L'escorça prefrontal (EPF) és necessària per dur a terme funcions cerebrals superiors com la presa de decisions, la memòria de treball o l'atenció. S'han descrit diferents alteracions anatòmiques i funcionals en aquesta regió cerebral en malalties psiquiàtriques com l'esquizofrènia i la depressió.El receptor 5-HT(1A) té una funcionalitat dual actuant com a autoreceptor en les dendrites i el soma de les neurones serotoninèrgiques i com a heteroreceptor en àrees postsinàptiques com l'EPF i l'hipocamp. Ha estat implicat en la fisiopatologia de diferents malalties psiquiàtriques, entre elles, l'esquizofrènia o la depressió. Per aquest motiu la modulació del receptor 5-HT(1A) sembla ser una possible diana terapèutica per aquest tipus de trastorns.Els objectius de la present tesi són estudiar els efectes d'agonistes del receptor 5-HT(1A) (clàssics -8-OH-DPAT- i de nou desenvolupament -F15599, F13640) sobre l'activitat de l'EPF tant a nivell neuronal com poblacional i caracteritzar les subpoblacions de receptors implicades en els efectes provocats per aquests agonistes. A més, caracteritzar en models animals un nou antagonista del receptor 5-HT(1A) (DU 125530) per validar la seva possible aplicació per la potenciació del tractament antidepressiu.Per dur a terme els objectius plantejats es van utilitzar tècniques electrofisiològiques de registre extracel·lular unitari i registres del potencial de camp en animal anestesiat a més d'estudis de microdiàlisi intracerebral.Les conclusions obtingudes en la present tesi són:1. Agonistes del receptor 5-HT(1A) amb diferent estructura química provoquen majoritàriament, però amb patrons de resposta distintius, excitacions de les neurones piramidals d'EPF mitjançant un mecanisme depenent de circuit que implica les interneurones GABAèrgiques de la mateixa EPF. Aquesta excitació podria facilitar la neurotransmissió dels nuclis aminèrgics mesencefàlics a aquesta àrea i afavorir l'activitat de l'EPF en tasques com la memòria de treball.2. Els diferents agonistes 5-HT(1A) emprats en la present tesi (8-OH-DPAT, F15599 i F13640) inhibeixen les neurones serotoninèrgiques del nucli del rafe dorsal però actuen amb diferent potència relativa sobre els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics vs. els autoreceptors presinàptics. Així, dels tres fàrmacs testats, l'F15599 mostra un perfil novedós amb una acció preferent sobre els heteroreceptors corticals comparat amb l'F13640 i la 8-OH-DPAT. L'eficàcia de l'F15599 en models animals de depressió i dèficits cognitius el fa interessant per al tractament de malalties psiquiàtriques, evitant els efectes secundaris produïts per activació de l'autoreceptor.3. El DU 125530 és un antagonista del receptor 5-HT(1A) molt potent en models animals, capaç d'antagonitzar tant respostes a nivell d'autoreceptor com a nivell d'heteroreceptor postsinàptic. Aquest fàrmac permet potenciar l'augment de serotonina produït per antagonistes selectius de la recaptació de serotonina però també bloqueja els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics. Així, l'augment de funció serotoninèrgica produït pel bloqueig dels autoreceptors sembla que no es tradueix en un major efecte antidepressiu possiblement degut al bloqueig dels receptors 5-HT(1A) postsinàptics.4. A part de les diferències regionals en la funcionalitat del receptor 5-HT(1A) ja conegudes, la present tesi planteja possibles diferències a nivell cel∙lular entre subpoblacions de receptors 5-HT(1A) situats en tipus neuronals diferents (piramidals vs. GABAèrgiques i vs. serotoninèrgiques). El disseny de fàrmacs amb capacitat d'actuar preferentment sobre els receptors situats en tipus cel·lulars determinats podria ser una estratègia interessant pel tractament de malalties psiquiàtriques. / The 5-HT(1A) receptor is an inhibitory receptor acting as autoreceptor in serotonergic neurons and as heteroreceptor at postsynaptic areas such as the prefrontal cortex (PFC). The PFC has shown to be a key area for cognitive processes such as working memory or attention and is altered in different psychiatric disorders, such as schizophrenia and depression. Moreover, the 5-HT(1A) receptor seems to be involved