Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica - Parc Científic de Barcelona / The Armcx gene cluster arose by retrotransposition from a single Arm-containing gene (Armc10), and by subsequent short-range tandem duplications of a rapidly evolving region of the Eutherian X chromosome. In this work we analysed the expression of Armcx/Armc10 genes during embryonic development, describing their expression in the developing neural tissues. As yet shown for Alex3 protein, Armc10 also causes mitochondrial aggregation and/or tethering in neurons and HEK293 cells. In neurons, these processes are believed to serve to capture mitochondria at specific locations requiring high-energy and Ca2+ buffering conditions. The mechanism by which Alex3 and Armc10 cause mitochondrial aggregation may involve Mitofusins, as they both interact with Mfn1 and Mfn2. Nevertheless, we were unable to find evidence about the involvement of Alex3 protein in mitochondrial fusion. Alex3 and Armc10 interact with the KIF5/Miro/Trak2 complex (which controls mitochondrial dynamics in neurons), through a direct interaction with Miro1-2 and Trak2. Importantly, this interaction requires low Ca2+ concentrations. We suggest that the Ca2+-dependent conformational changes in Miro proteins are the essential mechanisms regulating the interaction between Alex3 and the Miro/Trak2complex. Thus, while low Ca2+ concentrations may favour the formation of KIF5/Miro/Trak2/Alex3 complex, increases in intracellular Ca2+ rapidly uncouple such complex (including Alex3), thereby arresting mitochondrial trafficking. The notion that Alex3 (and possibly also Armc10) interacts with the Miro/Trak2 complex when mitochondria are motile at low Ca2+ concentrations is further supported by our findings that knockdown of Alex3 (such as Armc10) results in a decrease in the percentages of motile mitochondria, similarly to what was observed in Miro/Trak2 loss-of-function. In conclusion, we described Alex3 and Armc10 as proteins with evolutionarily conserved functions in the regulation of mitochondrial dynamics and transport. However, gene-specific particularities are present, suggesting overlapping but differential levels and mechanism of regulation of mitochondrial dynamics and transport by Alex3 and Armc10 proteins and probably by the whole Armcx cluster. We next speculate that Alex3 (but also the whole Armcx cluster) could play a role in regulation of mitochondrial dynamics or function during neural development by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Using the chicken spinal cord as physiological model, we found that Alex3 overexpression decreases TCF/LEF-transcriptional activity at basal condition and following Wnt3a or β-catenin induction, indicating that Alex3 substantially acts as an inhibitor of canonical Wnt/β-catenin pathway. Moreover, we showed that Alex3 is involved in both negative cell cycle regulation and induction of differentiation in chicken spinal cord, while Armc10 is only involved in negative cell cycle regulation. These differences between Alex3 and Armc10 overexpression effects on spinal cord developmental processes highlight functional divergences between the two proteins, suggesting that Alex3 may have acquired additional function respect to Armc10, phylogenetic ancestor of the whole Armcx gene cluster. The data collected in this study, describing Alex3 overexpression effects on spinal cord development, are coherent with the inhibitor function of Alex3 on Wnt/β-catenin pathway. However there is not sufficient evidence to sustain that these effects on progenitor cell cycle and neuronal differentiation are achieved by inhibition of Wnt/β-catenin pathway and further experiments are required to support this hypothesis. To shade light on the biological processes in which Alex3 can be involved (trough regulation of mitochondrial dynamics, regulation of Wnt/β-catenin pathway or new and different activity) we carried out a genome-wide analysis of changes in mRNA levels subjecting HEK293AD cells stably expressing Alex3GFP to microarray analysis. We found changes in global gene expression that involved key processes of cellular physiology, such as metabolic processes or cell cycle progression. However we are still far to identify the cellular and molecular mechanism by which Alex3 (and the whole Armcx/Armc10 cluster gene) acts in these processes. To achieve this goal it is essential to clarify Armcx/Armc10 function in nervous system development. / Los genes Armcx pertenecen a una misma familia localizada en el cromosoma X y caracterizada por la posesión de dominios armadillo en su secuencia proteica. En este trabajo se ha analizado la expresión de los genes Armcx/Armc10 durante el desarrollo embrionario, en los tejidos neurales en desarrollo y en el cerebro adulto. A continuación se ha analizado localización subcellular de las proteínas Armc10 y Alex3 (codificada por el gen Armcx3), que se encontraron mayoritariamente localizadas a núcleo y mitocondria. La sobreexpresión de Armc10 y Alex3 provoca la agregación y/o “tethering” mitocondrial en las neuronas, donde estos procesos sirven para anclar estas organelas en localizaciones específicas que requieren una alta demanda de energía y unos requerimientos de taponamiento de Ca2+. En la base de nuestros datos bioquímicos y de los estudios funcionales proponemos un modelo en el que las proteínas Alex3 y Armc10 son reguladores positivos del tráfico mitocondrial, interaccionando directamente con los complejos Miro/Trak2. Además, como se muestra para el complejo KIF5/Miro/Trak2, el incremento de la actividad neuronal que conlleva a incrementos en Ca2+ es probablemente la causa del desensamblaje del complejo y de la parada mitocondrial en los lugares de neurotransmisión activa, completando por lo tanto los requerimientos bioenergéticos de la transmisión neuronal. A continuaciòn utilizamos la médula espinal de pollo como modelo fisiológico in vivo para explorar la función de Alex3 y Armc10 en el desarrollo neural. Se encontró que Alex3 cumple un papel regulador por inhibición de la vía de Wnt/β-catenina. También demostramos que Alex3 está involucrado tanto en la regulación negativa del ciclo celular como en la inducción de la diferenciación de precursores neuronales. Por otro lado, Armc10 sólo se encontrò implicado en la regulación negativa del ciclo celular. Estas diferencias entre los efectos de la sobreexpresión de Alex3 y Armc10 en procesos llave del desarrollo de la médula espinal, evidencian las divergencias funcionales entre las dos proteínas, sugiriendo que Alex3 puede haber adquirido funciones adicionales respecto a Armc10, ancestro filogenético del cluster Armcx. Globalmente nuestros datos sugieren que la vía de señalización de Wnt puede estar regulando procesos llave del desarrollo a través de las proteínas mitocondriales Alex3 y Armc10.

