Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / El tráfico de membrana en el cono crecimiento axonal es clave durante el desarrollo del sistema nervioso. La familia de proteínas SNARE son una familia de moléculas cuya función principal es mediar la fusión entre membranas. Este hecho hace que las proteínas SNARE tengan potencialmente tengan un papel en el desarrollo axonal y otros procesos que impliquen una gran actividad en los procesos de tráfico de membrana: un ejemplo de casos como así es la progresión de tumores con un alto grado de recambio de membrana como el glioblastoma, que es el caso más común y mortal de astrocitoma de grado IV. Las proteínas SNAREs se clasifican en dos grupos t-SNARE (localizadas en las membranas objetivo) y v-SNARE (localizadas en las membranas vesiculares) y juntas median la fusión entre membranas a través de la formación del complejo SNARE. El complejo SNARE mejor caracterizado es el tetrámero formado por Sintaxina1 (Stx1), dos SNAP-25 y VAMP2. En esta tesis doctoral estudiamos en primer lugar el papel de las proteínas SNARE en los procesos de guía axonal. Para ello utilizamos como modelo el desarrollo del sistema nervioso embrionario en Drosophila melanogaster y obtuvimos como resultado que problemas en las proteínas SNARE, especialmente en Sintaxina1A (Syx1A), generan problemas de guía axonal en el sistema nervioso. Si nos centramos en los estudios del desarrollo del sistema nervioso en mutantes nulos para Syx1A, todas las estructuras nerviosas desde el sistema nervioso central, los nervios motores y el sistema periférico desarrollaron problemas de guía axonal. Además, estudios de interacción génica y una detalla caracterización del fenotipo sugieren que la alteración de las proteínas SNARE, especialmente Syx1A, genera problemas en la vía de guía axonal Slit/Robo. En segundo lugar, estudiamos el rol de las proteínas SNARE en la progresión tumoral. Pare ello analizamos los efectos in vitro e in vivo que tiene el bloqueo de la función de Stx1 en líneas celulares y modelos murínicos del glioblastoma Como resultado, detectamos una pérdida de la proliferación in vitro e in vivo al bloquear Stx1. Además, el bloqueo de Stx1 disminuye la capacidad invasiva in vitro de las células de glioblastoma. / The membrane delivery/traffic in the growth cone is a key element during axons development. SNARE family proteins may be important players in this process since they mediate the fusion of membrane vesicles with their targets. Moreover, since membrane trafficking is a key element during the progression of several tumors, SNAREs may be important also during tumoral progression. Two groups form the SNARE family: t-SNARE (Syntaxins, SNAPs…) located in the target membranes, and, v-SNARE (VAMPs), located in the vesicles. Complexes between specific t- and v- SNAREs are formed which ultimately leads to the fusion of vesicles with their target membranes. The best-characterized SNARE complex is the tetramer formed by syntaxin1 (Stx1), two SNAP-25 and VAMP2, which mediates the fusion of synaptic vesicles during the exocytosis of neurotransmitters. In order to study the role of SNARE in axon guidance we used as a model Drosophila melanogaster embryonic nerve system development. Embryos mutant for SNARE proteins developed axon guidance defects. From all the stocks, Syx1A had a severe phenotype in comparison with the other mutants. Syx1A null embryos developed axon guidance problems in all the nerve system structures: ventral nerve cord, motor axons or peripheral nerves. In addition, a deep analysis of the phenotype and genetic interaction studies suggest that Syx1A mutants have problems in Slit/Robo axon guidance pathway. In order to study the role of SNARE protein in tumoral progression we studied in vitro and in vivo the effect of Stx1 inactivation in glioblastoma models (glioblastomas are the most common and deadliest astrocitomas). Our results show that the loss of function in Stx1 decreases in vitro and in vivo glioblastoma progression and it blocks in vitro cellular invasion.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / The quality of life of a significant proportion of IBD patients is poor as a result of persistent disease activity and repeated surgery, among others. Current treatments for Crohn’s disease are not able to neither prevent this serious impact nor improve the long term prognosis of a significant proportion of patients. Therefore, new therapeutic approaches are needed in order to modify the immune response of these patients. We hypothesize that administration of ex-vivo generated autologous tol-DCs to Crohn’s disease patients may arrest Th1 lymphocyte proliferation and therefore may restore specific tolerance against non-pathogenic antigens in the gut. The overall objective of this thesis was to generate and characterize tol-DCs for the purpose of implementing an autologous immunotherapy treatment for Crohn’s disease patients. In the first study, we described the generation of tol-DCs from healthy donors and Crohn’s disease patients by use of clinical-grade reagents in combination with dexamethasone as immunosuppressive agent and characterized their functional properties. Our main findings demonstrated that the combination of dexamethasone with a specific cytokine cocktail yields clinical-grade DCs with the following characteristics: a semi-mature phenotype, a pronounced shift towards anti-inflammatory versus inflammatory cytokine production and low T-cell stimulatory properties. This characteristic tolerogenic profile is maintained when tol-DCs are activated using heat-inactivated Gram-negative bacteria as maturative stimulus. Whole microorganisms contain multiple PAMPs capable of stimulating DCs by different pathways. Our results clearly showed a strong inhibitory effect on DC phenotype, a robust inhibition of pro-inflammatory cytokines, increased IL-10 secretion, and inhibition of T-cell proliferation and Th1 induction. Interestingly, we showed that tol-DCs have reduced immunogenic capacity in autologous, allogeneic and antigen-specific T-cell responses. We further evaluated the ability of tol-DCs to induce CD4+ T-cell hypo-responsiveness. Our results demonstrated that T-cells or antigen-specific T-cells previously cultured with tol-DCs are anergic exhibiting a reduced capacity to proliferate as well as reduced IFN-gamma secretion when rechallenged with fully competent mDCs. With regard to tol-DCs clinical application, we importantly found that their tolerogenic properties remain stable after washing out dexamethasone and subsequent restimulation with LPS, CD40L or different Gram-negative enterobacteria strains. All these properties led us to conclude that this cell