in the physiopathology and etiology of psychiatric disorders, suggesting that the modulation of this receptor could be an interesting strategy for the treatment of schizophrenia and depression. This thesis is based in the hypothesis that proposes that psychoactive drugs modulate cortico-mesencephalic circuitries involving PFC and mesencephalic monoaminergic nuclei. Specifically, 5-HT(1A) receptors of PFC may have a key role in this modulation. Under this hypothesis, the general aim of the thesis was to study the effects of 5-HT(1A) agonists and antagonists on the unitary and population activity of PFC and raphe nuclei.To carry out this work, we performed single unit and local field potential recordings as well as intracerebral microdialysis studies in anaesthetized animals.The main conclusions of this study are:- 5-HT(1A) agonists cause mainly excitations on PFC pyramidal neurons through a mechanism involving PFC GABAergic interneurons. This excitation could facilitate monoaminergic neurotransmission to PFC and favor PFC activity in cognitive tasks.- Different 5-HT(1A) agonists display different relative potency modulating the activity of PFC vs. raphe neurons. Whereas classical agonists act preferentially on serotonergic neurons, F15599 can modulate preferentially the activity of PFC pyramidal neurons, showing interesting characteristics for the treatment of depression and cognitive/negative symptoms in schizophrenic patients.- Despite DU125530 is a potent 5-HT(1A) antagonist in animal models, antagonizing effects at presynaptic and postsynaptic levels and potentiating the increase of serotonin induced by SSRIs, it's not able to improve antidepressant treatment when administered with fluoxetine to depressed patients.- Besides the regional differences in 5-HT(1A) receptor functionality already known, the thesis suggests possible differences at the cellular level among 5-HT(1A) receptors of different cell types. Designing drugs targeting preferentially specific cell types could be an interesting strategy for the treatment of psychiatric disorders.

La aterosclerosis, engrosamiento de la pared arterial, puede progresar gradualmente hasta complicarse con la aparición de un trombo ocasionando una obstrucción brusca de una arteria con obliteración del flujo en el órgano irrigado por dicha arteria. Según su localización, esta oclusión puede dar lugar a un accidente cerebrovascular (CVA), una obstrucción arterial periférica o a un síndrome coronario agudo (ACS). Dentro de los ACS podemos encontrar la angina inestable, el infarto agudo de miocardio con y sin elevación de ST y la muerte súbita. Estas manifestaciones agudas de la enfermedad cardíaca comparten un mismo fenómeno patofisiológico: la aterotrombosis coronaria y resultan de una isquemia aguda del miocardio. Aunque se han producido grandes avances en el tratamiento de esta enfermedad, la medicina actual no es capaz de predecir el riesgo de sufrir patología cardiovascular. Pese a la gran influencia de los factores de riesgo clásicos tales como la dislipemia, la diabetes, la hipertensión y la obesidad, una proporción importante de los eventos ocurren en individuos que no presentan ninguno de estos factores. De ello deriva la actual necesidad de identificar nuevos biomarcadores que mejoren la predicción global de riesgo de enfermedad cardiovascular. En los últimos años la proteómica se ha convertido en una estrategia básica para el estudio del perfil proteico y de asociaciones proteicas complejas en una muestra biológica. Mediante el uso de técnicas proteómicas se pueden determinar modificaciones en la estructura de una proteína, así como sus niveles de expresión y la presencia de modificaciones post-traduccionales, que pueden estar asociadas a una patología determinada y tener valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico. Se han propuesto muchas moléculas como marcadores de la aterotrombosis, pero los resultados no son consistentes y la mayoría de ellos no ha llegado a utilizarse en la práctica clínica. Por eso cada vez hay una mayor necesidad de integrar las técnicas proteómicas en el descubrimiento de nuevos biomarcadores lo que permitirá conocer nuevos