Las Quimiocinas constituyen un pequeño grupo de moléculas estructuralmente relacionadas, que se caracterizan por regular el tráfico de varios tipos de leucocitos en condiciones fisiológicas y patológicas. En general las quimiocinas se han clasificado en cuatro grupos, en función de los residuos de cisteína que se encuentran en el extremo N-terminal de la proteína madura. Los cuatro grupos son: Las CXC quimiocinas ó a-quimiocina, las CC quimiocinas ó b-quimiocinas, las C quimiocinas ó g-quimiocina y finalmente la CX3C quimiocina ó d-quimiocina. Dentro del grupo de las b-quimiocinas, se encuentran MIP-1a y MIP-1b, que se localizan en el cromosoma 17q 11.2.Las quimiocinas ejercen sus efectos biológicos, a través de la unión con sus receptores que se encuentran expresados en la superficie de diversos grupos leucocitarios. Se ha descrito la utilización de tres receptores para MIP-1b: CCR5, CCR8 y CCR9, siendo el CCR5 el que le otorga propiedades antivirales, ya que éste representa uno de los correceptores del VIH-1.Se ha descrito que MIP-1b ésta codificada por dos loci, el Locus A y el locus B; y que éste último define un polimorfismo en la quimiocina. Esta forma polimórfica se caracteriza por la deleción de 15 pb en el exón 3, que se origina a partir de un cambio de base (A260 - G), provocando que se sintetice una proteína con 5 aminoácidos menos. Para determinar la incidencia de este polimorfismo dentro de la población sana, se estudió la distribución alélica en 200 individuos sanos a través de la técnica de PCR-SSP, confirmadas posteriormente por las técnicas de PCR-SSO post-hibridación y secuenciación; revelando que la frecuencia del alelo canónico representa un 83,5%, mientras que la frecuencia del alelo polimórfico representa un 16,5%. Así mismo el estudio fue realizado en una población de pacientes con enfermedades tiroideas autoinmunes, pacientes diabéticos, pacientes con hepatitis C, observando que existe una correlación entre la frecuencia genómica y la frecuencia alélica de estos pacientes respecto a la población normal. Sin embargo, en los pacientes con VIH se observaron diferencias claras y estadísticamente significativas respecto a los individuos sanos. Para estudiar los niveles de expresión de MIP-1a y de MIP-1b, utilizamos un protocolo que, aprovechando pequeñas diferencias a nivel de la secuencia nucleotídica, combina RT-PCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente los niveles de ARNm de los loci codificantes para cada una de las dos quimiocinas. El aspecto más relevante de esta técnica, es el uso de un fragmento de ADN recombinante, que actúa de Estándar Interno, tanto para MIP-1a como para MIP-b, a la vez que contiene un lugar de restricción para MspI. De esta manera actúa como control de la amplificación y de la digestión. Esta metodología se aplicó para determinar las posibles diferencias que pudieran existir en los niveles de expresión de los loci A y B de MIP-1b, en la línea celular U-937 tras su estimulación con PMA, LPS e ionomicina, así como también entre individuos sanos y pacientes VIH+ (de diferentes genotipos) en PBMCs y linfocitos T CD8+, estimulados con PHA e IL-2.El estudio mostró que los loci A y B se regulan de manera diferente en las células U-937 y las cinéticas de expresión de mRNA son equivalentes en PBMCs y linfocitos T CD8 de pacientes VIH+ y en controles. En términos generales el locus B contribuye de manera minoritaria a la síntesis de mRNA de MIP-1b y la cinética de inducción del mRNA de los linfocitos T CD8, se ve retrasada en heterocigotos y homocigotos (bb).Por otro lado, los niveles de expresión del receptor CCR5 en linfocitos T CD4+ son diferentes a los que presentan los controles.Finalmente, podemos concluir que MIP-1b ejerce un efecto diferencial sobre sus células diana debido a las distintas iso- y alo-formas que presenta. / The chemokines are a small group of structurally related molecules that regulate cell trafficking of various types of leukocytes in physiologic and pathologic conditions. In general the chemokines can be divided into four groups based on a structural cysteine motiff found near to the amino-terminus of the mature protein. The four groups are as follows: The CXC or a-chemokines, the CC or b-chemokines, the C or g-chemokine and finally the CX3C or d-chemokine. Into the b-chemokines groups, we found MIP-1a and MIP-1b chemokines, that are clustered at chromosome 17 q 11.2.The chemokines exert their biological functions trough binding to seven transmembrane-domain receptors wich are expressed on a variety of leukocyte populations. Three receptors has been described for MIP-1b: CCR5, CCR8 and CCR9, being CCR5 who give it antiviral properties, because it is one of the VIH-1 coreceptors.Human MIP-1b in encoded by two loci, locus A and locus B, and the last one define a polymorphism in this chemokine. This polymorfic form is characterized by a deletion of the first 15 bp in exon 3 and its caused by a mutation A260-G, origining a protein that lacks 5 amino acids. In order to determine the healthy population incidence of this polymorphism, we have studied their allelic distribution in 200 donors using the PCR-SSP technique, confirmed by PCR-SSO technique post-hibridization and sequentiation, showing that the frequency of the canonic form represent a 83,5% whereas a polymorphic form represent a 16,5%. On the other hand, this study was done in a population of thyroid autoimmune disseasse patients, diabetes patients and , hepatitis C patients showing that exist a correlation between genomic frequency and allelic frequency that these patienes with the healthy population. However, the VIH patients showed differences statistically significant respect to the healthy population.In the study of the level expression of MIP-1a and MIP-1b, we used a protocol that, taking advantage of small difference in nucleotide sequence, combines RT-PCR and restriction with MspI to allow the semiquantitative assessment of mRNAs from the two chemokines. The key feature of our approach is the introduction of an internal standard common to MIP-1a and MIP-1b wich is co-amplified and contains a MspI restriction site. This allow and easy control of the amplification and the efficiency of the restriction. This method was used to determine the possible difference in the level expression of the loci A and B of MIP-1b in the cellular line U-937 after its stimulation with PMA, LPS and Ionomicine, as well as between healthy populations and VIH patients (of different genotype) in stimulated PBMCs and lymphocytes TCD8 with PHA and IL-2.The study show that the loci A and B are regulated of different way in the cellular line U-937, and the mRNA cinetics expression are equivalents in VIH patients and healthy populations PBMCs and lymphocytes TCD8. In general terms, the locus B contribute in a minoritary way to the synthesis of the mRNA of MIP-1b and the induction cinetic of the mRNA of the lymphocytes TCD8 are deleted in heterozigous and homozigous (bb).On the other hand, the expression levels of CCR5 receptor in lymphocytes TCD4 are different to the controls.Finally, we can conclude that MIP-1b acts in a different way in a target cells due to a different iso- and alo-forms that it present.

La mayoría de las técnicas actuales para el estudio celular se basan en el análisis de poblaciones celulares y proporcionan resultados que corresponden a valores promedio de toda la población. Sin embargo, multitud de estudios indican la existencia de una variabilidad substancial entre células fenotípicamente similares, y evidencian la necesidad de disponer de sistemas adecuados para el estudio de células individuales. Esta necesidad ha motivado la aparición de trabajos interdisciplinarios entre el campo de la biología y otras áreas de conocimiento como la microelectrónica, que permite desarrollar estructuras y dispositivos tridimensionales con formas complejas a micro y nanoescala. Este trabajo se enmarca dentro de un proyecto de investigación más amplio que tiene como objetivo principal diseñar y fabricar BioMEMS (sistemas microelectromecánicos para aplicaciones biológicas) que permitan el estudio individualizado de células vivas desde su interior o su exterior. Estos dispositivos, en el futuro, deberán ser capaces de llevar a cabo diversas funciones, detectar parámetros celulares y actuar en consecuencia. Los estudios realizados en este trabajo corresponden a la fase inicial del proyecto, y pretenden sentar las bases para el desarrollo de BioMEMS de tamaño subcelular que puedan ser interiorizados en células para aplicaciones en célula única viva. Basándonos en este objetivo principal, se seleccionó el silicio como material apropiado para la fabricación de MEMS y biocompatible en condiciones extracelulares. Utilizando líneas celulares establecidas en cultivo con capacidad fagocítica, se analizó la vía de interiorización, el destino intracelular y la citotoxicidad de micropartículas con base de silicio fabricadas mediante técnicas de la industria microelectrónica. Como prueba definitiva, el efecto citotóxico de estas partículas en el interior celular también se evaluó utilizando embriones de ratón en estadio preimplantacional, extremadamente sensibles a cualquier alteración. Una vez validado el material, como primera aplicación y para demostrar la utilidad de estos dispositivos en estudios de célula única viva, nos propusimos diseñar un sistema de etiquetaje individual de células. Se diseñaron micropartículas que integraban unidades de información básica, y mediante este sistema fue posible etiquetar y trazar células vivas en cultivo con capacidad fagocítica. Finalmente, con tal de poder hacer extensiva esta aplicación a cualquier tipo celular, se optimizó un sistema de modificación química de la superficie de estas micropartículas con moléculas específicas (anticuerpos y lectinas). Las micropartículas modificadas se utilizaron para etiquetar y seguir células vivas e cultivo sin capacidad fagocítica. En el futuro, la utilización del sistema de modificación química de micropartículas desarrollado en el presente trabajo abre la posibilidad de dirigir los dispositivos hacia estructuras celulares concretas (membrana plasmática, núcleo, etc.) pero también de usarlos para la detección de moléculas específicas presentes en las células (por ejemplo la activación de caspasas, el incremento de ROS o las variaciones de concentración de Ca2+). Los resultados obtenidos, por lo tanto, abren una nueva vía de investigación prometedora, significan un progreso en el campo de estudio de los BioMEMS, y son la base para el diseño de futuros dispositivos intracelulares para el análisis de parámetros en célula única in situ.