product is suitable to be tested in clinical trials of immune-based diseases such as Crohn’s disease. We further identified a positive biomarker for tol-DCs, MERTK receptor is highly expressed on clinical grade dexamethasone-induced human tol-DCs and contributes in their tolerogenic properties. Our results demonstrated that MERTK expression in human DCs is regulated by glucocorticoids and described a new function of this receptor in directly regulating T-cell response. Interestingly, our findings showed that neutralization of MERTK with monoclonal antibodies in allogeneic MLR cultures leads to increased T-cell proliferation and IFN-gamma production. The direct regulation of T-cell response was confirmed by the use of recombinant MERTK-Fc protein, used to mimic MERTK on DCs. Our results remarkably showed that MERTK-Fc suppresses naïve and antigen-specific memory Tcell proliferation and activation. These findings identified a new non-cell autonomous regulatory function of MERTK expressed on DCs. Additionally, we described that this regulation is mediated by the neutralization of MERTK soluble ligand PROS1. We also found that MERTK is expressed on T-cell surface and that PROS1 drives an autocrine pro-proliferative effect on these cells. In summary, the results of this work demonstrated that MERTK on DCs regulates T-cell activation and expansion through the competition for PROS1 interaction with MERTK in the T-cells. We showed that MERTK expression in human DCs has a key role in instructing adaptive immunity and identified MERTK as a potent suppressor of T-cell response. Therefore targeting MERTK may provide an interesting approach to effectively increase or suppress tolerance for the purpose of immunotherapy. / Esta tesis doctoral estudia el proceso de generación de células dendríticas tolerogénicas en grado clínico, con el objetivo de establecer un protocolo destinado al tratamiento de la enfermedad de Crohn. El estudio realizado ha permitido la caracterización de dichas células y sus propiedades tolerogénicas, incluyendo la descripción novedosa de un marcador de células tolerogénicas y el estudio de sus propiedades funcionales relacionadas con la inducción de tolerancia.

Al llarg dels darrers anys, s’ha demostrat que la fragmentació del DNA espermàtic té un paper important en la infertilitat masculina. A més, sembla lògic que trencaments en el DNA espermàtic poden comprometre la viabilitat del zigot, afectant al desenvolupament embrionari. Tenint en compte la hipòtesi que els trencaments de cadena senzilla i doble del DNA poden tenir efectes diferencials en la clínica del pacient, s’han desenvolupat diferents objectius: i) quan a metodologies, ii) efectes clínics en diferents grups de pacients, iii) aspectes bàsics dels trencaments de doble cadena, i iv) la relació amb la compactació del DNA. Com a aspectes rellevants, s’han establert valors llindar per la detecció d’infertilitat mitjançant les diferents metodologies d’anàlisi de la fragmentació del DNA, i s’ha descrit l’efecte clínic de la fragmentació de doble cadena del DNA espermàtic en humans i s’ha proposat un mecanisme bàsic, utilitzant un model de ratolí. Els diferents resultats han conclòs que aquest tipus de trencaments és responsable d’un increment en el risc d’avortament associat al factor masculí. Aquests descobriments han permès desenvolupar noves eines diagnòstiques que permeten un millor consell reproductiu, així com la possibilitat de recerca de possibles tractaments per pal·liar aquest efecte. / In the recent years, it has been demonstrated that sperm DNA fragmentation plays an important role in male infertility. Moreover, it seems logical that sperm DNA breaks can compromise the zygote viability and affect to embryonic development. In this sense, taking into account that single and double stranded DNA breaks may have different clinical effects, different objectives have been developed: i) regarding methodologies, ii) clinical effects on patients, iii) basic aspects of double stranded DNA breaks, and iv) in relation to sperm DNA compaction. The most relevant results have been the establishment of cut-off values for male infertility diagnosis for the most common DNA fragmentation methodologies, and the description of the clinical effect of double stranded DNA breaks in humans, and its basic mechanism using a murine model. The different results concluded that these double stranded DNA breaks are responsible from an increase on male factor miscarriage risk. These findings allowed developing new diagnostic tools for a better reproductive counseling, as well as to open new research pathways on male infertility treatments

Tesis por compendio de publicaciones / Para poder entender el efecto de los parásitos sobre los hospedadores y la evolución de las interacciones parásito-hospedador es necesario comprender primero el efecto de los factores ambientales sobre estos organismos y su interacción, lo que a su vez requiere considerar tales factores a la escala adecuada según los organismos implicados. El objetivo principal de esta tesis es estudiar el efecto de factores abióticos, particularmente la temperatura, en la regulación de la diapausa del ectoparásito Carnus hemapterus. Este insecto es un díptero hematófago generalista con amplia distribución geográfica que parasita a los pollos de una gran variedad de especies aviares (en su mayoría trogloditas). El trabajo se desarrolló en una localidad árida del sureste de España (desierto de Tabernas), donde coexisten entremezclados tres tipos de hábitats (oquedades naturales en taludes de ramblas, cavidades en construcciones humanas, - principalmente puentes - y cajas nido) ocupados por Carnus hemapterus y sus hospedadores aviares. Como primer paso se determinó mediante sensores el microclima de las tres cavidades donde Carnus desarrolla su diapausa. Las características microclimáticas mostraron notables diferencias, siendo las cajas nido más inestables (frías y con marcada oscilación térmica), mientras que las otras oquedades fueron mucho más estables, presentando las cavidades en taludes condiciones más cálidas y secas que las de puentes. Esta heterogeneidad ambiental tiene importantes implicaciones tanto para los organismos endotermos que las habitan como para los ectotermos. Mediante experimentos de campo realizados con diversos hospedadores se comprobó en condiciones naturales la coexistencia de diapausas largas y cortas. Dado que la duración del ciclo de vida y número de generaciones al año (voltinismo) está determinado por la duración de la diapausa, registramos consecuentemente la coexistencia de moscas uni y bivoltinas tanto a nivel de población como de nido. Estos resultados muestran la naturaleza