mediadores y vías patofisiológicas sin una asociación previa a las patologías cardiovasculares. En este trabajo se han aplicado técnicas de proteómica diferencial para el estudio de los cambios que se dan a nivel sérico en la fase aguda tras un infarto agudo de miocardio (AMI) de nueva presentación. Mediante la comparación del perfil proteómico de pacientes AMI e individuos sanos se han detectado importantes cambios en el patrón de distribución de dos grupos de proteínas: relacionadas con el metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y relacionadas con el metabolismo del retinol, vía no asociada hasta el momento con el AMI. Dentro de las proteínas del metabolismo de las HDL encontramos cambios en la fase aguda post-AMI en la apolipoproteína J y la transtiretina (TTR). Ésta última también muestra cambios en situaciones de alto riesgo cardiovascular como la hipercolesterolemia familiar. A su vez, también se han detectado cambios en la proteína mayoritaria de las HDL, la apolipoproteína A-I, pero en este caso en una fase más tardía post-AMI y en pacientes diabéticos. Las proteínas relacionadas con el metabolismo del retinol que muestran un perfil diferencial son la TTR y la proteína plasmática de unión a retinol (RBP4). En una segunda parte de este trabajo se han estudiado los cambios proteómicos que se dan a nivel de tejido cardíaco en un modelo experimental porcino de AMI y se ha encontrado por primera vez una asociación de la vía de señalización del receptor del hidrocarburo de arilo con el daño producido por la reperfusión posterior a un AMI.. Además se ha visto que la aplicación de un procedimiento cardioprotector como es el post-condicionamiento isquémico atenua la activación de dicha vía inducida por la reperfusión. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of morbidity and mortality. Atherosclerosis, the underlying mechanism of cardiovascular diseases, progresses gradually until the blood flow is compromissed leading to the precipitaton of an acute ischemic event such as acute coronary syndrome (ACS) or ictus. Identifying subjects at risk of developing an acute ischemic event remains one of the great challenges of cardiovascular medicine. Classical approaches, such as the presence of cardiovascular risk factors, are unable to accurately predict cardiovascular events. During the last years several studies have been focussed on the search for new plasma biomarkers of acute ischemic events. Although many potential molecules have been described, the results have not been consistent enough and most of them are not used in clinical practice. Until now, the only group of accepted biomarkers for the diagnosis of acute myocardial ischemic events are troponins. Nevertheless, these structural proteins are released to the circulation as a consequence of an irreversible injury of the myocardium. Therefore there is still a need for the identification of new biomarkers that will allow the early detection of an ischemic event before the irreversible necrosis of the myocardium occurs. Proteomic technologies allow the identification of molecules related to new pathways that together with traditional markers could act as a multibiomarker for diagnosis, prognosis and treatment, and therefore become a key tool for the development of new approaches in the prevention of cardiovascular diseases. In this study by applying proteomic technologies such as bi-dimensional electrophoresis we have compared the serum proteomic profile of patients with an acute new-onset myocardial infarction (AMI) to that of healthy individuals and found important changes in two main group of proteins: HDL-related proteins (apolipoproteins J and A-I, and TTR) and retinol metabolism associated proteins (TTR and RBP4). In a second part of the work by the study of proteomic changes that occur in the myocardial tissue after an AMI in a swine experimental model we have found, for the first time, an association of the aryl hidrocarbon receptor signalling pathway with the reperfusion injury after an AMI. Moreover, we have found an attenuation of the same pathway in response to a cardioprotective approach such as ischemic post-conditioning.