Tras el trasplante, el sistema inmunitario se activa para inducir una respuesta inmunitaria contra los antígenos de histocompatibilidad del donante expresados por el injerto (alo-antigenos), que conduce al rechazo del órgano. Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígeno más potentes y tiene un papel fundamental en la iniciación de la respuesta inmunitaria contra el injerto mediante la presentación de aloantígenos a las células T a través de varias vías. No obstante, las CD son también participantes clave en la inducción de tolerancia. Uno de los principales objetivos en el trasplante es la inducción de tolerancia específica de donante evitando de este modo la administración crónica de inmunosupresión, que tiene muchos efectos secundarios. La comprensión de los mecanismos inmunológicos implicados en el rechazo del trasplante ha permitido la generación de terapias alternativas a la inmunosupresión convencional. En diferentes modelos animales, se han empleado varias estrategias para inducir la tolerancia del injerto tales como la inyección de CD tolerogénicas. En humanos, existen varias posibles fuentes de aloantígenos incluyendo los exosomas, que se pueden aislar de diferentes fluidos biológicos. El objetivo de esta tesis es investigar el potencial uso de los exosomas derivados de plasma como fuente de aloantígenos, la capacidad de las células dendríticas humanas de sangre periférica para capturar exosomas alogénicos y, finalmente, evaluar el efecto de las CD tolerogénicas en la supervivencia del injerto en un modelo de trasplante renal alogénico en rata. Nuestros resultados proporcionan información valiosa sobre las microvesículas derivadas del plasma. Mediante análisis proteómico hemos detectado 161 proteínas asociadas a las microvesículas, incluyendo muchas relacionadas con el complemento y con las cascadas de transducción de señales de la coagulación. Sin embargo, cuando las preparaciones enriquecidas en exosomas fueron analizadas el número de proteínas identificado fue muy reducido, lo que sugiere que en condiciones saludables hay cantidades limitadas de exosomas y, por tanto, no son una fuente viable de aloantígenos. Por otra parte, nuestros resultados proporcionan nueva información sobre la interacción de las células dendríticas humanas de sangre periférica con los exosomas alogénicos. Los experimentos in vitro muestran que tanto las CD convencionales como las plasmacitoides capturan exosomas derivados de una línea de células T aunque con diferente capacidad. La captura de los exosomas por las CD plasmacitoides no modifica su estado de activación. Además, las CD plasmacitoides cargadas con los exosomas son capaces de estimular linfocitos T autólogos lo que sugiere que esta población podría tener un papel en la presentación de aloantígenos. Por último, hemos generado CD tolerogénicas en presencia de dexametasona con el fin de evaluar su efecto en un modelo de trasplante renal en rata. Los aloantígenos donantes fueron obtenidos a partir de exosomas derivados de células dendríticas inmaduras derivadas de médula ósea. Tras la captura de los exosomas donantes, las CD presentan un fenotipo semi-maduro y un perfil de citocinas anti-inflamatorio. Aunque estas DC tolerogénicas no mejoran la supervivencia del aloinjerto tras su inyección vía intravenosa en las ratas receptoras del riñón, son capaces de modificar el número de células B en sangre periférica. Además, los experimentos in vitro muestran que las CD tolerogénicas son capaces de inhibir la proliferación dependiente de LPS de las células B. Estos resultados indican que las CD tolerogénicas, cargadas o no con exosomas donantes in vitro, pueden tener un papel biológico en el rechazo del trasplante a través de la modulación de la respuesta de células B. / Following transplantation, the immune system is triggered to induce an immune response to donor histocompatibility antigens expressed by the graft (allo-antigens), leading to organ rejection. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells and have a fundamental role in the initiation of the immune response to the graft by presenting allo-antigens to T cells through several pathways. However, DCs are also key players in the induction of tolerance. One of the main targets in transplantation is the induction of donor-specific tolerance thereby avoiding chronic administration of immunosuppression, which has many side effects. Understanding the immunological mechanisms involved in transplant rejection has allowed the generation of alternative therapies to conventional immunosuppression. In different animal models, several strategies have been employed to induce graft tolerance such as the injection of tolerogenic DCs. In humans, there are several possible sources of alloantigens including exosomes, which can be isolated from several biological fluids. The aim of this thesis is to investigate the potential use of plasma-derived exosomes as a source of alloantigens, the ability of human peripheral blood dendritic cells to capture allogeneic exosomes and finally, evaluate the effect of recipient tolerogenic DCs on allograft survival in a model of allogeneic kidney transplantation in rats. Our results provide valuable information about plasma-derived microvesicles. By proteomic analysis, we have detected 161 microvesicle-associated proteins, including many related to the complement and coagulation signal-transduction cascades. However, when exosomes-enriched preparations were analysed the number of proteins identified was much reduced, suggesting that under healthy conditions there are limited amounts of exosomes and, therefore, are not a feasible source of alloantigens. Moreover, our results provide some insight in the interaction of human peripheral blood DCs subsets with allogeneic exosomes. In vitro analyses show that both conventional DCs (cDCs) and plasmacytoid DCs (pDCs) capture exosomes from a T-cell line, although with different ability. The uptake of exosomes does not modify the activation state of pDCs. In addition, exosomes-loaded pDCs are able to stimulate autologous T cells suggesting that this subset could have a role in allo-antigen presentation. Finally, we have generated tolerogenic DCs in the presence of dexamethasone to evaluate their effect in a model of kidney transplantation in rats. Donor alloantigens were obtained from immature BMDCs-derived exosomes. After donor exosomes capture, tolerogenic DCs present a semi-mature phenotype and an anti-inflammatory cytokine profile. Although these tolerogenic DCs do not improve allograft survival, after intravenous injection in kidney recipients are able to modify the number of peripheral blood B cells. In addition, in vitro experiments show that tolerogenic DCs are able to inhibit LPS-dependent proliferation of B cells. These results indicate that tolerogenic DCs, in vitro loaded or not with donor exosomes, may have a biological role in transplant rejection through the modulation of B cell responses.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Reelin is a high molecular weight extracellular glycoprotein that exhibits key roles both in the development of the central nervous system and in adult synaptic plasticity. Reelin expression during brain development is driven by cortical Cajal-Retzius (CR) cells (Alcantara et al., 1998). The secretion of Reelin by these cells ensures a correct splitting of the preplate into marginal zone and subplate (Del Rio et al., 1997; Super et al., 1998). Further, Reelin regulates the inside-out patterning formation of the layered cortical structures (Tissir and Goffinet, 2003). Constitutive Reelin deficit in reel ermice (Goffinet and Dernoncourt, 1991)generate an abnormally layered brain with a highly reduced cerebellum concomitant with numerous cellular ectopia(D'Arcangelo and Curran, 1998). The expression of Reelin undergoes an important change after completion of the neuronal migration processes (Alcantara et al., 1998; Soriano and Del Rio, 2005; Herz and Chen, 2006). This early suggested the existence of a new function for Reelin in the postnatal and adult brain. Heterozygous reeler(HRM)and reeler-like mice presented reduced amounts of Reelin signaling (Liu et al., 2001; Badea et al., 2007; Katsuyama and Terashima, 2009)as well as deficits in synaptic plasticity-related events, such as impairments in long-term potentiation(LTP) paradigms (Weeber et al., 2002; Beffert et al., 2005), altered phosphorylation and composition of NMDA receptors (Chen et al., 2002; Groc et al., 2007), and altered AMPA receptor-mediated responses (Qiu et al., 2006). Further, alterations in spine density were found on HRM and reeler mice (Niu et al., 2008), and adult conditional depletion of Dab1 triggers changes in their morphology (Trotter et al., 2011). More interestingly, Reelin supplementation reverts many of these phenotypes (Qiu and Weeber, 2007; Hellwig et al., 2011; Rogers et al., 2013) and adult Reelin over expression in vivo promotes enhanced LTP (Pujadas et al., 2010). Last, Reelin expression abnormalities have been reported in patients for various psychiatric disorders (Knuesel, 2010; Folsom and Fatemi, 2013).Moreover, it has been related to Alzheimer’s disease(AD) (Knuesel, 2010) and its overexpression in mouse models for ADrevealed delayed progression of the appearance of pathological insults (Pujadas et al., 2014). Here we used transgenic mice overexpressing Reelin (Pujadas et al., 2010)as well as approaches involvingconditional depletion of Dab1 in adult mice (Pramatarova et al., 2008; Teixeira et al., 2014)and in new-born granule cellsof the DG (Teixeira et al., 2012) to study the role of Reelin in the establishment and stabilization of synapses in the adult brain. In the first chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular features and ultrastructureof the presynaptic terminals in the adult hippocampus of Reelin overexpressing (Reelin-OE) mice. We report an enhanced complexity of hippocampal boutons. In the second chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular composition and ultrastructure of the hippocampal dendritic spines of Reelin-OE mice. We report spine hypertrophy, spine apparatus enlargement and redistribution of NMDA receptor subunits and p-cofilin. In the third chapter, we analyze the effects of Reelin signaling up-and downregulationin spine presence and morphology along two types of pyramidal cells, CA1 and S1BF layer 5. We show that Reelin regulates spine plasticity, but that the precise effects are cell-dependent and dendritic domain-specific. In the fourth chapter, we present a new approach for correlative optical microscopy (OM) –focused ion beam / scanning electron microscopy (FIB/SEM) imaging of pre-labeled dendritic segments with diaminobenzidine (DAB). We applied this method to study the synaptic integration into the preexisting circuitryof new-born DG granule cells (GCs). We report that these cells exhibit branched spines, that morphometrical parameters of a spine and synapse correlate and that spine morphologyand presynaptic innervation changes with cell development. Finally, in the fifth chapter we analyze the effects of Reelin signaling up-and down regulationin integration of new-born DG GCsinto the preexisting circuitry. We describe changes in the size and morphology of these spinesand synapses, as well as in their connectivity. REFERENCES: Alcantara S, Ruiz M, D'Arcangelo G, Ezan F, de Lecea L, Curran T, Sotelo C, Soriano E (1998) Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.J Neurosci 18:7779-7799. Badea A, Nicholls PJ, Johnson GA, Wetsel WC (2007) Neuroanatomical phenotypes in the reeler mouse. Neuroimage 34:1363-1374. Beffert U, Weeber EJ, Durudas A, Qiu S, Masiulis I, Sweatt JD, Li WP, Adelmann G, Frotscher M, Hammer RE, Herz J (2005) Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron 47:567-579. Chen Y, Sharma RP, Costa RH, Costa E, Grayson DR (2002) On the epigenetic regulation of the human reelin promoter. Nucleic Acids Res 30:2930-2939. D'Arcangelo G, Curran T (1998) Reeler: new tales on an old mutant mouse. Bioessays 20:235-244. Del Rio JA, Heimrich B, Borrell V, Forster E, Drakew A, Alcantara S, Nakajima K, Miyata T, Ogawa M, Mikoshiba K, Derer P, Frotscher M, Soriano E (1997) A role for Cajal-Retzius cells and reelin in the development of hippocampal connections. Nature 385:70-74. Folsom TD, Fatemi SH (2013) The involvement of Reelin in neurodevelopmental disorders. Neuropharmacology 68:122-135. Goffinet AM, Dernoncourt C (1991) Localization of the reeler gene relative to flanking loci on mouse chromosome 5. Mamm Genome 1:100-103. Groc L, Choquet D, Stephenson FA, Verrier D, Manzoni OJ, Chavis P (2007) NMDA receptor surface trafficking and synaptic subunit composition are developmentally regulated by the extracellular matrix protein Reelin. J Neurosci 27:10165-10175. Hellwig S, Hack I, Kowalski J, Brunne B, Jarowyj J, Unger A, Bock HH, Junghans D, Frotscher M (2011) Role for Reelin in neurotransmitter release. J Neurosci 31:2352-2360. Herz J, Chen Y (2006) Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat Rev Neurosci 7:850-859. Katsuyama Y, Terashima T (2009) Developmental anatomy of reeler mutant mouse. Dev Growth Differ 51:271-286. Knuesel I (2010) Reelin-mediated signaling in neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. Prog Neurobiol 91:257-274. Liu WS, Pesold C, Rodriguez MA, Carboni G, Auta J, Lacor P, Larson J, Condie BG, Guidotti A, Costa E (2001) Down-regulation of dendritic spine and glutamic acid decarboxylase 67 expressions in the reelin haploinsufficient heterozygous reeler mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 98:3477-3482. Niu S, Yabut O, D'Arcangelo G (2008) The Reelin signaling pathway promotes dendritic spine developmentin hippocampal neurons. J Neurosci 28:10339-10348. Pramatarova A, Chen K, Howell BW (2008) A genetic interaction between the APP and Dab1 genes influences brain development. Mol Cell Neurosci 37:178-186. Pujadas L, Gruart A, Bosch C, Delgado L, Teixeira CM, Rossi D, de Lecea L, Martinez A, Delgado-Garcia JM, Soriano E (2010) Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy and long-term potentiation. J Neurosci 30:4636-4649. Pujadas L, Rossi D, Andres R, Teixeira CM, Serra-Vidal B, Parcerisas A, Maldonado R, Giralt E, Carulla N, Soriano E (2014) Reelin delays amyloid-beta fibril formation and rescues cognitive deficits in a model of Alzheimer's disease. Nat Commun 5:3443. Qiu S, WeeberEJ (2007) Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol 97:2312-2321. Qiu S, Zhao LF, Korwek KM, Weeber EJ (2006) Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J Neurosci 26:12943-12955. Rogers JT, Zhao L, Trotter JH, Rusiana I, Peters MM, Li Q, Donaldson E, Banko JL, Keenoy KE, Rebeck GW, Hoe HS, D'Arcangelo G, Weeber EJ (2013) Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J Psychopharmacol 27:386-395. Soriano E, Del Rio JA (2005) The cells of cajal-retzius: still a mystery one century after. Neuron 46:389-394. Super H, Martinez A, Del Rio JA, Soriano E (1998) Involvement of distinct pioneer neurons in the formation of layer-specific connections in the hippocampus. J Neurosci 18:4616-4626. Teixeira CM, Masachs N, Muhaisen A, Bosch C, Perez-Martinez J, Howell B, Soriano E (2014) Transient downregulation of Dab1 protein levels during development leads to behavioral and structural deficits: relevance for psychiatric disorders. Neuropsychopharmacology 39:556-568. Teixeira CM, Kron MM, Masachs N, Zhang H, Lagace DC, Martinez A, Reillo I, Duan X, Bosch C, Pujadas L, Brunso L, Song H, Eisch AJ, Borrell V, Howell BW, Parent JM, Soriano E (2012) Cell-autonomous inactivation of the reelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus. J Neurosci 32:12051-12065. Tissir F, Goffinet AM (2003) Reelin and brain development. Nat Rev Neurosci 4:496-505. Trotter JH, Klein M, Jinwal UK, Abisambra JF, Dickey CA, Tharkur J, Masiulis I, Ding J, Locke KG, Rickman CB, Birch DG, Weeber EJ, Herz J (2011) ApoER2 function in the establishment and maintenance of retinal synaptic connectivity. JNeurosci 31:14413-14423. Weeber EJ, Beffert U, Jones C, Christian JM, Forster E, Sweatt JD, Herz J (2002) Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 277:39944-39952.

Les malalties autoimmunes es caracteritzen per una pèrdua de la tolerància als antígens propis que dóna lloc a l'aparició de limfòcits autoreactius. La susceptibilitat genètica és un factor determinant en el desenvolupament de l'autoimmunitat i és el resultat de l’acció combinada de diversos gens. S'han identificat diferents locus de susceptibilitat i polimorfismes dels gens que contribueixen al desenvolupament de l'autoimmunitat sistèmica. Entre d'altres, s’ha trobat un locus principal de susceptibilitat al lupus eritematós sistèmic (LES) en ratolins (Sle1b) i humans (1q23) localitzat en el cromosoma 1 (Wang et al) que conté els gens de la família SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule), un grup de receptors de membrana amb importants funcions immunoreguladores. Els membres de la família SLAM han estat identificats, en els últims anys, com un grup de receptors que modulen l'activació i la diferenciació d'una àmplia gamma de tipus cel·lulars involucrats en la resposta immune innata i adaptativa. La família SLAM està constituïda per nou molècules de membrana pertanyents a la superfamília de les immunoglobulines (IgSF): SLAMF1, SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229 o LY9)), SLAMF4 (CD244 o 2B4), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (CD352 o NTB-a), SLAMF7 (CD319 o Cracco), SLAMF8 (CD353 o BLAME) i SLAMF9, que s'expressen diferencialment en les cèl·lules del sistema hematopoètic. La regió extracel·lular d'aquests receptors conté típicament un domini immunoglobulina (Ig) variable (IgV) en l'extrem N-terminal i un domini Ig constant (IgC2) a l'extrem C-terminal, excepte SLAMF3 (CD229), que està format per dos sèries de IgV / IgC2. A través d'aquests dominis estableixen interaccions específiques amb els seus lligands, la majoria dels casos de tipus homofílic, excepte la proteïna CD48 que és el receptor de CD224. Els lligands de SLAMF8 i 9 no s'han descrit fins ara. Sis dels receptors SLAM contenen un o més motius ITSM (Immunoreceptors Tyrosine-based switch motif) en la seva cua citoplasmàtica, que serveixen com a llocs d'unió per a molècules adaptadores i enzims amb dominis SH2 (Src homology 2 domains). Les molècules adaptadores SAP (SLAM-associated protein), EAT-2 (EWS / FLI activated transcript-2) i ERT (EAT-2 related Transducer) tenen una gran afinitat per aquest motiu. Estudis amb ratolins mostren l'expressió diferencial de dues isoformes de Ly108 (SLAMF6), que difereixen en la seva regió citoplasmàtica, entre ratolins normals i ratolins susceptibles al lupus. L'expressió de la isoforma Ly108-1, amb dos dominis ITSM, es troba incrementada respecte a l'altra isoforma Ly108-2, amb tres motius ITSM, a les cèl·lules B i T de ratolins susceptibles al lupus en comparació amb ratolins normals. Darrers estudis d'aquesta proteïna demostren l'existència d'una nova isoforma (Ly108-H1), absent en ratolins susceptibles al lupus i que protegeix d'aquesta malaltia als ratolins transgènics. Recentment, s’ha descrit una expressió alterada de dos receptors SLAM, CD244 i CD319, i una expressió diferencial d'isoformes d'aquestes molècules en pacients amb LES. Per tant, un concepte emergent derivat d'aquest i d'altres estudis, és que l'expressió diferencial d'isoformes dels receptors SLAM pot contribuir a la susceptibilitat a trencar l’autotolerància. Un dels membres d'aquesta família és la proteïna CD84, la qual ha estat caracteritzada i estudiada àmpliament en el nostre grup durant els últims anys. Es tracta d'una proteïna d'uns 50-80 kDa depenent del seu grau de glicosilació, amb un ectodomini format per un domini IgV en el seu extrem N-terminal al que li falta el pont disulfur; i un domini IgC2 en el seu extrem C-terminal amb dos ponts disulfur. La seva cua