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Extracellular UTP signalling in Schwann cell migration: A novel role of the P2Y2 receptor

Lamarca Dams, Aloa 13 September 2013 (has links)
Peripheral neuropaties are one of the major complications of the Peripheral Nervous System. Depsite the big importance of those pathologies, less drugs are effective for their treatment, and most of the prescribed drugs are based on the inhibition of pain. Nucleo CMP forte is a drug mainly composed of nucleotides (UMP, UDP, UTP and CMP), prescribed to patients with Peripheral Nervous System disorders. But their exact mechanism of action is still unknown. Because extracellular nucleotides can act as signalling molècules, our research group focus the studies in which are the effects of the Nucleo CMP forte drug and the triphosphate nucleotides in Schwann cells, one of the most important population in the regeneration of the Peripheral Nervous System. In response to peripheral nerve injury, Schwann cells adopt a migratiory phenotype and modify the extracellular matrix to make it permissive for cell migration and axonal regrowth. UTP and other nucleotides are released during nerve injury and activate purinergic receptors expresed on the Schwann cell surface, but little is known on the involvement of purine signalling in wound healing. Our results demonstrated that UTP treatment induces Schwann cell migration and wound healing, through the activation of the P2Y2 receptor. P2Y activation induces a biphasic MAPK activation (Early and Late) and also the activation of an extracellular metalloproteinase (MMP-2). Knockdown of the P2Y2 receptor or of MMP-2, using specific shRNAs, highly reduced cell migration and wound closure induced by UTP. MMP-2 activation evoked by injury or UTP was also mediated by the phosphorylation of all three major mitogen-activated protein kinases (MAPKs: ERK ½, p38 and JNK). Inhibition of these MAPKs decreased both MMP-2 activation and cell migration. Interestingly inhibition of MMP-2 activity, selectively blocked the late, but not the early MAPKs activation. These results suggest that MMP-2 activation and the late MAPKs phosphorylation are part of a positive feedback mechanism to maintain the migratory phenotype for wound healing. Moreover, treatment with UTP stimulates Schwann cell migration and wound repair through a MMP-2-dependent mechanism via P2Y receptors and MAPKs pathway activation.
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Estudi de la capacitació de l'espermatozoide i com les interaccions embrió-endometri poden inhibir-se per la presència d'una resposta autoimmunitària

Iborra Obiols, Antoni 05 April 2001 (has links)
Els objectius assolits en aquest treball de Tesi Doctoral han permés aprofondir coneixements dins l'àrea de recerca de la Immunologia de la Reproducció. En primer lloc, hem estudiat la funcionalitat de l'espermatozoide de mamífer en el procés de la capacitació i de la reacció acrosòmica mitjançant la utilització d'anticossos monoclonals específics de proteïnes de l'espermatozoide. En segon lloc hem demostrat la presencia d'anticossos anti-endometri en el sèrum de dones estèrils, en particular en el sèrum de dones amb endometriosi.En la primera part, describim anticossos monoclonals (mAbs) produïts contra diferents proteïnes del plasma seminal. Aquestes proteïnes resten adherides a la membrana plasmática de l'espermatozoide en el moment de l'ejaculació i són alliberades al llarg de la capacitació. Així hem estudiat la disociació de l'antígen reconegut pel mAb SEM-12 en l'espermatozoide humà, com varia la seva localització al llarg de la capacitació. Com a resultat més significatiu, hem descrit que el mAb SEM-12 inhibeix la reacció acrosòmica, la qual cosa ressalta la importancia que té la dissociació d'aquest tipus d'antígens de la membrana de l'espermatozoide. Amb anticossos monoclonals contra l'espermadhesina porcina AWN-1 hem establert, en un model in vivo, com aquesta disociació que observem in vitro, realment també succeeix in vivo. Aquest estudi funcional de l'espermatozoide, s'ha complertat amb experiments sobre l'efecte que la sortida de colesterol de la membrana té sobre la reacció acrosòmica, utilitzant una molécula acceptora de colesterol com és la b-ciclodextrina. Aquesta molécula afavoreix una sortida de colesterol de gairebé el 50% en un temps curt (10-30'), i es tradueix en reacció acrosòmica a partir