogut determinar un nou paper de les citocines TNF-α i IL-1α en la formació i manteniment del lumen. A més a més, també hem pogut demostrar que els glucocorticoides són els encarregats de reprimir l’expressió d’aquestes citocines a través de l’acció del receptor d’estrògens. En segon lloc, hem utilitzat el model de cultiu desenvolupat per estudiar aspectes relacionats amb la polaritat cel·lular i la carcinogènesi. Recentment s’ha suggerit que l’establiment de la polarització cel·lular podria actuar com a supressor tumoral mentre que la pèrdua de la mateixa, és un reconegut marcador de la progressió tumoral. Per aquest motiu, i utilitzant el nostre sistema de cultiu, vam voler caracteritzar l’acció del TGF-β tant en cèl·lules polaritzades com en no polaritzades. En aquest treball demostrem que la pèrdua de la polaritat canvia la resposta pro-apoptòtica del TGF-β en cèl·lules polaritzades a una resposta associada a la progressió del fenotip tumoral (EMT) en cèl·lules no polaritzades. Finalment vam voler estudiar els efectes de l’hiperestrogenisme en relació a pèrdues del gen supressor de tumors PTEN en la carcinogènesi endometrial. Per una banda, les pèrdues del supressor tumoral PTEN constitueixen una de les principals alteracions en el carcinoma d’endometri. Per altra banda, l’hiperestrogenisme és un conegut factor de risc en el desenvolupament de neoplasies endometrials. Tanmateix, no està clara si l’acció de l’estradiol sobre les cèl·lules epitelials, és directa o és dóna a través d’un efecte paracrí de les cèl·lules del estroma; i si la pèrdua d’expressió de PTEN té repercussió en els efectes produïts pels estrògens sobre l’endometri. Per aquest motiu, vam voler investigar els efectes de l’estradiol en cèl·lules polaritzades que creixen en un medi definit, sense la interferència de factors paracrins provinents de les cèl·lules de l’estroma. Els nostres estudis indiquen que l’estradiol i la Insulina cooperen en la regulació de la proliferació de cèl·lules endometrials a través del receptor d’estrògens α. A més a més, pèrdues al·lèliques en PTEN donen lloc a una proliferació desmesurada en resposta a Insulina i estradiol, similar a la que es troba en les hiperplàsies endometrials. Fa més d’una dècada que es va suggerir, per primera vegada, la rellevància de la polarització cel·lular a l’hora d’entendre els mecanismes involucrats en la morfogènesi cel·lular així com en la progressió tumoral. Tot i això, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats en aquest processos. En aquest context, el nostre treball és important perquè: per primer cop, hem generat un cultiu en 3D de cèl·lules no immortalitzades i no transformades; hem determinat quins són els factors extracel·lulars involucrats en el manteniment i formació de la cavitat luminal; hem aportat evidencies què la polaritat epitelial actua com a supressor tumoral no canònic i; hem demostrat que pèrdues en PTEN causen una hiperplàsia de les cèl·lules endometrials en resposta a l’exposició a l’estradiol i la Insulina. / El endometrio es el revestimiento interior de la mucosa del útero. Histológicamente en el endometrio podemos diferenciar dos tipos celulares epiteliales: el epitelio luminal y el glandular. Los tejidos epiteliales se caracterizan por ser tejidos polarizados que presentan unas características morfológicas distinguibles como son: polarización apico-Basal, contactos célula - célula específicos y adhesión a la membrana Basal. El primer objetivo de este trabajo fue la creación de un cultivo en tres dimensiones (3D) de células epiteliales de endometrio de ratón, que presentara algunas ventajas a los cultivos ya existentes, a la vez que permitiera la posibilidad de estudiar los diferentes procesos relacionados con la morfogénesis y la carcinogénesis endometrial. Una vez obtenido el sistema de cultivo, quisimos estudiar los factores extracelulares que influían en la correcta formación del lumen de las glándulas, así como el establecimiento de la polaridad de las células epiteliales que forman las glándulas. De esta manera hemos podido determinar un nuevo papel de las citoquinas TNF-α y IL-1α en la formación y mantenimiento del lumen. Además, también hemos podido concluir que los glucocorticoides son los encargados de reprimir la expresión de estas citoquinas a través de la acción del receptor de estrógenos. En segundo lugar, utilizamos el modelo de cultivo desarrollado, para estudiar aspectos relacionados con la polaridad celular y la carcinogénesis. Recientemente se ha sugerido que el establecimiento de la polarización celular podría actuar por si misma como un supresor tumoral, mientras que la pérdida de dicha polarización es un reconocido marcador de la progresión tumoral. Por este motivo, y utilizando nuestro sistema