facultativa de la diapausa de Carnus así como el papel de las variables abióticas en la modulación de aquella. El estudio con cámaras climáticas de la influencia de la temperatura en la finalización de la diapausa y el patrón de emergencia mostró que aunque los choques de frío no son necesarios para que se termine la diapausa de Carnus, sí tienen importantes efectos, acelerando el desarrollo de la diapausa, adelantando la emergencia y acelerando su progreso respecto a condiciones constantes. Además, mediante experimentos en campo, comprobamos que las características térmicas particulares de los diversos microhábitats modularon el progreso de la diapausa, el comienzo de la emergencia y su patrón. En microclimas inestables (cajas nido) la fenología de emergencia se adelantó en la estación, pero su progreso fue más lento, alargando el periodo de emergencia en comparación con los microhábitats estables (puentes y taludes) entre los que no hubo diferencias en la emergencia. Comprobamos experimentalmente la consistencia de estos resultados cuando las diferencias microclimáticas fueron anuladas (homogeneizadas) en dos momentos de la fase de la diapausa; durante la diapausa invernal y al final de la fase de desarrollo de la post-diapausa. Estos resultados sugieren posibles procesos de adaptación o aclimatación a los microclimas. También se reveló la mayor sensibilidad de Carnus a cambios térmicos justo antes de la emergencia, lo que favorecería la percepción del cambio ambiental por la presencia del hospedador en el nido y consecuentemente la sincronización de la emergencia del parásito. El estudio de los requerimientos térmicos del parásito desveló que el desarrollo de la post-diapausa necesitó acumular menor cantidad de unidades de calor (grados día) en cajas nido, pero debido a las condiciones térmicas (fuerte oscilación con temperaturas extremas), el desarrollo fue ralentizado, necesitando más tiempo para desarrollarse que en cavidades térmicamente estables. En estas últimas cavidades los requerimientos térmicos fueron mayores (sobre todo en taludes), mostrando una tasa de emergencia similar entre ellas, pero acelerada con respecto a cajas nido. En definitiva, la presente tesis revela la importancia de considerar los factores abióticos a pequeña escala, así como los mecanismos que están actuando en la regulación del ciclo vital de parásitos para poder abordar futuros estudios fisiológicos, ecológicos o evolutivos entre otros. / Understanding the impact of parasites in their hosts and the evolution of host-parasite interactions requires previous knowledge on the effect of environmental factors on such organisms and its interaction. For this, it is critical to consider such factors at the appropriate scale, defined by the organisms under study. The main objective of this thesis is to study the effect of abiotic factors, particularly temperature, on the regulation of diapause of the ectoparasite Carnus hemapterus. This insect is a generalist haematophagous dipteran with a large geographic distribution that parasitizes nestling of a wide variety of bird species (mainly troglodyte ones). This work was developed in an arid locality in the southeast of Spain (Tabernas´ desert), where three types of habitats (natural burrows at sandy cliffs in the ramblas, cavities in human constructions, - mainly bridges - and nest boxes) coexist interspersed and are occupied by Carnus hemapterus and its avian hosts. Firstly, the microclimate of the three cavity types, where the diapause of Carnus takes place, was studied by data-loggers and considerable differences were found: nest boxes were colder and with marked thermal oscillation, while the temperature in the other cavities was much more stable. Moreover, burrows showed warmer and drier conditions than cavities in bridges. This environmental heterogeneity has important implications for the organisms (both endotherms and ectotherms) that inhabit these cavities. Field experiments performed with different host species in natural conditions revealed the co-occurrence of long and short diapauses. Since the duration of the life cycle and the number of generations per year (voltinism) is determined by the length of the diapause, we registered consequently, the co-occurrence of uni and bivoltine flies at both population and nest level. These findings illustrate the facultative nature of diapause of Carnus and the modulating role of abiotic variables. Experimental tests with climatic chambers of the influence of temperature in the termination of diapause and the emergence pattern showed that, although cold shocks are not necessary for the end of the diapause, they stimulate the development of diapause, advance the emergence and accelerate its progress when compared to constant conditions. Furthermore, by means of field experiments, we checked that the particular thermal features of the microhabitats modulated the progress of the diapause, the emergence start and its pattern. In habitats with fluctuating microclimate (nest boxes) the phenology of emergence occurred earlier in the season, but its emergence progress was slower, making the emergence longer compared with stable microhabitats (cavities in bridges and burrows) where no differences in emergence were found. We confirmed experimentally the consistency of such results when the microclimatic differences were removed in two different moments of the diapause: during the winter diapause and at the end of the development phase of the post-diapause. These findings suggest adaptation or acclimatization of individuals to specific microclimates. Also, a higher sensitivity of Carnus to thermal changes just before emergence was revealed, what would favor the perception of environmental changes due to the presence of the host in the nest and, consequently, the synchronization of the parasite emergence. The study of the thermal requirements of the parasite revealed that its post-diapause development needed to accumulate less heat units (degree day) in nest boxes than in the other cavity types. Yet, due to sharp thermal oscillation with extreme temperatures, the development was likely decelerated by development arrests. Thus, flies from nest boxes needed more time to develop than flies from thermally stable cavities. Flies from cavities in bridges and burrows showed higher thermal requirements (mainly in burrows), being the emergence rate similar between them, but faster when compared with flies from nest boxes. Finally, this thesis reveals the importance of considering the abiotic factors at a small scale and the mechanisms acting in the regulation of the life cycle of parasites before addressing future physiological, ecological or evolutionary studies.