de les 2 hores. Ambdos procesos, l'alliberament de proteïnes del plasma seminal adherides a la membrana plasmática i la sortida de colesterol estan relacionades entre si i en el temps al llarg de la capacitació de l'espermatozoide.En la segona part de la Tesi, aportem una técnica de ELISA per la determinació d'anticossos anti-endometri (AEA) en el sèrum de pacients estèrils. Aquesta técnica ha estat validada utilitzant cèl.lules endometrials provinents de biòpsies, i amb diferentes linies cel.lulars d'endometri, utilitzant uns sèrums de dones fértils com a controls per establir un llindar de negativitat pels AEA. Així hem establert que en patologies ginecològiques que cursen amb resposta inflamatòria hi han presents AEA, com per exemple en obstruccions de les trompes de Falopi (aproximadament el 60% de les pacients). Aquests AEA semblen ser conseqüència del desenvolupament de la patología i no la seva causa, ja que en un estudi realitzat amb pacients amb endometriosi hem observat com la presencia de AEA està relacionada amb el grau de desenvolupament de la malaltia; de un 7,4% de pacients amb un grau 1 d'endometriosi eren sèrums AEA pòsitius i aquest percentatge augmenta fins el 45.5% de sèrums AEA positius en pacients amb grau 3 d'endometriosi. Aquests anticossos podrien explicar la mala implantació embrionaria que es descriu en aquest tipus de pacients remeses a fecundació in vitro. El fet que pacients AEA negatives també tinguin aquests problemes implantacionals obre les portes a futurs estudis per avaluar l'efecte de l'estrés oxidatiu en l'aparició d'esterilitat. / The objectives of this Doctoral Thesis are focused on new aspects of Reproductive Immunology. First, we studied the mammalian sperm function, in some physiological processes such as capacitation and acrosome reaction by using sperm specific monoclonal antibodies raised against some sperm proteins. Secondly, we demonstrated the anti-endometrial antibodies in serum from sterile patients, particularly in women with endometriosis.In the first part of the work, we describe monoclonal antibodies (mAbs) that we have produced and recognize several seminal plasma proteins. These proteins bind to plasma membrane during ejaculation and are dissociated along capacitation. We have studied dissociation of SEM12 antigen, that is recognized by SEM12 mAb on human spermatozoa and its their relocalization along capacitation. The relevant result was that SEM12 mAb inhibited the acrosome reaction. This fact show how important sperm coating proteins are, and how their dissociation is basic for sperm function. With monoclonal antibodies against AWN-1 porcine spermadhesin, we established that seminal plasma proteins dissociation occurs also in vivo in porcine. We also have performed some experiments on cholesterol efflux from sperm plasma membrane, and its effect on acrosome reaction, using b-ciclodextrin as a cholesterol acceptor. A 50% of cholesterol efflux is produced in a short time (10-30'), and after 2 hours of incubation sperm acrosome reaction is promoted. Both processess, dissociation of seminal plasma proteins from sperm plasma membrane and cholesterol efflux are directly related along sperm capacitation.In the second part of this work, we described an ELISA technique for anti-endometrial antibodies (AEA) determination in serum from sterile patients. This immunoenzymatic technique is validated using, as a antigenic source, endometrial cells from human endometrial biopsies and using two established endometrial cell lines. We used sera from fertile women as a control, in order to establish positivity threshold. We have observed that some women with gynecological pathologies related to inflammatory response have AEA. For exemple, in patients with a tubal obstruction, we found a 60% of positive sera. AEA seems to be consequence of the pathology development but not the cause. In another study, we analyzed sera from patients with endometriosis and we determined that the presence of AEA is related to the degree of endometriosis. A 7.14% of patients with an stage 1 have AEA as compared with stage 3 of endometriosis where we found a 45.5% of positive sera. The presence of AEA antibodies could explain low implantation rates described in these sterile patients. The fact that AEA negative patients also have low embryo implantation rates, open new perspectives for the possible role of oxidative stress in sterility.