de cultivo, quisimos caracterizar la acción del TGF-β tanto en células polarizadas como en no polarizadas. En este trabajo demostramos que la pérdida de la polaridad, cambia la respuesta pro-apoptótica del TGF-β en células polarizadas a una respuesta asociada a la progresión del fenotipo tumoral (EMT) en células no polarizadas. Finalmente quisimos estudiar los efectos del hiperestrogenismo en la tumorogénesi endometrial. El hiperestrogenismo es un factor de riesgo muy importante en el desarrollo de neoplasias endometriales. Sin embargo, no está claro si la acción del estradiol es directa o se da mediante un efecto paracrino de las células del estroma. Por este motivo, quisimos investigar los efectos del estradiol en células polarizadas que crecían en un medio definido, sin la interferencia de factores paracrinos procedentes de las células del estroma. Gracias a nuestro estudio, hemos podido determinar que la acción del estradiol mediante el receptor de estrógenos alpha, actúa por debajo de la acción de PTEN en la tumorogénesis endometrial. Hace más de una década se sugirió, por primera vez, la relevancia de la polarización celular a la hora de entender los mecanismos involucrados en la morfogénesis celular así como la progresión tumoral. Sin embargo, hoy en día todavía se desconocen muchos de los mecanismos involucrados en estos procesos. En este contexto, nuestro trabajo es importante porque: por primera vez hemos generado un cultivo en 3D de células no transformadas, hemos determinado cuáles son los factores extracelulares involucrados en el mantenimiento y formación de la cavidad luminar, hemos aportado evidencias de que la polaridad epitelial actúa como supresor tumoral no canónico y que el hiperestrogenismo ligado a una deficiencia en la expresión de PTEN da lugar a un fenotipo de hiperplasia. / The endometrium is innermost glandular layer of the uterus. It functions as a lining for the uterus. Histologically, we can distinguish two types of epithelial cells: luminal and glandular epithelium. The epithelial tissues have some distinct morphological features such as: apico-Basal polarity, cell-cell specific contacts and adhesion to the basement membrane. The first objective of this work was to establish a three dimensional culture (3D) of mouse endometrial epithelial cells suitable for the study of endometrial morphogenesis and carcinogenesis. Once the 3D culture protocol was established, our next step was to analyze the influence of the extracellular factors in the formation and maintenance of the glandular lumen. To this regard, we have identified a new role of cytokines TNF-α and IL-1α in the formation and maintenance of the lumen. In addition, we demonstrate that glucocorticoids are the responsible of cytokine down-expression, in an estrogen receptor alpha dependent manner. Our next step was to use our culture model to study the issues related with the cellular polarity and malignance development. Recently it has been suggested that the establishment of cell polarization is a potent tumor suppressor mechanism. Loss of this polarization is a wellknown marker of tumor progression. Taking advantage of our 3D culture system, we sought to characterize the action of TGF-β in both polarized cells and in non-polarized. In this study, we show that loss of polarity changes the pro-apoptotic response of TGF-β (in polarized cells) to a response associated with tumor progression phenotype (EMT) in non-polarized cells. Finally we wanted to study the effects of hyperestrogenism. Hyperestrogenism represent a major risk for development of endometrial neoplasia. However, it is unclear whether estradiol action occurs direct or trough a paracrine effect of stromal cells. For this reason, we wanted to investigate the effects of estradiol on polarized cells growing in a defined medium without interference of paracrine stromal factors. With our study, we could conclude that estradiol trough its receptor, acts as downstream mediator on PTEN mediated tumorogenesis. More than one decade ago, cell polarization was as an important mechanisms involved in cellular morphogenesis and tumor progression. However, most of the mechanisms involved in these processes are still unknown. Our study provides new insights about mechanisms involved in those processes. In this context, we have generated, for the first time, a 3D culture from untransformed cells, we have determined the extracellular factors involved in maintaining and formation of the luminal cavity, we have provided evidence that epithelial polarity acts as a non-canonical tumor suppressor and PTEN deficient expression leads an exacerbated response to estrogen, which leads to loss of cell polarity and glands structure, two alterations observed in cancer.