El tratamiento de Enriquecimiento Ambiental (EA) incrementa la estimulación y proporciona oportunidades más ricas y variadas de interacción con el entorno social y físico y ha demostrado ejercer una gran variedad de efectos a largo plazo a nivel neuroanatómico, neuroquímico y conductual en varias especies animales. El EA aumenta el tamaño de la corteza cerebral, incrementa las ramificaciones dendríticas y la neurogénesis hipocampal y mejora las capacidades cognitivas en una variedad de tareas. No obstante, aunque algunas investigaciones han descrito efectos diferenciales del EA en función del sexo, la gran mayoría de estudios que han evaluado los efectos del EA se han realizado con sujetos macho. Además, en humanos existen importantes diferencias de sexo en un gran número de psicopatologías, como la depresión, la esquizofrenia o la adicción a drogas, lo cual evidencia la necesidad de incluir a las hembras en los diseños experimentales. La presente tesis se propone estudiar los efectos del EA en ratas Sprague-Dawley de ambos sexos en pruebas que evalúan exploración y memoria social, reactividad emocional, mecanismos atencionales, aprendizaje y adicción a drogas a lo largo de dos bloques experimentales. El tratamiento se inició después del destete colocando a los animales en grupos de 9-12 individuos en jaulas de enriquecimiento durante 8 o 12 semanas, donde se cambiaban la configuración espacial y los objetos. Las ratas control se estabularon en grupos (2-3 individuos) en jaulas estándar. En el primer bloque experimental se realizaron dos estudios con el propósito de evaluar los efectos del EA en exploración social mediante la prueba de Discriminación Social; en reactividad emocional, mediante el Laberinto elevado en cruz, la respuesta de sobresalto ante un estímulo acústico y la respuesta del eje Hipotálamo-Pituitario-Adrenal en condiciones basales y en respuesta a la exposición a la prueba de la Tabla de agujeros; en mecanismos atencionales, mediante el paradigma de inhibición prepulso; y en aprendizaje espacial, mediante el laberinto Hebb-Williams. Los resultados de este primer bloque mostraron que el EA disminuyó la emotividad en machos y hembras como se observó por la mayor conducta en los brazos abiertos del laberinto elevado en cruz, la mayor exploración en la tabla de agujeros y la menor reactividad del eje HPA en comparación con los animales control. De manera inesperada, el EA disminuyó el porcentaje de inhibición prepulso en machos y hembras, resultado que contrastó con el efecto de mejora en la ejecución del laberinto Hebb-Williams que produjo el tratamiento en los mismos sujetos experimentales. En las pruebas de exploración y reconocimiento social, el EA mostró un efecto diferencial en función del sexo ya que aumentó la exploración y el reconocimiento social en los machos pero los disminuyó en las hembras. El segundo bloque experimental constituyó el tercer estudio, donde se evaluaron los efectos del EA en el consumo de cocaína mediante el paradigma de autoadministración intravenosa. Los resultados mostraron efectos de sexo y de tratamiento, de forma que las hembras se autoadministraron más cocaína que los machos, y el EA aumentó la autoadministración en machos y hembras de forma diferencial. Así, el EA afectó predominantemente a las hembras, quienes aumentaron la conducta de búsqueda de cocaína realizando un número mayor de respuestas en la palanca asociada a la droga. En conjunto, los resultados del presente trabajo indican que el tratamiento de EA produce efectos diferenciales en machos y hembras en función de las tareas evaluadas. / Environmental Enrichment (EE) increases stimulation and provides richer sensory, cognitive and motor stimulation through the interaction with the social and fisical environment and produces a wide range of neuroanatomical, neurochemical and behavioral effects in several animal species. Various studies have shown that EE increases brain weight and thickness, dendritic branching and length and also increases hippocampal neurogenesis and survival of newly generated neurons. With regard to cognitive function, it has been consistently shown that EE improved spatial learning in several tasks. But the results obtained from the experiments measuring the effects of EE treatment have been done mainly with male rats, though some results clearly showed sex differences in response to EE. Furthermore, a surge of findings from animals and humans have shown sex differences in several psychopathologies, as depression, esquizofrenia and drug addiction. The aim of the present thesis was to study sex differential effects of EE in Sprague-Dawley rats in tasks that measure social exploration and memory, emotional reactivity, sensoriomotor gating, spatial learning and drug addiction. The work has been divided in 2 experimental blocks: after weaning, rats were housed in groups of 9 -12 in enriched cages during 8 or 12 weeks, were the spatial configuration and objects were changed frequently. Control rats were housed in groups (2-3 animals) in standard cages. In the first experimental work we