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Role of voltage-gated T-type calcium channels in the viability of human melanoma

Das, Arindam 18 July 2012 (has links)
En aquest treball de tesi hem estudiat per primera vegada l’expressió funcional dels canals de calci dependents de voltatge (CCDV) en melanòcits humans i un ampli rang de línies cel.lulars i biòpsies de melanoma humà, mitjançant tècniques de biologia molecular i d’imatge. Els nostres resultats demostren que els melanòcits control i les cèl.lules de melanoma expréssen isoformes de les famílies de gens Cav1 i Cav2. De forma destacable, l’expressió d’isoformes de la família Cav3 (canals de tipus T) es troba restringida a les cèl.lules de melanoma, en les que promouen la progressió del cicle cel.lular. Aquests resultats motiven l’anàlisi dels CCDV-T com a dianes terapèutiques contra la tumorigènesi i/o progressió tumoral del melanoma. En aquesta línea, hem trobat que mibefradil i pimozida, dos bloquejants de CCDV-T d’us clínic, inhibeixen el creixement de les cèl.lules de melanoma in vitro, i que aquest efecte és degut tant a una reducció de la proliferació cel.lular, com a una inducció de la mort dependent de caspases. Hem explorat les vies moleculars implicades en el procés apoptòtic i hem trobat que ambdues drogues indueixen estrés de reticle endoplasmàtic (RE) i la inhibició subsequent de l’autofàgia basal constitutiva present a les cèl.lules de melanoma. Finalment, hem demostrat, a través del seu silenciament gènic, que la isoforma Cav3.2 és la diana molecular dels bloquejants de CCDV-T, en el que respecta als seus efectes sobre l’estrés de RE i l’autofàgia. Conjuntament, els resultats obtinguts en el decurs d’aquesta tesi apunten als canals de tipus T como a possibles marcadors de pronòstic i/o dianes terapèutiques contra la metastasi del melanoma. / Hemos estudiado por primera vez la expresión funcional de los canales de calcio voltaje-dependientes (CCDV) en melanocitos humanos y un amplio rango de líneas celulares y biopsias de melanoma humano, mediante técnicas de biología molecular y de imagen. Nuestros resultados demuestran que los melanocitos control y las células de melanoma expresan isoformas pertenecientes a las famílias de genes Cav1 y Cav2. De forma destacable, la expresión de isoformas de la família Cav3 (canales de tipo T) se encuentra restringida a las células de melanoma, en las que promueven la progresión del ciclo celular. Estos resultados motivan el análisis de los CCDV-T como dianas terapéuticas contra la tumorigénesis y/o progresión tumoral del melanoma. En esta línea, hemos encontrado que mibefradil y pimozida, dos bloqueantes de CCDV-T de uso clínico, inhiben el crecimiento de las células de melanoma in vitro, y que este efecto es debido tanto a una reducción de la proliferación celular como a una inducción de la muerte dependiente de caspasas. Hemos explorado las vías moleculares implicadas en el proceso apoptótico y hemos hallado que ambas drogas inducen estrés de retículo endoplasmático (RE) y la inhibición subsiguiente de la autofagia basal constitutiva presente en las células de melanoma. Finalmente, hemos demostrado, a través de su silenciamiento génico, que la isoforma Cav3.2 es la diana molecular de los bloqueantes de CCDV-T en lo concerniente a sus efectos sobre el estrés de retículo endoplasmático y la autofagia. Conjuntamente, los resultados obtenidos en el curso de esta tesis apuntan a los canales de tipo T como posibles marcadores de pronóstico y/o dianas terapéuticas contra la metástasis del melanoma. / We have addressed for the first time the functional expression of voltage-gated calcium channels (VGCCs) in human melanocytes and a range of melanoma cell lines and biopsies, by molecular biology and imaging techniques. Our results show that control melanocytes and melanoma cells express channel isoforms belonging to the Cav1 and Cav2 gene families. Importantly, the expression of isoforms of Cav3 (T-type) channels is restricted to melanoma cells, in which they promote cell cycle progression. These results encourage the analysis of T-type VGCCs as targets for therapeutic intervention in melanoma tumorigenesis and ⁄or tumour progression. In this regard, we have found that mibefradil and pimozide, two clinically-used T-type Ca2+ channel blockers, inhibit the in vitro growth of melanoma cells, and that this effect is due to both a reduction in the cell proliferation rate and an induction of caspase-dependent cell death. We have further explored the molecular pathways leading to T-type channels blockers-mediated apoptosis, and found that both drugs induce endoplasmic reticulum (ER) stress and a subsequent inhibition of the basal autophagy present in melanoma cells. Finally, we have demonstrated by a gene silencing approach that the Cav3.2 isoform is the molecular target of T-type channel blocker mediated effects on ER-stress and autophagy. Altogether, the results attained in this thesis point to T-type Ca2+ channels as putative prognosis markers and/or therapeutic targets to tackle melanoma metastasis.