Annexina A6 (AnxA6) es una proteína de unión a fosfolípidos de membrana de forma dependiente de calcio. Está implicada en múltiples procesos celulares como la homeostasis de colesterol y el tráfico intracelular. Partiendo de que AnxA6 es una de las proteínas más abundantes en el hígado, representando el 0.25% del total, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio del papel de AnxA6 en este órgano a partir de ratones genoanulados para la proteína (AnxA6-/-). Teniendo en cuenta la fisiología y arquitectura comparable a los ratones WT de los hígados en ausencia de AnxA6, se procedió al estudio de AnxA6 durante el proceso de regeneración hepática tras la realización de una hepatectomía parcial (HP) de 2/3. Sorprendentemente, el 80% los ratones AnxA6-/- no sobrevivían más allá de las 72 horas post-HP. La regeneración hepática consiste en la activación de los hepatocitos por diversas citoquinas y factores de crecimiento que permiten la proliferación de las células hepáticas tras un daño hepático o una resección, como es el caso. En paralelo, el hígado y, el organismo en general, sufren una serie de adaptaciones metabólicas para mantener la homeostasis energética. El estudio del proceso de regeneración hepática demostró una menor expresión de las citoquinas TNFα e IL-6, encargadas de activar la transcripción de centenares de genes que podía estar compensada por una mayor activación del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Además, se observó cierto retraso en la acumulación de lípidos en el hígado, necesarios para hacer frente a la elevada demanda energética derivada de la intensa proliferación. Tras la HP, los ratones experimentan una hipoglucemia muy elevada fruto de la resección del 60% de la masa hepática, con lo que se reducen los almacenes de glucógeno y los hepatocitos con capacidad gluconeogénica. A diferencia de los ratones WT, los AnxA6-/- tenían una drástica y rápida caída de los niveles de glucosa en sangre que no retornaban a valores normales, sugiriendo un coma hipoglucémico como causa de la baja supervivencia. Además, el análisis de la glucosa en sangre en los ratones AnxA6-/-, hizo evidente que en ausencia de AnxA6, y ante un estrés metabólico, los ratones eran incapaces de mantener la homeostasis de glucosa. Mediante el ayuno de los ratones AnxA6-/-, se determinó que el problema en la homeostasis de glucosa no era debido ni a una señalización defectuosa por parte de las hormonas insulina y glucagón, ni por una disfunción en el almacén y degradación de glucógeno. Estos resultados centraban a la gluconeogénesis (GNG) como la causa que provoca la hipoglucemia. La GNG es el proceso mediante el cual se produce glucosa a partir de sustratos no glucídicos como lactato, aminoácidos y glicerol. Así, se descartó un problema en la expresión de las enzimas clave de la GN; glucosa-6-fosfatasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y fructosa-1,6-bisfosfatasa. En cambio, se observó una inhibición en la producción de glucosa a partir de alanina tanto in vivo en ratones hipoglucémicos como en hepatocitos aislados. La alanina es el principal sustrato de la GNG tanto en condiciones de ayuno como durante la regeneración hepática. Está inhibición se determinó debida a una deficiencia en la captación de alanina, tal como se observó en hepatocitos aislados. El transportador de aminoácidos SNAT2, uno de los principales transportadores de alanina, entre otros aminoácidos neutros, se ha descrito esencial durante la regeneración hepática y el ayuno. En estas situaciones se sobreexpresa el transportador y se transloca a la membrana plasmática de los hepatocitos. Tras el ayuno, los hepatocitos deficientes en AnxA6 no presentan niveles de SNAT2 en la membrana sinusoidal indicando un impedimento en el tráfico del transportador. Por último, se ha determinado mediante la técnica de pull down la interacción entre AnxA6 y SNAT2. De manera que se propone un mecanismo mediante el cual AnxA6 interacciona con SNAT2 dirigiéndolo a la membrana plasmática. Con estos resultados, hemos determinado la implicación por primera vez de AnxA6 en el metabolismo de la glucosa a través de alanina. Así, sugerimos que en ausencia de AnxA6, el transportador SNAT2 no se transloca a la membrana plasmática, quedando retenido en algún compartimento celular. De esta forma, se inhibe la GNG a partir de alanina impidiendo la producción de glucosa y provocando una situación de hipoglucemia, que en el caso de la HP podría llevar a la muerte del animal. / Annexin A6 (AnxA6) ) is a multifunctional calcium-dependent membrane binding protein involved in a plethora of different functions such as Ras-MAPK and PKCα signalling regulation, intracellular cholesterol homeostasis, actin-cytoskeleton and plasma membrane arrangement among others. Although AnxA6 is one of the major proteins in the liver (0.25% total protein), its function in the physiology of this organ remains unknown. After partial hepatectomy (PH) quiescent hepatocytes are triggered to progress through the cell cycle, showing a synchronous onset of DNA synthesis with a cellular response that involves cell activation and tissue remodelling. During this period of liver regeneration, the liver has to retain the major physiological tasks such as the synthesis and secretion of plasma proteins, lipid homeostasis and its metabolic function to ensure viability of the organism. The aim of the present study was to investigate the in vivo function of AnxA6 during liver regeneration using an AnxA6 knock-out (AnxA6-/-) mouse model. To this objective, 2/3 PH was performed in wild-type C57BL/6 control and AnxA6-/- mice. After PH, AnxA6-/- mice exhibit a dramatic reduction of survival rate (87.5% at 72h post-PHx). However, the exogenous administration of glucose before and during PH restored AnxA6-/- survival rate after PH, suggesting a link between AnxA6 and hepatic energetic metabolism. A comprehensive analysis of glucose metabolism experiments pointed to an impairment of liver gluconeogenesis in AnxA6-/- mice, also observed in starving mice. A biochemical approach allowed us to elucidate a role for AnxA6 in the intracellular trafficking of SNAT2, the main liver L-Alanine transporter, which is essential for gluconeogenic hepatic substrate uptake during liver regeneration and mice starvation. We conclude that AnxA6 is a new regulator of hepatic gluconeogenesis essential for the trafficking of the alanine transporter (SNAT2) into the hepatocyte sinusoidal plasma membrane and subsequent alanine uptake, the major gluconeogenic substrate during both liver regeneration and fasting.