citoplasmàtica conté dos dominis ITSM mitjançant els quals s'uneix al domini SH2 de diferents molècules adaptadores, entre elles SAP. La interacció homofílica té lloc a través del domini IgV. RESULTATS 1. CD84 té almenys quatre ARN missatgers diferents La base de dades ECgene descriu set isoformes de la proteïna CD84. Només en quatre d'aquestes isoformes s'han localitzat seqüències d’ARN missatger i d'ESTs (Expressed Sequence Tag), que juntament amb una estructura proteica compatible, farien possible que aquestes isoformes expressessin a nivell de proteïna. Els estudis in silico realitzats van demostrar que el transcrit H1C22218.5, amb dues seqüències d'ARNm i 91 ESTs correspondria al gen íntegre o full length (CD84_FL); amb una regió codificant de 1017 pb formada per vuit exons. El transcrit H1C22218.2, amb una seqüència d'ARNm i 66 ESTs té una regió codificant de 642 pb a la qual li falten els exons 2 i 5 (CD84_Delta2, 5). En canvi el transcrit H1C22218.3, amb 5 seqüències d'ARNm i 93 ESTs està format per 984 pb i li falta l'exó 5 (CD84_Delta5). Finalment, el transcrit H1C22218.4, amb una seqüència d'ARNm i 88 ESTs està format per 816 pb i li falten els exons 5 i 6 (CD84_Delta5, 6). Estudis previs del grup van demostrar que CD84 s'expressa a nivell de proteïna en diverses línies cel·lulars del sistema immune. Per aquesta raó, i amb la intenció d'esbrinar si les isoformes descrites en les bases de dades eren presents en aquestes línies cel·lulars, es van dur a terme diferents PCR amb oligonucleòtids específics per CD84 dissenyats a les unions dels exons per aconseguir una major especificitat. La primera PCR correspon a una amplificació de la cua citoplasmàtica i dóna lloc a tres bandes de 341 pb, 308 pb i 210 pb. La seqüenciació de les bandes obtingudes demostrar que la banda de 341 pb corresponia a la proteïna íntegra (CD84_FL), mentre que la banda de 308 pb corresponia a una cua citoplasmàtica amb un exó menys, que coincidia amb les seqüències dels transcrits CD84_ Delta2, 5 i CD84_Delta5. Finalment, la banda de 272 pb amplificar una seqüència coincident amb CD84_Delta5, 6. Una segona PCR amb els oligonucleòtids dissenyats a la unió dels exons 1-3, unió present únicament en la possible isoforma CD84_ Delta2,5, va permetre diferenciar entre aquest transcrit i el CD84_Delta5. La seqüenciació de la banda obtinguda va confirmar que es corresponia amb el transcrit CD84_ Delta2,5. L'amplificació de la cua citoplasmàtica en les diferents línies cel·lulars va demostrar que almenys tres de les quatre isoformes esmentades s'expressen en diferents línies cel·lulars com cèl·lules B (Ramos, Namalwa, Raji, Daudi i Cess), cèl·lules T (Jurkat, Hsb2 i Molt4), cèl·lules mieloides (Hl60, U937, K562 i THP-1) i NK (Yt i Nkl). Les isoformes esmentades també es troben expressades en cèl·lules de sang perifèrica de voluntaris sans, en melsa i en amígdala amb una expressió de CD84_Delta5, 6 molt marcada a melsa. La PCR específica per al transcrit CD84_Delta2, 5 demostrar que aquest es troba lleugerament expressat en algunes cèl·lules T i B, però no en NK, PBMC, melsa i amígdala. 2. La isoforma CD84_Delta2, 5 no s'expressa en la membrana Diversos assajos per FACS en cèl·lules · cèl·lules COS-7 transfectades transitòriament amb la construcció pCDNA3.1 CD84_Delta2, 5 i amb l’anticòs a-CD84 2151, el qual reconeix el segon domini immunoglobulina de la proteïna, no van permetre identificar la isoforma. El marcatge intracel·lular per comprovar la presència de la isoforma al citoplasma, també va ser negatiu. Es va decidir doncs utilitzar una construcció de la isoforma que contingués el tag fluorescent GFP, per estudiar la localització de la proteïna. Es van transfectar transitòriament cèl·lules COS-7 i es va observar el resultat en el microscopi de fluorescència, indicant que la proteïna no es troba localitzada a la membrana. A causa de que el nostre interès per aquesta isoforma es centra en el possible paper funcional que podria tenir en faltar-li el domini responsable de l'adhesió, es va decidir seguir amb els assajos funcionals sense estudiar aquesta isoforma. 3. L'anticòs 688.1 contra la cua citoplasmàtica de CD84_Delta5, 6 reconeix específicament aquesta isoforma Aprofitant que la isoforma CD84_Delta5, 6 té en la seqüència de nucleòtids de la seva cua citoplasmàtica un canvi en la pauta de lectura que genera una seqüència d'aminoàcids única, es va generar un anticòs que reconegués específicament aquesta cua. La validació de l'anticòs demostrar que aquest no reconeix la resta d'isoformes de CD84 en transfectants transitoris de cèl·lules COS-7 per FACS, però sí que reconeix la isoforma d'interès. També es va demostrar que l'anticòs 688.1 immunoprecipita específicament la isoforma CD84_Delta5, 6 a transfectants transitoris de cèl·lules COS-7. La immunofluorescència en cèl·lules adherents transfectades transitòriament també mostra l’especificitat d'aquest anticòs enfront de la proteïna íntegra. 4. La isoforma CD84_Delta5, 6 s'expressa diferencialment en les línies cel·lulars testades Un cop identificades les isoformes i analitzada la seva expressió a nivell gènic, l'anticòs generat permetre analitzar l'expressió de l’isoforma CD84_Delta5, 6 a nivell de proteïna. Els estudis per FACS demostren que aquesta està present en totes les línies cel·lulars testades, i els nivells d'expressió es correlacionen amb els resultats obtinguts a nivell gènic, indicant que l'anticòs és sensible a l'expressió diferencial en cadascuna de les línies. D'aquesta manera, mentre que la proteïna CD84 total s'expressa de manera important en les línies de cèl·lules B, els nivells de isoforma CD84_Delta5,6 són baixos en aquest tipus cel·lular. En canvi, en línies de cèl·lules T, on generalment CD84 es troba expressada en un nivell més baix, la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió relativa més elevada. Els nivells més alts d'expressió de la isoforma es troben en les línies de llinatge mieloide, on l'expressió de CD84 total també és alta. En el cas de les línies de cèl·lules NK gairebé la totalitat del CD84 trobat correspon a la isoforma. 5. La isoforma CD84 Delta5, 6 es detecta en les diferents subpoblacions de PBMC estudiades L'anàlisi per citometria de flux en les diferents subpoblacions de PBMC va permetre conèixer l'expressió diferencial de CD84_Delta5, 6 en individus sans. La subpoblació B1 de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5 +), la qual està involucrada en la immunitat humoral, té una expressió de la isoforma més elevada que la resta de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5-). En les cèl·lules T CD4 +, les cèl·lules memòria expressen més la proteïna total que les cèl·lules verges (CD3 + CD4 + CD45ROlow), mentre que la isoforma s'expressa de manera similar en ambdues poblacions. Pel que fa a les cèl·lules · cèl·lules T reguladores (CD4 + CD25 + FoxP3 +), tant el nivell de CD84 total com el de la isoforma és significatiu. En les cèl·lules T CD8 +, l'expressió de CD84 és considerablement més important en cèl·lules efectores memòria (CD8 + CD45RA-CCR7-) que en cèl·lules centrals memòria (CD8 + CD45RA-CCR7 +), com també ho és l'expressió de la isoforma. En canvi, les cèl·lules naïve (CD8 + CD45RA + CCR7 +), tot i tenir una expressió de CD84 total similar a les cèl·lules efectores (CD8 + CD45RA + CCR7-), tenen una expressió de CD84_Delta5, 6 més elevada que aquesta. En cèl·lules NK (CD3-CD16 + CD56 +), l'expressió de la isoforma és elevada en relació a l'expressió de CD84 total. Els monòcits tenen una expressió significativa tant de CD84 com de CD84_Delta5, 6. 6. La isoforma CD84 Delta5, 6 s'internalitza deficientment respecte la proteïna CD84 Estudis d'activació de cèl·lules Jurkat transfectades amb els ADNc de les diferents isoformes van demostrar que la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió més alta després de l'activació que la resta d’isoformes. Això va fer pensar que probablement el fet de no tenir la cua citoplasmàtica amb les quatre tirosines, donaria lloc a un reciclatge deficient de la proteïna i en conseqüència, d'una acumulació en la membrana. Per demostrar si això era cert, es van fer diversos estudis d'internalització amb diferents procediments de citometria, com l’ús de l'aparell Amnis, que combina la citometria de flux amb la microscòpia de fluorescència i permet veure la localització de la proteïna marcada en una cèl·lula. El resultat obtingut va demostrar que les cèl·lules Jurkat transfectades amb la isoforma CD84_Delta5, 6 tenen una internalització més baixa que les transfectades amb CD84_FL, en condicions normals, el que incrementa amb l'activació. 