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Estudi de les alteracions moleculars en els gens reguladors del cicle cel·lular KLF6 i TP53, de les vies de transducció PI3K-AKT i RAS-MAPK, i identificació de nous gens amb potencial valor pronòstic en càncer de pròstata

Agell i Codina, Laia 29 November 2011 (has links)
Malgrat que el càncer de pròstata és un dels tumors més freqüents en els païssos desenvolupats, no s’han identificat encara quins gens clau podrien estar alterats. L’objectiu de la tesi ha estat estudiar quins mecanismes moleculars estan implicats en la inciació i progressió del càncer de pròstata. En el primer treball es va analitzar la freqüència de mutació de dos gens reguladors del cicle cel·lular (KLF6 i TP53) en tumors de pròstata sobre els quals hi havia publicada bibliografia discordant. Així, per exemple, en el cas de KLF6 el primer i el segon articles publicats en càncer de pròstata van descriure una freqüència de mutació del 55% i del 15% respectivament. Els dos estudis subseqüents la van descriure del 0 i de l’1%. El nostre estudi recolza la idea de què les mutacions de KLF6 i TP53 són fenòmens infreqüents en el càncer de pròstata i reforça la idea de què l’única manera de confirmar que els possibles canvis que es detecten són realment mutacions i no artefactes introduïts per la Taq-polimerasa és realitzar dos PCRs de manera independent. En el segon treball es va analitzar, per primer cop en càncer de pròstata, diferents gens de la via de PI3K-AKT i RAS-MAPK (PIK3CA, AKT, KRAS i BRAF) conjutament en un mateix grup tumors. En primer lloc, es van analitzar les mutacions en els hots spots coneguts d’aquests gens i en segon lloc es va estudiar mitjançant FISH i qRT-PCR la quantitat de còpies i els nivells d’expressió de PIK3CA respectivament. Per últim, es va estudiar els nivells proteics de pAKT. Els nostres resultat indiquen que les mutacions de PIK3CA, BRAF, KRAS i AKT1 són fenòmens infreqüents en els tumors de pròstata i la sobrexpressió d’ARNm de PIK3CA està associada amb els tumors de pròstata de Gleasons alts (≥7).A més a més, les amplificacions de PIK3CA i/o la sobrexpressió d’ARNm estan associades amb els nivells alts de pAKT. Finalment, en el tercer treball s’ha analitzat l’expressió genètica dels tumors de pròstata en funció del seu grau de Gleason. Els resultats d’aquest tercer treball són molt prometedors ja que han permès identificar un perfil de 12 gens que podrien tenir interès pel seu ús com a possibles marcadors de diagnòstic i pronòstic en el càncer de pròstata. A més a més, dos d’aquests gens (SEC14L1 i TCEB1) ja s’han pogut validar per immunohistoquímica i s’ha demostrat que la sobreregulació d’aquests gens està correlacionada amb el grau de Gleason, estadiatge tumoral i progressió bioquímica. Aquest estudi obre nous camins per seguir estudiant nous gens possiblement implicats en el carcinogènesi prostàtica.
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Análisis bioquímico y estructural del factor de transcripción mitocondrial humano A, TFAM, en complejo con la secuencia promotora LSP

Rubio Cosials, Anna 22 February 2013 (has links)
En esta tesis se ha conseguido la caracterización bioquímica, biofísica y estructural del factor de transcripción mitocondrial A humano, TFAM. TFAM presenta múltiples funciones en la biogénesis de la mitocondria y está implicada en transcripción, replicación, empaquetamiento del ADN mitocondrial, reparación del ADN mitocondrial.... Para tratar de hallar los mecanismos moleculares se procedió a la resolución de la estructura cristalográfica de TFAM en complejo con su secuencia diana de unión en el promotor LSP (Light Strand Promotor). La estructura de TFAM en complejo con una secuencia de 22 pb de LSP (Rubio‐Cosials, Sidow et al.) mostraba cómo TFAM impone una torsión global del ADN de 180°, con ambos dominios HMGbox introduciendo un punto de curvatura mediante la unión al surco menor del ADN. Estudios en solución mediante SAXS (Small Angle Xray Scattering) de TFAM en forma no unida permitieron asignar un alto grado de flexibilidad para la región connectora entre los dominios HMGbox y la cola C‐terminal, ambas regiones cargadas positivamente. Esta flexibilidad de la zona connectora permite un gran número de conformaciones diferentes para TFAM en su forma libre, donde los dos dominios HMGbox se encuentran con posiciones relativas diferentes. Posteriormente mediante estudios de spFRET (singleparticle FRET), se confirmó el sistema de curvatura del ADN definido por la estructura cristalográfica con la introducción de una torsión en éste en forma de U. Los estudios de SAXS y spFRET indicaban que esta unión presentaba un comportamiento ligeramente dinámico, posiblemente debido a la flexibilidad intrínseca que muestra la región connectora entre los dos dominios HMGbox en solución. Los resultados obtenidos permiten entender la multitud de funciones asignadas a TFAM y en concreto, su papel en la activación de la transcripción a partir de LSP. / Transcription of human mitochondrial DNA requires transcription factor A (TFAM), also essential for DNA packaging and maintenance. Crystallographic analysis of TFAM in complex with an oligonucleotide encoding the light‐strand promoter (LSP) revealed for the first time a protein structure comprising two high‐mobility group (HMG) domains, which intercalate residues at two inverted DNA motifs and induce an overall DNA bend of ~180º stabilized by the inter‐domain linker. The U‐turn allows the TFAM C‐terminal tail, which recruits the transcription machinery, to approach the initiation site despite contacting a distant DNA sequence. We also show that structured protein regions contacting DNA in the crystal show high flexibility in solution, whereas both HMG domains have different DNA recognition capability. Our data suggest that TFAM bends LSP stepwise to create an optimal DNA conformation for transcriptional initiation, whilst facilitating DNA compaction elsewhere in the genome.