EN CATALÀ:L'acceptació indefinida dels òrgans trasplantats mantenint el correcte funcionament de l'empelt sense necessitat d'administrar l'agressiu tractament immunosupressor constitueix el principal objectiu de la investigació clínica en el camp del trasplantament. Tot i que aquest fenomen s'observa amb freqüència en models animals, la tolerància immunològica a l'empelt en essers humans es redueix a un limitat grup de pacients, principalment en trasplantats hepàtics, considerats tolerants operacionals.L'objectiu de l'estudi és precisament la caracterització immunològica dels pacients operacionalment tolerants desprès del trasplantament de fetge. L'anàlisi descriptiu dels diferents paràmetres immunològics en sang perifèrica, mitjançant citometria de flux i expressió genètica, permetria delimitar la contribució de les principals subpoblacions immunològiques en l'acceptació de l'empelt hepàtic i els possibles mecanismes moleculars responsables del procés de tolerància.Els receptors hepàtics tolerants mostren un major numero de limfòcits reguladors CD4+CD25+CD62Lhigh Foxp3+ que els pacients no tolerants, però no que els controls sans, evidenciant la possible interacció dels fàrmacs immunosupressors en els limfòcits T reguladors. Així mateix, els pacients tolerants exhibeixen una proporció de limfòcits gammadelta superior, i una inversió en el quocient de les subpoblacions delta1+/delta2+ respecte als receptors dependents de immunosupressió i els controls, conseqüència de l'expansió del subtipus limfocitari Vdelta1.L'anàlisi de l'expressió genètica de sang perifèrica manifesta diferencies significatives en el patró d¡expressió dels pacients tolerants respecte als receptors no tolerants i controls sans. Aquests canvis transcripcionals varen ser validats amb mostres independents mitjançant PCR a temps real i a nivell proteic mitjançant citometria de flux. Els resultats revelen un increment en l'expressió de gens relacionats amb cèl·lules NK i limfòcits gammadelta, suggerint un paper central del sistema immune innat en el manteniment de l'estat de tolerància.L'estudi realitzat no solsament proporciona un major coneixement dels mecanismes relacionats en la tolerància hepàtica, també suggereix que l'ús de biomarcadors, com el patró d'expressió genètica en sang perifèrica, podria ser utilitzat com a test diagnòstic en la practica clínica per identificar receptors tolerants a qui es pot retirar la teràpia immunosupressora.

El experimento T2K es un experimento de neutrinos de largo recorrido que utiliza un haz casi puro the neutrinos muónicos. El objetivo principal del experimento es a medida de los parámetros de oscilación del neutrino muónicos. Para conseguir éste objetivo, T2K necesita una rigurosa predicción del índice de interacciones en el detector lejano, Super-KamiokaNDE. El detector cercano de T2K, ND280, calcula el índice de interacciones y estima el número de eventos en el detector lejano. Las interacciones de neutrino muónico de corriente cargada en el detector cercano (ND280) son usadas para predecir el índice de eventos en el detector lejano (Super-KamiokaNDE). Para una mejor restricción de los parámetros de sección eficaz, los cuales dominan el análisis junto con las incertezas de la prediccion del flujo, categorizamos los eventos seleccionados en tres grupos de acuerdo con el número de piones en el estado final. Estas tres categorías permiten un mejor ajuste de la señal del canal de oscilación (Corriente Cargada Quasielástica) y el principal ruído en oscilaciones (Corriente Cargada de 1 Pión Cargado). Actuales y futuros experimentos de neutrinos están limitados por las incertezas en las secciones eficaces de neutrinos. Los modelos actuales de sección eficaz están en tension con los datos experimentales en algunos rangos energéticos. Esto hace que sea critico estudiar secciones eficaces de neutrino--nucleo en todos los canales de interacción posibles. La producción the un solo pión en interacciones de neutrino muónico de corriente cargada es uno de los principales canales en tensión con los modelos. Como segunda contribución, presentamos el cálculo de producción the un solo pión en interacciones de neutrino muónico de corriente cargada usando un enfoque indepenediente del modelo explorando la capacidad total del detector ND280 para establecer las distribuciones cinemáticas del evento. La mejore del conocimiento de las interacciones, y en concreto del canal de producción de un sólo pión, permitirá la reducción de las incertidumbres sistemáticas en el análisis de oscilaciones. / The T2K experiment is a long baseline neutrino experiment which utilizes an almost pure muon neutrino beam. The main goal of the experiment is the measurement of the oscillation parameters of the muon neutrinos. In order to achieve this goal, T2K requires an accurate prediction of the interaction rates in the far detector, Super-KamiokaNDE. The near detector of T2K, ND280, measures the interaction rates and estimates the number of events at the far detector. The muon neutrino charged current interactions in the near detector (ND280) are used to predict the rate at the far detector (Super-KamiokaNDE). To a better constrain of the cross section parameters, which are dominant in the analysis together with the flux uncertainty, we categorize the selected events in three different samples according to the number of pions in the final state. These categories allow for a better constrain of the oscillation signal channel (Charged Current Quasielastic) and the main oscillation background (Charged Current 1 Charged Pion). Current and future neutrino experiments are limited by neutrino cross section uncertainties. The actual cross section models are in tension with the experimental data in some energy ranges. It is still critical to study neutrino-nucleus cross sections on all possible interaction channels. The muon neutrino charged current single pion production is one of the main channels in tension with the model. As a second contribution, we present the measurement of the Charged Current single positive pion production cross section using a model independent approach exploring the full capability of the ND280 detector to determine the kinematical distributions of the event. The improved knowledge of the interactions, and in concrete for the single pion channel, will allow the reduction of the the systematical uncertainties in the oscillation analysis.

La malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) és un procés patològic lent i progressiu caracteritzat per l'obstrucció permanent, i no totalment reversible, del flux d'aire als bronquíols i de l'increment de la compliància del pulmó com a resultat de la presència d'emfisema. L'origen de l'MPOC s'associa a una exposició crònica a gasos nocius i partícules, sobretot, al fum del tabac. Malgrat això, les causes de la patologia són multifactorials, i poden incloure tant trastorns genètics com factors ambientals.Els principals trets anatomopatològics de l'MPOC són l'engruiximent de la paret i el remodelatge tissular dels bronquíols i la destrucció emfisematosa del parènquima pulmonar. Malgrat que aquestes lesions histològiques són diferents, les cèl·lules inflamatòries implicades en ambdós processos són les mateixes. Davant d'aquest fet, el primer objectiu de la meva tesi va ser determinar si aquests dos fenotips histopatològics estan relacionats amb dos perfils limfocitaris diferents.D'altra banda, malgrat que la progressió de l'MPOC s'ha associat amb la presència de fol·licles limfoides pulmonars, no hi ha dades disponibles sobre la densitat de les cèl·lules inflamatòries que formen aquestes estructures en l'àmbit de la malaltia. A més, també es desconeixen tant el patró de vascularització com l'expressió d'adrecines dels fol·licles limfoides pulmonars en l'MPOC. En conseqüència, el segon objectiu de la tesi va ser analitzar la prevalença, l'estructura, la localització, la vascularització i la proliferació/apoptosi cel·lulars dels fol·licles limfoides pulmonars en l'MPOC. Paral·lelament, també es van estimar les densitats fol·liculars dels limfòcits B i T, així com dels macròfags, de les cèl·lules dendrítiques i de les cèl·lules CD57+ en aquestes estructures.Per tal d'assolir aquests objectius es van aplicar tècniques immunohistoquímiques i morfomètriques sobre teixit pulmonar procedent de 9 pacients no fumadors, de 18 fumadors sense l'MPOC, de 16 fumadors amb MPOC moderada i de 16 pacients amb MPOC molt greu sotmesos a un trasplantament bipulmonar.Els resultats obtinguts demostren que els individus amb MPOC molt greu tenen una densitat de limfòcits T CD3+ i de limfòcits B significativament major als bronquíols en comparació amb el parènquima pulmonar. A més, els malalts d'MPOC presenten una densitat de limfòcits T CD8+ a l'epiteli bronquiolar significativament incrementada en comparació amb els individus no fumadors. Finalment, malgrat que la densitat parenquimàtica de limfòcits T CD8+ també es troba incrementada en els malalts d'MPOC, les densitats tant de limfòcits T CD8+ com de limfòcits B són similars en comparar el parènquima periemfisematós amb aquelles zones de parènquima no afectades per l'emfisema.Pel que fa als fol·licles limfoides pulmonars, els resultats mostren una densitat fol·licular de cèl·lules CD57+ significativament major en els pacients d'MPOC quan se'ls compara amb els individus no fumadors i amb els fumadors sense l'MPOC (p < 0,05). A més, el percentatge de perfils fol·liculars que presenten apoptosi també és significativament major en els malalts d'MPOC (p = 0,03). D'altra banda, no s'observen diferències significatives entre grups quant a les densitats fol·liculars de la resta de cèl·lules inflamatòries, ni tampoc quant a la distribució de vasos sanguinis o limfàtics en aquestes estructures.Així, els resultats presentats en aquest tesi corroboren l'existència d'un patró inflamatori bronquiolar en l'MPOC, que es caracteritza per la presència d'infiltracions mononuclears i de remodelatge tissular. No obstant això, el teixit parenquimàtic mostra una infiltració de limfòcits T CD8+ més lleu, la qual, a més, no es relaciona espacialment amb les zones de destrucció emfisematosa. D'altra banda, donat que les cèl·lules CD57+ són uns efectors importants de la resposta citotòxica i de la regulació immunitària, l'increment de la densitat fol·licular d'aquestes cèl·lules dóna suport a la hipòtesi que postula l'existència d'una disfunció immunitària local en l'MPOC. / In COPD, the histological lesions at both the small airways and lung parenchyma (wall thickening and tissue remodeling and emphysematous destruction, respectively) are definitely different. However, the inflammatory cells involved in both processes are the same. Moreover, although the presence of pulmonary lymphoid follicles (LF) has been associated with the progression of the disease, there is no information about the pattern of vascularization, expression of addressins or inflammatory cell densities within these structures in COPD.Histological and immunohistochemical techniques were used to assess the distribution and cell density of CD3+, CD4+, CD8+ and B lymphocytes in small airways and parenchymal interstitium of 9 non-smokers, 18 smokers without COPD, 16 smokers with moderate COPD and 16 patients with very severe COPD. Also, the prevalence, structure, localization, vascularization and cell proliferation/apoptosis of LF, as well as the follicular density of the main inflammatory cells were assessed in our series. The results of this study showed that CD3+ and B cell densities were significantly higher in small airways than parenchyma interstitium of very severe COPD patients. Furthermore, CD8+ cells were increased in the epithelium of airways of moderate COPD patients compared to non-smokers. Although CD8+ cell density was increased in parenchyma of COPD patients, CD8+ and B cell densities were similar when comparing periemphysematous and non-emphysematous alveolar interstitium. Regarding LF, those of COPD patients showed a significantly higher density of CD57+ cells. Moreover, the percentage of LF profiles with cell apoptosis was also significantly higher in COPD patients. On the contrary, no significant differences among groups were observed in the follicular densities of other inflammatory cells, nor in the distribution of blood and lymphatic vessels within LF.These results suggest that, although the small airways' wall of COPD patients shows a clear inflammatory pattern, with a high mononuclear infiltration and tissue remodeling, the parenchymal interstitium shows a milder CD8+ infiltration which, moreover, is not spatially related to emphysematous destroyed areas. Moreover, since CD57+ cells are important effectors of cytotoxicity and immune regulation, an increase of their follicular density supports the hypothesis of a local immune dysfunction in COPD.KEYWORDS: cigarrette smoking, lung inflammation, emphysema, inflammatory cells, lymphoid follicles