7. Estudi de l'expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a malalties autoimmunes Deu pacients de LES i dotze d'AR van participar en l'estudi de l’expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a les diferents subpoblacions de PBMC analitzades en l'apartat 5. Els resultats obtinguts van ser comparats amb els valors d'expressió dels mateixos paràmetres de dotze voluntaris sans. D'altra banda, es comparar l'expressió de CD84 amb un altre membre de la família SLAM, NTBA, el qual ha estat assenyalat com una proteïna implicada en algunes malalties autoimmunes. En termes generals, es va veure un augment de l'expressió de CD84_Delta5, 6 a totes les subpoblacions estudiades de malalts de LES, resultat que coincideix en un estat d'activació en els estudis in vitro. En AR en canvi, els resultats assenyalen una tendència contrària en algunes subpoblacions. CONCLUSIONS Les isoformes de CD84 d'estudi han estat identificades per PCR en les línies cel·lulars d'interès. S'ha vist que aquestes isoformes es troben expressades de forma diferencial tant en les línies cel·lulars com en cultius primaris. Inicialment la isoforma CD84_Delta2, 5 ens va semblar interessant perquè en faltar el primer domini immunoglobulina, a través del qual té lloc la interacció homofílica, donaria lloc a importants deficiències en la interacció amb altres cèl·lules. Però els resultats observats mostren que la isoforma no transloca a la membrana, el que pot ser degut al fet que part del pèptid líder forma part del segon exó, absent en aquesta isoforma. La manca d'aquest fragment de pèptid líder podria fer que la proteïna no tingués la capacitat de translocar a la membrana. La isoforma CD84_Delta5, 6 té una deficient internalització causa probablement a la manca dels motius tirosina de la seva cua citoplasmàtica. La generació dels anticossos específics per a la isoforma CD84_Delta5, 6 ens va permetre estudiar l'expressió d'aquesta isoforma tant en línies cel·lulars com en les diferents subpoblacions de sang perifèrica. S'ha vist una expressió diferencial en les diferents subpoblacions estudiades, la qual cosa pot estar indicant un paper funcional important d'aquesta isoforma. Una possible explicació que es desprèn dels resultats amb pacients de LES i AR podria ser que la presència de més CD84_Delta5, 6 a la membrana fa que, encara que la proteïna no sigui funcionalment activa a nivell de senyalització intracel·lular, produeixi més adhesió i per tant afavoreixi la senyalització d'altres molècules coestimuladores, donant lloc a una hiperactivació del sistema immune. La conclusió final que es pot extreure d'aquest treball és que hi ha indicis que demostren que CD84 i els seus isoformes podrien tenir un paper important en la ruptura de la tolerància i el desenvolupament de la autoimmunitat. Les dues malalties estudiades, LES i AR, han donat resultats oposats. D'una banda, sembla ser que en el LES ha lloc una activació cel·lular. L'expressió més elevada de la isoforma en cèl·lules naïve podria indicar que CD84 és un factor de susceptibilitat al desenvolupament d'aquesta malaltia. D'altra banda, en AR no s'observa diferència d'expressió en els malalts sense tractament, mentre que el grup tractat presenta un increment de la proporció entre la proteïna total i la isoforma, suggerint que CD84 podria ser un biomarcador en el tractament de l’artritis. / The membrane protein CD84 belongs to SLAM family, in the immunoglobulins superfamily. It was established as a molecule CD (cluster of differentiation) in 1995 in the 6th International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA). In recent years, the SLAM family members have been identified as a group receptors that modulate the activation and differentiation of various cell types involved in the innate and adaptive immune response. In addition, many studies indicate that the genetic region where SLAM family genes are located is a susceptibility locus for Systemic lupus erythematosus (SLE). In the last years, it has been demonstrated some evidences that shows a clear implication of polymorphisms and alternative splicing isoforms generated by different members SLAM family in the development of certain autoimmune diseases, especially in SLE. Following this way, an emerging concept is that the differential expression of isoforms of SLAM receptors may contribute to susceptibility to break self-tolerance. Moreover, studies in our group showed that CD84 is a costimulatory protein widely expressed in the hematopoietic system, both human and mouse. It is in this context that we characterized different isoforms of CD84 and its study possible involvement in the development of autoimmunity.

Las células madre mesenquimales de tejido adiposo (ADSCs) tienen un gran potencial dentro del campo de la ingeniería de tejidos debido a su fácil obtención, capacidad de diferenciación a múltiples linajes, propiedades inmunomoduladoras y producción de factores proangiogénicos y antiapoptóticos. Asimismo, los materiales cerámicos de fosfato de calcio son ampliamente utilizados como biomateriales en la ingeniería de tejidos del hueso, debido a su similitud con la fase mineral del tejido óseo. Además, su combinación con proteínas de matriz extracelular (ECM), factores osteoinductores y otros tipos celulares, puede incrementar la bioactividad del constructo células-biomaterial. A pesar de ello, pocos trabajos existen en la literatura que evalúen la repuesta de células ADSCs frente a biomateriales cerámicos de fosfatos de calcio, empleando recubrimientos con proteínas de ECM y/o el cocultivo de células ADSCs con células endoteliales, como factores claves para el incremento de la inducción de las células hacia linajes osteogénicos. En este sentido, el objetivo del presente trabajo ha sido Evaluar la biocompatibilidad y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales adultas derivadas de tejido adiposo (ADSCs) frente a materiales cerámicos de fosfato de calcio con o sin proteínas de matriz extracelular y células endoteliales. Los resultados mostraron que las células mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano (hADSCs), expresan marcadores característicos de células progenitoras (CD29, CD44, CD73, CD90 Y CD105) y se diferenciaron hacia linajes adipogénico, osteogénico, condrogénico y miogénico. Particularmente las señales de diferenciación osteogénicas de las células hADSCs fueron muy potentes y comparables en gran medida con las de otras líneas de osteoblastos ampliamente utilizadas en el campo de la ingeniería de tejidos tales como las MCT3T3 y hFOB 1.19. Por lo tanto son un excelente modelo celular para la evaluación de biomateriales diseñados con la finalidad de favorecer la regeneración ósea. El diseño de una metodología especial para el cultivo celular sobre biomateriales, permitió la cuantificación eficiente y reproducible del porcentaje de células que se adhieren específicamente al material y el seguimiento de su proliferación. Empleando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se demostró que el biomaterial cerámico KeraOs® (KO) es biocompatible según la ISO 10993-5. El estudio de la respuesta de las células hADSCs frente a diversos biomateriales cerámicos, evidenció que las células se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico sobre los materiales comerciales Bone Ceramic®, Cerasorb® y KeraOs®, aunque no sobre Bio-Oss®. Cada material induce una respuesta osteogénica con un perfil particular en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de los genes osteonectina y osteocalcina. Aunque los biomateriales solos desencadenan la diferenciación de las células, la adición de factores inductores en el medio de cultivo potencia la respuesta osteogénica. El recubrimiento del material KeraOs® con fibronectina, colágeno o la combinación FN/COL incrementó significativamente la producción de matriz extracelular, la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de un mayor número de genes asociados a rutas de diferenciación osteogénicas tales como BMP1, BMP2, Runx2, SMAD1, etc. Sin embargo, respecto a las otras dos proteínas, la fibronectina indujo el mayor aumento en la adhesión celular y la respuesta osteogénica. Por otra parte se observó que el cocultivo de células hADSCs con células endoteliales también incrementó el potencial osteogénico de las células hADSCs. Adicionalmente las células endoteliales formaron estructuras tipo capilar y se incrementó la expresión de marcadores angiogénicos tales como VEGF, VE-cad, α-SMA y Ang-1. Finalmente se evaluó el efecto del biomaterial KeraOs® combinado con fibronectina y células madre autólogas de tejido adiposo sobre la regeneración ósea de perros Beagles. Similar a lo observado con las mesenquimales humanas (hADSCs), las caninas se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico, evidenciando su utilidad como modelo para el estudio de la regeneración ósea tanto in vitro como in vivo. / Human adipose derived mesenchymal stem cells (hADSCs) have great potential for tissue engineering applications. Because hADSCs are available in large number, have the ability to differentiate into multiple lineages, show immunomodulatory properties and release pro-angiogenic and antiapoptotic factors. Calcium phosphate ceramics have been widely investigated in bone regeneration as they have good compatibility, biodegradability and mimic the mineral phase of bone tissue. In addition, the combination of biomaterials with extracellular matrix proteins, osteoinductive factors and/or other cell types can increase the bioactivity of cell-biomaterial constructs. This study aims to evaluate the biocompatibility and osteogenic differentiation response of adult mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) on calcium phosphate materials with or without extracellular matrix proteins and endothelial cells. The results indicate that hADSCs expressed characteristic stem cells markers and were able to differentiate into adipogenic, osteogenic, chondrogenic and myogenic lineajes. In ADSCs the osteogenic differentiation signals are highly potent and comparable with other osteoblast cells lines. Thus, ADSCs are an excellent model to evaluate cell biomaterials designed in order to promote bone regeneration. ADSCs can attach and growth on different kind of biomaterials (Bone Ceramic®, Cerasorb® y KeraOs®) with exception of Bio-Oss. Results showed that the expression profile of osteogenic markers (Alkaline phosphatase (ALP), Osteocalcin (OC) and Osteonectin (ON)) depends of the material. The fibronectin and collagen coating of KeraOs® increased the expression of a wide number of genes related with the osteogenic differentiation of hADSCs, and also promoted a high ALP activity and matrix mineralization. However the fibronectin effects in the cells response are stronger than collagen and fibronectin coating. The coculture of ADSCs with endothelial cells also increased the osteogenic differentiation of hADSCs. Additionally endothelial cells formed capillary-like structures and overexpress angiogenic markers such as VEGF, VE-cad, α-SMA and Ang-1. Finally it was evaluated the effect of KeraOs® biomaterial combined with fibronectin and autologous ADSCs on Beagle dog bone regeneration. The canine stem cell’s response on the material was similar to human stem cells, demonstrating its utility as a model for the study of bone regeneration in vitro and in vivo.