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MAG, Nogo-A and NgR in Hippocampal Development and Regeneration

Mingorance Jiménez de la Espada, Ana 16 January 2006 (has links)
The adult central nervous system (CNS) has a very little capability to regrow its connections after lesion. The lack of axonal regeneration is a multifactorial problem, which is mainly due to the presence of inhibitory molecules in the CNS. Two main families of inhibitors exist, that of the so-called myelin-associated inhibitors, and that of the chondoritin-sulfate proteoglycans (CSPG). The question this thesis aims to address is the role of myelin-associated inhibitors in the regeneration of cortical connections. To do so, the model we have used is the entorhino-hippocampal connection and the main questions addressed were i) characterization of the temporal expression of MAG, Nogo-A and NgR, ii) analysis of their regulation after lesion, and iii) study of the effect of their blockade on axonal regeneration.Our results demonstrate that developmental expression of the myelin-associated inhibitors MAG and Nogo-A temporally coincides with the loss of regeneration capability of the entorhino-hippocampal connection also known as perforant pathway (PP). Moreover, expression of NgR (the common receptor for MAG and Nogo-A) also matches regeneration loss. After lesioning of the PP, MAG is overexpressed by mature oligodendrocytes which experiment a process of glial reactivity. Similarly, Nogo-A is re-expressed by reactive astrocytes in the deafferented hippocampus. The regulation of both inhibitors following injury supports a direct implication in the preventing axonal regeneration. To confirm this implication, we performed the blockade of MAG and the inhibitory domains of Nogo-A in an in vitro model (entorhino-hippocampal organotypic cultures). Both the blockade of MAG with Neuraminidase and the blockade of Nogo-A with NEP1-40 induced regeneration of the PP. Moreover, Blockade of CSPG with ChABC proved to be efficient in the same model. However, combination of NEP1-40 and ChABC, in order to block simultaneously Nogo-A-induced and CSPG-induced inhibition, did not display additive effects, suggesting a convergence in the inhibition mechanisms employed by both inhibitors. Last, we addressed the possibility of delaying treatment delivery as a therapeutic approach. While we confirmed that PP keeps its capability to regenerate during at least five days after lesion, we also determined that ChABC-based treatments are greatly compromised and lose efficiency when treatment is delayed.In conclusion, we have characterized the developmental expression pattern of the inhibitors MAG and Nogo-A and their common receptor NgR. The expression of the three proteins is strongly regulated following lesion and the blockade of MAG and Nogo-A is proved to be successful to promote axonal regeneration. We also determined the convenience of combined treatments and the most successful delivery schedule. Our data provide an insight for the development of new strategies addressed to induce axonal regeneration of injured cortical connections.
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El citoesqueleto de espectrina y el complejo de Golgi. Implicaciones en su arquitectura y funcionalidad en el transporte secretor

Salcedo Sicilia, Laia 13 December 2012 (has links)
El complejo de Golgi (Golgi) es un orgánulo dinámico que modifica proteínas y lípidos sintetizados en el retículo endoplasmático (RE) y los clasifica para enviarlos a su destino final. Está formado por un conjunto de cisternas aplanadas y apiladas (stack), con una región central plana y otra lateral dilatada. Cada stack está polarizado, con una cara cis, que es donde se recibe la carga sintetizada, y una cara trans, que es donde se le da salida. Adyacente a esta zona hay la red trans-Golgi o TGN, que es donde se producen las últimas modificaciones y se distribuye la carga para su transporte. El Golgi interacciona con el citoesqueleto de actina y sus proteínas asociadas, ya que éstas se localizan en las membranas del Golgi tanto in vivo como in vitro. El ciotesqueleto de actina interviene en los procesos de fisión de membranas y en el mantenimiento de la estructura plana y contínua de las cisternas del Golgi. También está relacionado con el citoesqueleto de espectrina, una red submembranosa formada por la propia espectrina, la actina, la proteína 4.1, el