L'obesitat s'ha convertit en un problema sanitari important a nivell mundial, i és important poder-hi trobar solucions. El tungstat, tal i com han demostrat els diversos estudis desenvolupats en el nostre laboratori, és un fàrmac amb un gran potencial en el tractament de l'obesitat. Tot i haver-se descrit àmpliament els diversos efectes del tungstat en diferents models experimentals, el mecanisme d'acció n'és encara desconegut. Els resultats preliminars indiquen que la leptina i la seva via de senyalització juguen un paper important en les accions del tungstat sobre l'homeòstasi energètica. Donat que l'hipotàlem és una de les dianes més importants de la leptina i que és des d'aquí on aquesta hormona regula el balanç energètic, la nostra hipòtesi de treball és que el tungstat desenvolupa part de les seves accions a aquest nivell per poder regular el guany de pes corporal i la ingesta dels animals tractats. Amb la intenció de veure si el tungstat tenia efectes centrals directes, es va administrar una injecció via intraperitoneal de tungstat de sodi a rates wistar, i se'n van mesurar els nivells detectables a líquid céfaloraquidi mitjançant espectrometria de masses. Els resultats van mostrar que el tungstat passa la barrera hematoencefàlica. El segon punt va ser veure que quan el tungstat s'administra per via central (injecció intracerebroventricular al tercer ventricle de l'hipotàlem), dóna lloc a la reducció del guany de pes i la ingesta dels animals tractats, i també incrementa els nivells de fosforilació de les principals proteïnes de la via de la leptina: JAK2, AKT i ERK1/2, mostrant que el tungstat té efectes centrals directes. In vitro, es va tractar la línia cel·lular hipotalàmica N29 amb tungstat 100µM o leptina 1nM. El tungstat va incrementar la fosforilació de les proteïnes JAK2, ERK1/2 i AKT, però l'activació de cada una d'aquestes cinases no depenia de cap de les altres, mostrant que els seus efectes són independents. A més, el tractament amb tungstat regula l'expressió gènica de c-myc a través de la seva acció sobre la via JAK/STAT, i l'expressió de c-fos i Agrp a través de l'acció sobre la via ERK1/2, amb dos efectes altre cop independents.Es van realitzar estudis de proteòmica, comparant els nuclis hipotalàmics ARC, PVN i LHA entre animals prims i obesos, tractats i no tractats amb tungstat per via oral. Els resultats van mostrar que el tractament amb aquesta molècula altera l'expressió de diferents proteïnes, moltes d'elles involucrades amb la plasticitat neuronal i el creixement axonal, suggerint un rol important de la molècula en aquestes accions. Tenint en compte que en l'obesitat, les connexions neuronals entre els diferents nuclis hipotalàmics són defectives, aquest resultat és molt prometedor.Tots els resultats exposats suggereixen que el tungstat de sodi actua, en alguns aspectes, com un mimètic de la leptina a nivell neuronal, modulant la via de transducció del senyal de l'hormona i possiblement, modulant la plasticitat neuronal. Aquests efectes obririen noves vies pel tractament de l'obesitat. / Sodium tungstate is an antiobesity drug targeting peripheral tissues, but also modulates hypothalamic gene expression when orally administered, raising the possibility of a direct effect of sodium tungstate in the central nervous system. To assess whether sodium tungstate could have direct central effects, first, we administered a single intraperitoneal injection of sodium tungstate to wistar rats and its levels were measured in cerebrospinal fluid through mass spectrometry. Sodium tungstate crossed the blood brain barrier, reaching a concentration of 1.31±0.07 mg/l in cerebrospinal fluid 30 min after ip injection. Second, when centrally administered (a single intracerebroventricular injection into the third ventricle) sodium tungstate decreased body weight gain and food intake and increased the phosphorylation state of the main kinases and proteins involved in leptin signalling. In vitro, N29/4 neural cells were treated with 100µM sodium tungstate or 1nM leptin. Sodium tungstate increased the phosphorylation of janus kinase-2 (JAK2), extracellular signal-regulated kinase-1/2 (ERK1/2) and protein kinase-B (AKT), but the activation of each kinase did not depend on each other. Thus, it regulated c-myc gene expression through the JAK2/STAT system and c-fos and agrp gene expression through the ERK1/2 pathway simultaneously and independently. Proteomic studies were also performed, comparing the ARC, PVN and LHA hypothalamic nuclei from lean, obese and treated with sodium tungstate (orally) or not treated animals. The results show that treatment alters many different proteins, some of them involved in neuronal plasticity and axonal growth.All these data demonstrate that sodium tungstate had direct neural effects activating the leptin signalling pathway and increasing the activity of several kinases involved in the leptin signalling system in an independent way. Sodium tungstate also alters the expression of different proteins involved in neuronal plasticity, making it a suitable candidate to repair the neuronal connections altered because of the obesity. All these results present sodium tungstate as a suitable and promising candidate for improving central leptin sensitivity and managing obesity.