did two studies, where we studied social exploration in the Social discrimination test; emotional reactivity in the Elevated plus maze, Acoustic startle response and responsiveness of the hypothalamic-pituitay-adrenal (HPA) axis in response to the Hole board test; we measured attentional mechanisms through the prepulse inhibition paradigm; and spatial learning in the Hebb-Williams maze. The main results indicated that enriched animals appeared less emotional since they increase open arm activity, they showed more exploratory behavior in the hole board and less HPA reactivity than controls. EE showed a significant reduction of prepulse inhibition compared to control rats, in contrast with the improvement showed by the enriched rats in the Hebb-Williams maze. Furthermore, the EE effects in the patterns of social investigation were sex dependent, and EE treatment increased exploratory behavior and social discrimination in males and decreased social discrimination in females. In the second experimental block we performed the third study, where we evaluated the effects of EE on cocaine consumption by means of the intravenous self-administration paradigm. The results showed sex and treatment effects, females were more sensitivity to cocaine as shown by the greater amount of cocaine intake. EE increased self- administration in both male and female rats, but females were more affected than males as showed by the higher levels of infusions and the increase in the responses in the active lever. The results of the present thesis indicate that EE treatment produce differential effects in male and female rats in a task dependent manner.

No description available.

El PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) es un factor de crecimiento que activa la proliferación y migración de las células musculares lisas y que por consiguiente, presenta importancia fundamental en el desarrollo de la aterosclerosis. El PDGF de cadena -A y de cadena -B presentan distintas isoformas de cadena larga o corta que se diferencian según la presencia o ausencia de la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son componentes glucídicos de los proteoglicanos que entre otras funciones median la actividad de los factores de crecimiento en la superficie de las células y en la matriz extracelular.En el trabajo de esta tesis doctoral nos planteamos los objetivos siguientes:- Caracterizamos la unión de las isoformas de PDGF a las diferentes especies de glicosaminoglicanos utilizando los clones de células CHO que presentan diferencias en la expresión de glicosaminoglicanos y en las hASMC (células musculares lisas provenientes de arteria humana). - Estudiamos el efecto de las diferentes isoformas de PDGF en la mitogénesis y migración en las hASMC. En este último punto, estudiamos el efecto de las isoformas de PDGF en cuanto a la inducción de la migración al azar (quimiocinesis) y la migración dirigida (quimiotaxis) hacia los factores de crecimiento.- Analizar la importancia de la interacción de las isoformas de PDGF con los glicosaminoglicanos en la activación de la mitogénesis y migración inducida por el PDGF en las hASMC. Con este fin, utilizamos la heparina como competidor soluble de la interacción con los glicosaminoglicanos e inhibidores de la sulfatación y de la síntesis de los glicosaminoglicanos.Los resultados de este trabajo nos permiten concluir que:- Las isoformas de PDGF de cadena larga (y principalmente el PDGF-A de cadena larga) que presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor afinidad de unión a la membrana de las células CHO y hASMC.- Las isoformas de PDGF de cadena larga se unen a glicosaminoglicanos de tipo heparán sulfatos y a glicosaminoglicanos de tipo condroitín sulfatos. Las isoformas de PDGF de cadena corta se unen principalmente a heparán sulfatos.- El PDGF-B de cadena corta es la isoforma de PDGF que activa en mayor grado la mitogénesis, quimiotaxis y quimiocinesis en las hASMC.- La heparina y el clorato sódico (inhibidor de la sulfatación de los glicosaminoglicanos) inhiben de forma parcial y dependiente de concentración la mitogénesis de las hASMC activada por los factores del suero. La heparina también inhibe de forma parcial y dependiente de concentración la quimiotaxis de las hASMC inducida por los factores del suero.- La heparina inhibe en mayor grado la quimiotaxis que la mitogénesis de las hASMC activada por el PDGF-B de cadena corta.- La mitogénesis de las hASMC activada por las isoformas de PDGF se inhibe principalmente por el clorato sódico y beta-xilósido (inhibidores de la sulfatación y de las síntesis de glicosaminoglicanos respectivamente).En consecuencia, estos resultados sugieren que la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos presenta importancia en la inmovilización y retención de las isoformas de PDGF por parte de los glicosaminoglicanos de la superficie y de la matriz extracelular. Las isoformas de PDGF de cadena corta que no presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor efecto inductor de la proliferación y migración de las células musculares lisas.