intercambiador aniónico AE1 y la anquirina. Es responsable de la morfología de los eritrocitos, facilitando así su paso por los capilares. Se ha descrito un citoesqueleto de espectrina asociado al Golgi formado por varias isoformas como la βIII espectrina, la anquirina G119, el intercambiador aniónico AE2 y la proteína 4.1. No se sabe qué función realizan en el Golgi, pero se ha descrito que la espectrina está implicada en el transporte de la ATPasa Na+/K+ y del transportador de glutamato EAAT4. Con estos antecedentes nos planteamos la siguiente hipótesis: la βIII espectrina y la anquirina G119 son necesarias para el mantenimiento de la organización estructural del Golgi y para el transporte secretor asociado. Para demostrarla nos planteamos determinar su localización en el Golgi y su participación en el mantenimiento de la estructura del orgánulo, examinar su papel en el transporte secretor y estudiar el elemento responsable de su localización en el Golgi. Desarrollamos nuevos anticuerpos específicos contra la βIII espectrina y la anquirina G119 humanas pero sólo los de la βIII espectrina mostraban un marcaje en el Golgi. Por ello decidimos centrar todo el estudio en la βIII espectrina. Mediante estudios de colocalización con marcadores de las distintas regiones del Golgi determinamos que la βIII espectrina se encuentra enriquecida en los compartimentos distales (trans-Golgi y TGN). Mediante un ensayo enzimático que disminuía los niveles del fosfatidilinositol 4-fosfato [PI(4)P] del Golgi observamos que la localización de la βIII espectrina era dependiente de los niveles de este fosfoinosítido. Gracias a los ensayos de desplazamiento competitivo de la βIII espectrina determinamos que esta asociación era a través del dominio PH. También estudiamos la contribución de la dinámica de actina en la localización de la βIII espectrina mediante el uso de drogas anti-actina. La disrupción de la dinámica de actina no afecta a la localización de la βIII espectrina. Para estudiar el papel de la βIII espectrina en la estructura del Golgi y el transporte secretor, silenciamos la βIII espectrina mediante ARNs de interferencia o la microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina. En ambos casos observamos una fragmentación del Golgi. Usando varios ensayos de transporte, observamos que el transporte en la zona RE/Golgi y en el post-Golgi (transporte anterógrado) de proteínas solubles y transmembrana está alterado en ausencia de βIII espectrina. Sin embargo, el transporte retrógrado de la subunidad B de la toxina de Shigella no está alterado. Así pues, esta tesis expone que la βIII espectrina es el mayor componente esquelético de los compartimentos distales del Golgi, donde es necesaria para mantener la integridad estructural y la actividad secretora del Golgi, y que el PI(4)P es el determinante de membrana más relevante para la localización de la βIII espectrina. / A spectrin-based cytoskeleton is associated with endomembranes including the Golgi complex and cytoplasmic vesicles but its role remains poorly understood. Using new generated antibodies to specific peptide sequences of the human βIII spectrin, we here show its distribution in the Golgi complex, where it is enriched in the trans-Golgi and trans-Golgi network (TGN). The use of a drug-inducible enzymatic assay that deplete the Golgi-associated pool of PI4P as well as the expression of PH domains of Golgi proteins that specifically recognize this phosphoinositide both displaced βIII spectrin from the Golgi. However, the interference with actin dynamics using actin toxins did not affect the localization of βIII spectrin to Golgi membranes. Depletion of βIII spectrin using siRNA technology and the microinjection of anti-βIII spectrin antibodies into the cytoplasm lead to the fragmentation of the Golgi. At ultrastructural level, Golgi fragments showed swollen distal Golgi cisternae and vesicular structures. Using a variety of protein transport assays, we show that the ER-to-Golgi and post-Golgi protein transports were impaired in βIII spectrin-depleted cells. However, the internalization of the Shiga toxin subunit B to the ER was unaffected. We state that βIII spectrin constitutes a major skeletal component of distal Golgi compartments, where it is necessary to maintain its structural integrity and secretory activity, and unlike actin, PIP4 appears to be highly relevant for the association of βIII spectrin the Golgi complex.