El tema de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos de neurodegeneración asociados al envejecimiento cerebral y el papel que desempeñan los astrocitos como neuroprotectores utilizando modelos animales in vitro e in vivo.Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y su función es muy importante, además de dar soporte trófico a las neuronas tienen una función anticitotóxica y modulan la actividad neuronal. El papel de los astrocitos y su activación en el envejecimiento es un proceso poco conocido. Un mayor conocimiento de esta célula glial puede ayudarnos a entender los cambios fisiopatológicos que conlleva el paso de los años en el cerebro humano. El envejeciemiento cerebral es un factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas y en esta tesis se ha estudiado especialmente la enfermedad de Alzheimer por su alta incidencia en la población de edad avanzada.En esta tesis hemos establecido y caracterizado dos modelos para el estudio del envejecimiento de los astrocitos in vitro y hemos evaluado su capacidad neuroprotectora.Primero hemos evaluado los cambios en el estrés oxidativo, la captación de glutamato y la expresión proteica en astrocitos corticales de rata en cultivos de 10 y 90 días in vitro (DIV). Observamos un aumento de estrés oxidativo e inflamación con generación de especies reactivas de oxígeno y una disminución de la actividad mitocondrial a los 90 DIV.La expresión de las proteínas nitrosiladas, la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD-1), la hemoxigenasa 1 (HO-1) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en los astrocitos envejecidos. La captación de glutamato en los astrocitos de 90 DIV era mayor que en los astrocitos de 10 DIV probablemente debido a la regulación al alza del transportador glutamato/aspartato. Los astrocitos envejecidos tenían una menor capacidad de mantener la supervivencia neuronal. Estos hallazgos indican que los astrocitos pueden perder en parte su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. En nuestro segundo modelo hemos estudiado los cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en cultivos primarios de astrocitos de la corteza de ratones neonatos de senescencia acelerada SAMP8 comparados con los de ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Hemos demostrado un incremento de la hiperfosforilación de tau y de actividad de quinasa de Gsk3&#946; y Cdk5, que regulan la fosforilación de tau, en los astrocitos de SAMP8. La inhibición de Gsk3&#946; por litio o la de Cdk5 por roscovitina reducen la fosforilación de tau en Ser396. Además, hemos detectado un aumento de estrés oxidativo y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial en los astrocitos de los ratones SAMP8. Los astrocitos SAMP8 muestran una disminución en la captación de glutamato comparada con la de los controles SAMR1. Interesantemente, la supervivencia de las neuronas SAMP8 y SAMR1 en cocultivo con astrocitos SAMP8 estaba reducida de manera significativa. Nuestros resultados sugieren que estas preparaciones in vitro son adecuadas para el estudio a nivel molecular y celular de los procesos subyacentes en el envejecimiento temprano de este modelo murinoAdemás hemos estudiado la función neurotrófica de los astrocitos observando si un aumento de su capacidad neurotrófica mejora la funcionalidad neuronal en el envejecimiento. El factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento.Por último hemos estudiado in vitro e in vivo si en un ambiente de estrés oxidativo, como se produce durante el envejecimiento, los astrocitos tienen una respuesta más elevada al péptido betamieloide.La neurotoxicidad por el péptido betamieloide (A&#946;) está propuesto como el primer paso de una cascada de eventos perjudiciales para la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los efectos tóxicos del A&#946; sobre los astrocitos podrían contribuir a desarrollar cambios neurodegenerativos que conducen a la EA. Hemos estudiado los efectos de A&#946;42 sobre ls cultivos de los astrocitos humanos en la presencia o ausencia de los agentes prooxidantes como butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor de síntesis glutatión y FeSO4 que libera hierro redox activo. Condiciones prooxidantes potenciaron la toxicidad del A&#946;, que se demostraron por la generación de radicales libres, cambios inflamatorios y apoptosis en los astrocitos humanos. Un tratamiento similar fue ensayado en la rata in vivo. Una mezcla del A&#946;40 y A&#946;42 o sólo del A&#946;42 fue infundida intracerebroventricularmente durante 4 semanas. Otros grupos animales eran simultáneamente infundidos con BSO y Fe. Un análisis realizado 4 meses más tarde mostró un mayor deterioro cognitivo en el laberinto acuático de Morris con el tratamiento de A&#946; conjuntamente con los tratamientos con agentes prooxidantes. Agentes prooxidantes también potenciaron la patología del tejido cerebral, así los estudios histológicos mostraron una mayor reactividad astroglial, depósitos de A&#946; y daño oxidativo en las neuronas hipocámpicas sensibles a EA. / The subject of this thesis has been the study of neurodegeneration mechanisms associated with the aging brain and the role played by the astrocytes as neuroprotective using animal models in vitro and in vivo. In the first study, we evaluate the neuroprotective capacity of astrocytes in an in vitro experimental model of aging.Changes in oxidative stress, glutamate uptake and protein expression were evaluated in rat cortical astrocytes cultured for 10 and 90 days in vitro (DIV). Aged astrocytes had a reduced ability to maintain neuronal survival. These findings indicate that astrocytes may partially loose their neuroprotective ability during aging. In the next study, we examine changes in tau phosphorylation, oxidative stress and glutamate uptake in primary cultures of cortical astrocytes from neonatal senescence-accelerated prone mice (SAMP8) and senescence-accelerated resistant mice (SAMR1). Our findings suggest that this in vitro preparation is suitable for studying the molecular and cellular processes underlying early aging in this murine model.In the next study glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) was assayed for its neurotrophic effects against the neuronal atrophy that causes cognitive deficits in old age. Aged Fisher 344 rats with impairment in the Morris water maze received intrahippocampal injections of either a lentiviral vector encoding human GDNF in astrocytes or the same vector encoding human green fluorescent protein as a control. Astrocyte-secreted GDNF enhanced neuron function as shown by local increases in synthesis of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine and serotonin. Spatial learning and memory testing showed a significant gain in cognitive abilities due to GDNF exposure, whereas control-transduced rats kept their performance at the chance level. These results confirm the broad spectrum of the neurotrophic action of GDNF and open new gene therapy possibilities for reducing age-related neurodegeneration.Finally we studied the effects of A&#946; on cultures of human astrocytes in the presence or absence of pro-oxidant agents. Pro-oxidant conditions potentiated A&#946; toxicity, as shown by the generation of free radicals, inflammatory changes and apoptosis. A similar treatment was assayed in rats in vivo. Pro-oxidant agents also potentiate brain tissue pathology. This was demonstrated in histological studies that showed highly increased astrocyte reactivity in AD-vulnerable areas, A&#946; deposits and oxidative damage of AD-sensitive hippocampal neurons.