El pas per cada fase del cicle cel.lular està controlat per processos de fosforilació duts a terme pels enzims coneguts com a quinasses depenents de ciclines (CDKs). En les cèl.lules de mamífers, l'enzim CDK2 complexat amb la Ciclina A actua com a principal promotor del pas de la fase G1 a la fase S i de la progressió per la fase S del cicle cel.lular. Així doncs, el complexe Ciclina A-CDK2 s'uneix a diverses proteïnes reguladores en diferents moments durant la progressió del cicle cel.lular. Una d'aquestes proteïnes reguladores és p45(SKP2).La finalitat d'aquesta tesi ha estat analitzar el paper de 045(SKP2) en la progressió de la fase S del cicle cel.lular, més enllà de la seva important implicació en la ubiqüitinització de proteïnes. El projecte ha inclòs la identificació de noves interaccions proteiques de p45(SKP2) i la caracterització funcional d'aquesta interacció.

L’èxit de la transferència nuclear de cèl·lules somàtiques (SCNT) depèn de diversos factors que fan que tingui una eficiència baixa. D’una banda, l’extensa reprogramació nuclear que ha de tenir lloc per tal que el patró d’expressió del nucli somàtic transferit sigui substituït per un patró de tipus embrionari no sempre es dóna correctament. El tractament dels embrions clonats amb inhibidors de les desacetilases d’histones (HDACis) corregeix el seu estat hipoacetilat i hipermetilat, facilitant l’accés dels factors reprogramadors de l’oòcit al nucli transferit i afavorint així la reprogramació nuclear. En canvi, el paper positiu d’altres modificadors epigenètics, p. ex. les desmetilases d’histones (HDMs), és objecte de controvèrsia. D’altra banda, l’oòcit ha de patir una sèrie de manipulacions durant la SCNT que afecten la viabilitat dels embrions. En aquest sentit, s’ha vist que l’ús de latrunculina A (LatA) enlloc de citocalasina B com inhibidor de la polimerització d’actina millora el desenvolupament a terme dels embrions clonats tractats amb HDACis, però es desconeix el seu efecte sobre el desenvolupament in vitro i els embrions no tractats. A més, els embrions clonats són molt sensibles a les condicions de cultiu i actualment no es disposa de mètodes no invasius per a la predicció del seu potencial de desenvolupament que puguin incrementar les taxes d’èxit obtingudes. En aquesta tesi s’ha aconseguit millorar l’eficiència del clonatge de la soca de ratolí B6CBAF1 del 0-0,5 %, en embrions no tractats, al 3-5 % en embrions tractats amb la psamaplina A (PsA), un HDACi que no havia estat mai utilitzat en estudis de reprogramació nuclear, i/o la vitamina C (VitC), un antioxidant que a més s’ha descrit que actua com a cofactor de les HDMs amb domini Jumonji i de les proteïns de translocació deu-onze. A més, s’ha vist que la VitC incrementa significativament l’obtenció de cèl·lules mare embrionàries a partir dels embrions clonats. En canvi, no s’han pogut millorar els resultats prèviament obtinguts amb el HDACi àcid valproic (VPA), malgrat l‘increment de la concentració i durada del tractament testat. Així com s’ha vist que tant el VPA com la PsA milloren la reprogramació nuclear mitjançant un increment general dels nivells d’acetilació de les histones, no s’ha pogut detectar un efecte equivalent per a la VitC. D’altra banda, s’ha vist que la LatA millora les taxes de desenvolupament in vitro, sobretot en els embrions no tractats amb modificadors epigenètics. No obstant, aquest efecte no es tradueix en un millor desenvolupament a terme si la LatA no es combina amb un modificador epigenètic com la PsA o la VitC. Per tant, la LatA podria estar involucrada en la reprogramació nuclear i exercir un efecte sinèrgic amb els modificadors epigenètics en la SCNT. Finalment, els embrions clonats han estat monitoritzats amb un sistema de time-lapse que no perjudica el seu desenvolupament in vitro. S’ha demostrat que aquests embrions es desenvolupen més lentament que els fecundats a partir de la segona divisió, i que el tractament amb modificadors epigenètics afecta la cinètica de desenvolupament. En concret, quan els embrions clonats són tractats amb la PsA la seva divisió