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Caracterização mecânica e biológica de scaffolds produzidos por BioCell Printing

Domingos, Marco 04 October 2013 (has links)
This research work proposes a novel automated and integrated system for the production and in vitro culture of scaffolds, called BioCell Printing. The main goal of the present research work, besides the development of the device, was indeed the validation of the system. To assess the system, 3D PCL scaffolds with different pore sizes and geometries were produced and analyzed. The results revealed that process parameters do not induce significant chemical and physical changes on the polymeric material. On the other hand, the variation of scaffold’s internal topology has a strong impact in terms of the mechanical and biological behavior of produced constructs. Based on these results, bioactive composite scaffolds were prepared using PCL in combination with Hydroxiapatite for bone regeneration. The obtained results highlight the effect of particle size both on the mechanical properties of the scaffolds as well on the adhesion, proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells / En esta investigación se propone el desarrollo de un nuevo sistema automatizado e integrado de producción y cultivo celular in vitro de andamios, denominado Biocell Printing. Además del diseño de este sistema, constituye un objetivo central de este trabajo validar el sistema de fabricación. Así, fueron producidos andamios 3D en PCL con diferentes dimensiones y geometrías de poros. El análisis realizado a las estructuras nos permitió comprobar que, aunque los parámetros de procesamiento utilizados no induzcan cambios significativos en las propiedades químicas y físicas del polímero, lo cierto es que la variación de la topología interna de los andamios tiene una influencia decisiva en el comportamiento biomecánico de las estructuras producidas. Con base en estos resultados, fueron producidos andamios bioactivos de PCL y HA para la regeneración ósea. Los resultados nos han permitido observar el efecto de la granulometría en el comportamiento mecánico del andamio, así como en el proceso de adhesión, proliferación y diferenciación de las células hMSC
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Evolución cromosómica en Simiiformes: homologías, reorganizaciones y heterocromatina

García Haro, Francisca 11 January 2001 (has links)
En este trabajo se han analizado las siguientes características cariotípicas de diferentes especies de primates Simiiformes: 1) HOMOLOGIAS Y REORGANIZACIONES CROMOSÓMICAS. Mediante la comparación de su patrón de bandas G, se han determinado las homologías cromosómicas de dos especies del género Cebus (C. apella y C. capucinus) y de diferentes especies del género Ateles (A. belzebuth hybridus, A. b. marginatus, A. paniscus paniscus y A. p. chameck). Esta comparación ha permitido determinar las reorganizaciones cromosómicas que explicarían las homologías detectadas: 3 inversiones pericéntricas en el caso de las especies del género Cebus y 4 inversiones pericéntricas, una paracéntrica y una fusión en el caso de Ateles. La aplicación de la técnica de ZOO-FISH y bandas G secuenciales utilizando las sondas de todos los cromosomas humanos completos, ha permitido determinar las homologías entre la especie humana (HSA), Cebus apella (CAP) y Ateles belzebuth hybridus (ABH). La comparación de los cromosomas o segmentos cromosómicos homólogos de las especies comparadas, ha permitido determinar las reorganizaciones cromosómicas que explicarían las homologías detectadas, y las bandas implicadas en dichas reorganizaciones. Las reorganizaciones cromosómicas detectadas han sido: a) 11 fisiones, 10 fusiones, 12 inversiones pericéntricas, 9 activaciones/inactivaciones centroméricas y 3 inversiones paracéntricas al comparar HSA y CAP; b) 19 fusiones, 11 fisiones, 18 activaciones /inactivaciones centroméricas y 6 inversiones pericéntricas al comparar HSA y ABH; y c) 17 fusiones, 11 activaciones/inactivaciones centroméricas, 5 inversiones pericéntricas, 3 fisiones y 3 inversiones paracéntricas al comparar CAP y ABH. Se ha analizado la relación existente entre las bandas implicadas en reorganizaciones cromosómicas evolutivas de la especie humana y de CAP con la localización de lugares frágiles y bandas sensibles al efecto de las radiaciones ionizantes en ambos cariotipos. Aplicando el test de la Ji cuadrado, se ha podido concluir que las coincidencias observadas no son estadísticamente significativas. Se ha determinado también el cariotipo ancestral de los Platyrrhini, así como las homologías de estos cromosomas ancestrales con los del cariotipo humano.2) ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA. Se ha realizado el análisis cualitativo de la heterocromatina constitutiva de 15 especies de primates Simiiformes: Homo sapiens, Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Hylobates syndactylus, Macaca fascicularis, M. tibetana, Papio leucophaeus, P. sphinx, Cercopithecus aethiops, C. sabaeus, C. albogularis, Cebus apella, Ateles belzebuth hybridus, Aotus azarae y A. nancymai. Las técnicas utilizadas para realizar este análisis han sido: a) digestión in situ con los enzimas de restricción AluI, HaeIII, RsaI y Sau3A y b) tinción con el par DA/DAPI en cromosomas sin bandeo previo, en cromosomas con bandeo C previo, y en cromosomas con bandeo G/C previo. La homogeneidad en la heterocromatina intersticial y terminal (HIT), y la heterogeneidad en la heterocromatina de localización centromérica (HC) observadas en la mayor parte de las especies analizadas, parece indicar un origen evolutivo relativamente reciente de la HIT e independiente del de la HC, que tendría un origen más antiguo. / In this