Recentment s’ha descrit que la pràctica intensa d’exercici pot provocar anomalies en la morfologia, funcionalitat i bioquímica del cor, incrementant el risc de patir arítmies. Tot i aquesta associació entre la pràctica intensa d’exercici físic i l’aparició d’arítmies auriculars i ventriculars, no existeix un consens absolut respecte si aquests fenòmens es deuen a malalties cardíaques no diagnosticades (on l’exercici podria ser un factor desencadenant) o en realitat l’exercici és la causa primària que els origina. Per avaluar la hipòtesi de que l’exercici intens provoca el desenvolupament de fibrosi en el miocardi i facilita l’aparició d’arítmies, l’objectiu principal d’aquest treball va ser establir un model animal que permetés estudiar els efectes que l’exercici intens té sobre el cor al llarg del temps. El model experimental va consistir en un fer córrer rates sobre una cinta corredora seguint un protocol d’entrenament intens durant 4, 8 o 16 setmanes. Tots els temps d’estudi comptaven amb un grup control, format per animals de vida sedentària. Posteriorment, es va avaluar l’evolució dels canvis en la morfologia del cor, la deposició de col•lagen en els ventricles i l’expressió d’mRNA i nivells proteics de TGF-beta.1, Fibronectina, MMP-2, TIMP-1, i col•lagen tipus I i tipus III en cada una de les cambres cardíaques. Desprès de 16 setmanes d’exercici els animals havien desenvolupat hipertròfia excèntrica i dilatació auricular, juntament amb aquests canvis també es van observar diferents graus de disfunció diastòlica. Els resultats obtinguts en l’anàlisi de la deposició de col•lagen van mostrar increments significatius en el ventricle dret dels animals sotmesos a 16 setmanes d’exercici intens. A més, es va confirmar la presència de miofibroblasts en aquelles zones on es s’havia observat un increment en la deposició de col•lagen. De la mateixa manera, l’expressió per mRNA i els nivells proteics de la majoria de marcadors de fibrosi estudiats van mostrar increments significatius en el grup d’animals de 16 setmanes d’exercici a ambdues aurícules i al ventricle dret. Finalment, quan es va avaluar la susceptibilitat a la inducció d’arítmies es va observar una major vulnerabilitat a la taquicàrdia ventricular en els animals sotmesos a 16 setmanes, en comparació amb el grup d’animals de vida sedentària. Per tant, mitjançant aquest model animal s’ha confirmat que l’exercici intens i continuat inicia un remodelat per fibrosi, provocant canvis en la funció ventricular i afavorint l’aparició d’arítmies. Una vegada confirmada la hipòtesi inicial, es va avaluar la capacitat de reversió del remodelat cardíac produït en els nostres animals esportistes. Després de 8 setmanes de repòs, es va evidenciar que pràcticament tots els paràmetres cardíacs alterats tornaven a la normalitat. Per tant, els nostres resultats van demostrar que un determinat període de repòs va ser capaç d’aturar i revertir el procés patològic originat per la pràctica d’exercici intens i de llarga durada. El darrer objectiu d’aquest treball va ser avaluar l’efecte de l’administració d’un antagonista del receptor AT1 de l’angiotensina (Losartan) en la prevenció de la formació de fibrosi cardíaca induïda per l’exercici. L’activació del sistema renina-angiotensina es troba alterat en diferents patologies cardíaques i intervé en la formació de fibrosi. El tractament amb Losartan va ser capaç de prevenir la inducció inicial de TGF-beta-1 i el posterior desenvolupament de fibrosi cardíaca induïda per l’exercici. Per tant, aquests resultats obren la porta a la possibilitat d’utilitzar tractaments farmacològics per la prevenció dels efectes adversos de l’exercici sobre el teixit cardíac. / Recent clinical studies suggest that endurance sports may promote cardiac arrhythmias. The aim of this study was to use an animal model to evaluate whether sustained intensive exercise training induces potentially adverse myocardial remodeling and thus creates a potential substrate for arrhythmias. Male Wistar rats were conditioned to run vigorously for 4, 8, and 16 weeks; time-matched sedentary rats served as controls. Serial echocardiograms and in vivo electrophysiological studies at 16 weeks were obtained in both groups. After euthanasia, ventricular collagen deposition was quantified by histological and biochemical studies, and messenger RNA and protein expression of transforming growth factor-_1, fibronectin-1, matrix metalloproteinase-2, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, procollagen-I, and procollagen-III was evaluated in all 4 cardiac chambers. At 16 weeks, exercise rats developed eccentric hypertrophy and diastolic dysfunction, together with atrial dilation. In addition, collagen deposition in the right ventricle and messenger RNA and protein expression of fibrosis markers in both atria and right ventricle were significantly greater in exercise than in sedentary rats at 16 weeks. Ventricular tachycardia could be induced in 5 of 12 exercise rats (42%) and only 1 of 16 sedentary rats (6%; p<0.05). The fibrotic changes caused by 16 weeks of intensive exercise were reversed after an 8-week exercise cessation. In this animal model, we documented cardiac fibrosis after long-term intensive exercise training, together with changes in ventricular function and increased arrhythmia inducibility. If our findings are confirmed in humans, the results would support the notion that long-term vigorous endurance exercise training may in some cases promote adverse remodeling and produce a substrate for cardiac arrhythmias.