s’alenteix i el retard es manifesta abans. En canvi, quan són tractats amb la VitC es divideixen més ràpidament i són més semblants als embrions fecundats. S’ha pogut establir un model de predicció del potencial de desenvolupament de tots aquests embrions basat en el moment de la divisió cap a l’estadi de quatre cèl·lules, sol o combinat amb la durada de la compactació i/o la fragmentació per augmentar-ne la potència. La validació d’aquest model podria permetre la selecció dels embrions amb major potencial de desenvolupament abans de la seva transferència a femelles receptores. / Somatic cell nuclear transfer (SCNT) success depends on a wide range of factors which limit its efficiency. On one hand, the vast nuclear reprogramming that the somatic nucleus transferred must undergo for gene expression to change from a differentiated to an embryonic pattern is often defective. It is well known that treatment of SCNT embryos with histone deacetylase inhibitors (HDACis) corrects the hipoacetylation and hipermethylation of their genome, and this helps reprogramming factors in the ooplasm to gain access to the transferred nucleus, improving nuclear reprogramming. But the role of other epigenetic modifiers, such as histone demethylases (HDMs), is unclear. On the other hand, the manipulations performed on the oocyte during the SCNT protocol affect its viability. In this sense, the use of latrunculin A (LatA) instead of cytochalasin B for actin polymerization inhibition significantly improves the development to term of HDACitreated SCNT embryos. However, its effect on in vitro development and on untreated embryos is unknown. In addition, SCNT embryos are especially sensible to in vitro culture conditions and a non-invasive method for the prediction of their developmental potential, which could increase success rates, is lacking. In this thesis, the cloning efficiency of B6CBAF1 mice has been improved from 0-0.5 %, in untreated embryos, to 3-5 % in embryos treated with psammaplin A (PsA), an HDACis never used in nuclear reprogramming studies before, and/or vitamin C (VitC), an antioxidant reported ti act as a cofactor of Jumonji-domain-containing HDMs and ten eleven translocation enzymes. Both epigenetic modifiers have also proved to improve embryonic stem cell derivation from SCNT embryos. However, the cloning efficiency previously achieved treating SCNT embryos with the HDACi valproic acid (VPA) has not been improved, in spite of the increase of its concentration and exposure time tested. PsA and VPA have been shown to improve nuclear reprogramming through the increase of histone acetylation levels in SCNT embryos, but an effect of VitC on the nuclear reprogramming of SCNT embryos has not been detected. In addition, it has been shown here that LatA improves in vitro developmental rates, especially of those embryos non-treated with epigenetic modifiers. However, in order to improve full-term development, LatA has to be combined with an epigenetic modifier such as PsA or VitC. Thus, LatA could be involved in the nuclear reprogramming of SCNT embryos and might exert a synergistic effect with epigenetic modifiers. Finally, the development of SCNT embryos has been assessed with a time-lapse system that does not reduce their viability. We observed that SCNT embryos are delayed, from the second division, in comparison with fertilized embryos, and that the epigenetic modifier treatment has an effect on embryo kinetics. In particular, when embryos are treated with PsA the delay is more pronounced and appears earlier. In contrast, VitC accelerates the developmental kinetics of SCNT embryos, making them more similar to fertilized ones. A prediction model for the developmental potential of SCNT embryos (both untreated and treated) has been established, based on the time of division to the four-cell stage, alone or combined with compaction duration and/or fragmentation to increase prediction accuracy. The validation of this model would allow the selection of SCNT embryos with higher developmental potential prior to their transfer to recipient females.