work, the following cytogenetic chraracteristics from different Simiiiformes species have been analyzed:1) CHROMOSOMAL HOMOLOGIES AND REORGANIZATIONS. G-banding comparison has been used to determine homologies between two species of Cebus genus (C. apella and C. capucinus), and from different Ateles subspecies (A. belzebuth hybridus, A. b. marginatus, A. paniscus paniscus y A. p. chameck). This study has allowed to establish chromosomal reorganizations that could explain the homologies detected: 3 pericentric inversions in Cebus species, and one paracentric and 4 pericentric inversions, and a fusion in the Ateles subspecies. ZOO-FISH and sequential G-banding technique using whole human chromosome probes, have been used to determine chromosomal homologies between humans (HSA), Cebus apella (CAP) and Ateles belzebuth hybridus (ABH). G-banding comparison of homologous chromosomes from those species has allowed to characterize the chromosomal reorganization that could explain the homologies detected, as well as the bands involved in these reorganizations. The chromosomal reorganizations detected are: a) 11 fissions, 10 fusions, 12 pericentric inversions, 9 centromeric activations/inactivations and 3 paracentric inversions when HSA and CAP were compared; b) 19 fusions, 11 fissions, 18 centromeric activations/inactivations and 6 pericentric inversions when HSA and ABH are compared and c) 17 fusions, 11 centromeric activations/inactivations, 5 pericentrics inversions, 3 fissions and 3 paracentric inversions when CAP and ABH are compared. Relationship between bands involved in evolutive chromosomal reorganizations of HSA and CAP and localization of Fragile Sites and bands sensitive to the ionized radiations in both karyotypes, have been analyzed. Using the Chi square test, results show that coincidences observed are not statistically significant. In this work, the ancestral karyotype of Platyrrhini group is proposed, as well as the homologies between its chromosomes and those of the human karyotype. 2) QUALITATIVE ANALYSIS OF CONSTITUTIVE HETEROCHROMATIN. Constitutive heterochromatin from 15 Simiiformes primate species has been analyzed: Homo sapiens, Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Hylobates syndactylus, Macaca fascicularis, M. tibetana, Papio leucophaeus, P. sphinx, Cercopithecus aethiops, C. sabaeus, C. albogularis, Cebus apella, Ateles belzebuth hybridus, Aotus azarae y A. nancymai. Techniques used are: a) in situ digestion with the restiction enzymes AluI, HaeIII, RsaI and Sau3A and b) fluorescent staining with DA/DAPI on unbanded, C-banded and G/C banded chromosomes. The homogeneity in the interstitial and terminal heterochromatin (ITH), and the heterogeneity in centromeric heterochromatin (CH) observed in nearly all the species analyzed seem to indicate that ITH has a more recent evolutive origin than CH.
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Implicaciones de los lugares frágiles y las secuencias teloméricas en la evolución cromosómicas de los Primates

Ruiz-Herrera Moreno, Aurora 26 June 2003 (has links)
El objetivo principal de la presente tesis doctoral ha consistido en la comprobación de la siguiente hipótesis de trabajo: las bandas cromosómicas implicadas en reorganizaciones cromosómicas evolutivas podrían ser la expresión de regiones cromosómicas inestables, como son los lugares frágiles. Al mismo tiempo, las secuencias teloméricas en regiones internes de los cromosomas podrían ser el resultado de reorganizaciones cromosómicas evolutivas.Para cumplir dicho objetivo se han descrito, en primer lugar la descripción de homologías cromosómicas entre cariotipos de diferentes especies de Primates, y determinar las reorganizaciones cromosómicas que explican dichas homologías, así como las bandas cromosómicas implicadas en dichas reorganizaciones. Las especies de Primates estudiadas han sido: Macaca fascicularis, Macaca arctoides, Mandrillus sphinx, Cebus apella, Cebus nigrivittatus y Homo sapiens. En segundo lugar, se ha analizado la expresión citogenética de los lugares frágiles en las especies de Primates caracterizadas y se ha comparado su localización con los lugares frágiles descritos en la especie humana en la literatura con la finalidad de determinar si dichas regiones se han conservado durante el proceso evolutivo. Al mismo tiempo se ha estudiado la distribución de las secuencias teloméricas en posiciones internas de los cromosomas de las especies Macaca fascicularis, Cebus apella. Y por último, se ha relacionado la localización de lugares frágiles y la distribución de las secuencias teloméricas intersticiales con las bandas cromosómicas implicadas en reorganizaciones evolutivas.Por tanto, el uso combinado de las técnicas de citogenética clásica e hibridación in situ fluorescente (FISH) ha permitido: (1) la caracterización citogenética de la especies de Primates estudiadas en el presente trabajo, (2) establecer las homologías cromosómicas entre sus cariotipos y el cariotipo humano, (3) determinar las reorganizaciones que explicarían dichas homologías y (4) identificar las bandas cromosómicas implicadas en dichas reorganizaciones. El estudio comparativo de la localización de los lugares frágiles muestra que existe una conservación entre las especies de primates estudiadas. Como resultado significativo, cabe destacar que las reorganizaciones cromosómicas evolutivas no se distribuyen al azar, ya que existe una correlación positiva con la localización de los lugares frágiles. Como conclusión final, hemos podido establecer una clara relación entre puntos de rotura evolutivos, bandas cromosómicas que expresan lugares frágiles y la localización de secuencias teloméricas intersticiales.

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