Diacylglycerol (DAG) is required for the generation of transport carriers at the Golgi complex. Several enzymatic reactions have been found to contribute to the maintenance of DAG levels at this organelle. However, the specific metabolic pathways that, under physiological conditions, are regulated to produce the DAG required for the membrane trafficking at the Golgi complex are not known. In the first part of this work we worked on the hypothesis that phospholipid synthesis can control DAG levels at the Golgi complex for the generation of transport carriers at the Golgi complex. To study this, we altered phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol synthesis for a short period of time in CHO cells to evaluate the changes in DAG and its effects in membrane trafficking at the Golgi. We found that cellular DAG rapidly increased when PC synthesis was inhibited at the non-permissive temperature for the rate-limiting step of PC synthesis in CHO-MT58 cells. DAG also increased when choline and inositol were not supplied. The major phospholipid classes and triacylglycerol remained unaltered for both experimental approaches. The analysis of Golgi ultrastructure and membrane trafficking showed that 1) the accumulation of the budding vesicular profiles induced by propanolol was prevented by inhibition of PC synthesis, 2) the density of KDEL receptor-containing punctated structures at the endoplasmic reticulum-Golgi interface correlated with the amount of DAG, and 3) the post-Golgi transport of the yellow fluorescent temperature-sensitive G protein of stomatitis virus and the secretion of a secretory form of HRP were both reduced when DAG was lowered. We confirmed that DAG-consuming reactions of lipid synthesis were present in Golgi-enriched fractions. We conclude that phospholipid synthesis pathways play a significant role to regulate the DAG required in Golgi-dependent membrane trafficking. In the second part of this work we investigate the role of phospholipase Cγ1 (PLCγ1), a DAG-producing signalling enzyme, on the membrane traffic at the Golgi complex and in the maintenance of its structure in HeLa cells. We based our work on the effects of the silencing and overexpression of PLCγ1. We found that PLCγ1 is required for post-Golgi trafficking of transmembrane and soluble proteins, that the catalytic activity of PLCγ1 is necessary to maintain the morphology of the Golgi complex, in particular the trans-Golgi compartments, and that PLCγ1 contributes to DAG homeostasis at the Golgi, measured by the localization of the DAG-sensing construct C1-PKCθ-GFP to the Golgi complex. Finally we show that cargo arrival at the Golgi complex increases the DAG production and that PLCγ1 is required for this increase of DAG localized at the Golgi. Our results show for the first time that a physiologic event along the secretory pathway, such as cargo arrival at the Golgi complex, triggers DAG production at this organelle for membrane traffic. We also provide evidence for a pivotal role of PLCγ1 at the Golgi: PLCγ1 mediates the DAG production triggered by cargo arrival and is required for the Golgi structure and membrane traffic at the trans-Golgi compartment. The main conclusions of this work are that: 1- Metabolic pathways for the synthesis of phospholipids that consume DAG regulate its levels at the Golgi complex. 2.- Phospholipid synthesis controls the levels of DAG needed for both retrograde and anterograde trafficking at the Golgi complex. 3.- Cargo arrival at the Golgi complex promotes DAG production. 4.- PLCγ1 is involved in the production of DAG triggered by cargo arrival at the Golgi complex. 5.- PLCγ1 is needed for post-Golgi transport and maintenance of the structure of the Golgi complex.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB) / Ack1 es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que pertenece a la familia de proteínas Ack que está formada por 9 miembros. Ack1 está compuesta por varios dominios de interacción proteína-proteína y un dominio catalítico tirosina quinasa cuya autofosforilación regula parcialmente la función de la proteína (Lougheed et al., 2004). Ack1 se encuentra altamente expresada en cerebro (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006), principalmente en las zonas del hipocampo, corteza cerebral, bulbo olfativo y cerebelo (Urena et al., 2005). Además, se ha demostrado que Ack1 se localiza tanto en dendritas como en regiones presinápticas y su expresión se regula a la alza por un incremento de actividad neuronal (Urena et al., 2005). Las funciones fisiológicas de Ack1 son bastante desconocidas. En conjunto, los datos publicados hasta la actualidad destacan la capacidad de la proteína Ack1 para interaccionar con una gran variedad de proteínas, que indica que Ack1 puede participar en diferentes rutas de transducción de señales, y por tanto, participar en diferentes procesos fisiológicos de las células. Por ejemplo, se ha descrito que puede participar en la regulación del citoesqueleto de actina (Burbelo et al., 1995), en los procesos de endocitosis (Teo et al., 2001), en las cascadas de señalización que resultan de la adhesión celular (Bourdoulous et al., 1998), en la migración celular (Modzelewska et al., 2006), en la proliferación (Nur et al., 2005) y en la supervivencia (Mahajan et al., 2005). La mayoría de funciones de Ack1 conocidas se deducen de las interacciones moleculares de ésta y hasta la actualidad se dispone de muy pocos datos respecto a las competencias biológicas de esta proteína, especialmente a nivel de SNC. Por eso, en esta tesis hemos intentado determinar el papel de la tirosina quinasa Ack1 en las funciones del SNC mediante 5 capítulos de resultados. En el capítulo I explicamos la producción de un anticuerpo monoclonal contra Ack1 que produjimos con el objetivo de poder estudiar la proteína Ack1 a nivel funcional. Este anticuerpo lo produjimos contra la región rica en prolinas de Ack1 con el fin que nos permitiera aumentar la especificidad de nuestros experimentos. En el capítulo II caracterizamos la proteína Ack1 a nivel más funcional. Demostramos que Ack1 es un componente de la vía de señalización de las neurotrofinas, siendo fosforilada en respuesta a neurotrofinas e interaccionando con sus receptores Trk. Además, también describimos que cambios de expresión de Ack1 alteran la neuritogénesis en células PC12 y los patrones de ramificación axonal y dendrítico en neuronas de hipocampo y células granulares de cerebelo. En el capítulo III examinamos la interacción de Ack1 con las proteínas de la densidad postsináptica CaMKII y PSD-95, su fosforilación en respuesta a los estímulos excitadores NMDA y glutamato, y la afectación de los botones axonales de las ramas colaterales de Schaffer por una falta de expresión de Ack1. Los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a una posible implicación de Ack1 a nivel de terminales sinápticos. En el capítulo IV nos centramos en estudiar la interacción de Ack1 con la proteína FAK y su participación en procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1. Los datos obtenidos sugieren una interacción entre ambas proteínas, que Ack1 se fosforila en respuesta a Netrina-1 y una implicación de la proteína Ack1 en los procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1 en células de hipocampo. Finalmente, siendo las proteínas Ack1 y FAK unas proteínas que dependen de su estado de fosforilación para regular su actividad, en el capítulo V de resultados de esta tesis estudiamos las dianas de fosforilación y posibles proteínas de interacción de ambas proteínas, mediante la técnica de espectrometría de masas en muestras de cerebro de ratón en desarrollo, de cerebro de ratón adulto y de cerebro de ratón adulto hiperestimulado. - Bibliografía Bourdoulous S, Orend G, MacKenna DA, Pasqualini R, Ruoslahti E (1998) Fibronectin matrix regulates activation of RHO and CDC42 GTPases and cell cycle progression. The Journal of cell biology 143:267-276. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. The Journal of biological chemistry 270:29071-29074. La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Mahajan NP, Whang YE, Mohler JL, Earp HS (2005) Activated tyrosine kinase Ack1 promotes prostate tumorigenesis: role of Ack1 in polyubiquitination of tumor suppressor Wwox. Cancer research 65:10514-10523. Modzelewska K, Newman LP, Desai R, Keely PJ (2006) Ack1 mediates Cdc42-dependent cell migration and signaling to p130Cas. The Journal of biological chemistry 281:37527-37535. Nur EKA, Zhang A, Keenan SM, Wang XI, Seraj J, Satoh T, Meiners S, Welsh WJ (2005) Requirement of activated Cdc42-associated kinase for survival of v-Ras-transformed mammalian cells. Mol Cancer Res 3:297-305. Teo M, Tan L, Lim L, Manser E (2001) The tyrosine kinase ACK1 associates with clathrin-coated vesicles through a binding motif shared by arrestin and other adaptors. The Journal of biological chemistry 276:18392-18398. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132. / Ack1 is a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in Central Nervous System (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006) that has several protein-protein interaction domains and a catalytic domain that is autophosphorylated, and this process regulates, at least in part, the action of this protein (Lougheed et al., 2004). Moreover, it has been demonstrated that Ack1 is localized in dendrites and presynaptic regions and that its expression is up-regulated by an increase of neuronal activity (Urena et al., 2005). Most of the known functions of Ack1 have been elucidated from interactions of Ack1 with several proteins. But, most of the physiologically functions of Ack1 remain to be described, especially in CNS. For this reason, the aim of this thesis has been to unravel some of these functions on CNS that are described through 5 chapters. In the 1st chapter we have explained the production of a monoclonal antibody against Ack1 that allowed us to improve the specificity of our experiments and to study Ack1 at a functional level. In the 2nd chapter we have demonstrated that Ack1 is a component of the neurotrophin pathway, because it is phosphorylated as a response to neurotrophins and interacts with Trk receptors. Moreover, we also have described how changes in Ack1 expression alter neuritogenesis and axonal and dendritic ramification. In the 3th chapter we have analyzed the interaction of Ack1 with the postsynaptical proteins CaMKII and PSD-95, its phosphorylation in response to excitatory stimulus such as NMDA or glutamate and we have described that a lack of Ack1 expression decrease the size of axonal buttons. These data suggest an implication of Ack1 at a synaptic level. In the 4th chapter we focused on the determination of the interaction of Ack1 and FAK, the Ack1 phosphorylation in response to Netrin-1 and the effect of Ack1 in chemoattraction regulated by Netrin-1. Finally, in the 5th chapter we studied the phosphorylation sites and the possible interacting proteins of FAK and Ack1 by mass spectrometry in samples of mice brain in development, of adult mice brain and of adult mice overstimulated brain. - Bibliography La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.