La línea de investigación presentada en esta tesis representa un primer acercamiento entre los estudios sobre Hidrología y Metabolismo Social. La línea nace de la observación de que el agua es evitada en los estudios que tratan el metabolismo y de que la ciencia del agua –si bien reconoce la necesidad de evolucionar hacia la interdisciplinariedad- todavía no ha conseguido conectar los análisis enfocados en la sociedad y en los ecosistemas. La contribución que se hace en este trabajo es precisamente la definición de un marco analítico –el Metabolismo Hídrico de los Socio-ecosistemas- donde se puede establecer esta conexión y que está formado por una propuesta conceptual y un set de herramientas metodológicas. El documento se divide en tres partes donde se discuten las novedades epistemológicas, metodológicas y formales del marco. La Parte I cubre las reflexiones epistemológicas relacionadas con el marco analítico. Éstas comienzan en el Capítulo 1 con la explicación de los restos a los que la ciencia del agua se enfrenta y que están relacionados con la necesidad de encontrar marcos analíticos que puedan proporcionar inputs relevantes para la gestión integrada de los recursos hídricos (GIRH). Al igual que para el caso de otros recursos, la GIRH requiere el establecimiento de una conexión analítica de las dinámicas sociales y de los ecosistemas. La analogía del metabolismo de la sociedad, como una de las piezas claves de la Ciencia de la Sostenibilidad, es una buena opción para establecer esta conexión. Sin embargo, el concepto de metabolismo necesita ser examinado de cerca antes de su uso combinado con otras concepciones de las relaciones entre el ser humanos y la naturaleza. Tras subrayas que el metabolismo de las sociedades y los ecosistemas son dos procesos distintos per conectados, en el Capítulo 2 se propone un esquema para la descripción de las relaciones metabólicas entre ellos. En el capítulo 3, este esquema es adaptado a las condiciones específicas del agua, usando algunos de los conceptos más relevantes en socio- y eco-hidrología. De esta forma, el metabolismo hídrico del socio-ecosistema es definido como el metabolismo del sistema agua-ser humano. La Parte II describe el marco metodológico. Como un marco ampliamente establecido que es capaz de tratar los problemas de escala y de integrar narrativas, el Capítulo 4 presenta el Análisis Integrado Multi-Escala del Metabolismo Social y de los Ecosistemas (MuSIASEM). MuSIASEM se ha seleccionado como raíz y ha sido adaptado al análisis de sistemas complejos agua-ser humano. Dado que el agua presenta importantes diferencias con respecto a los análisis previos en energía, esta adaptación requiere la inclusión de nuevas escalas de análisis –el ‘problemshed’ y el ‘watershed’- y nuevas definiciones del agua como metabolito –como flujo y fondo. En el capítulo 5 se señalan las diferencias y sinergias ente MuSIASEM el análisis de la huella hídrica –como una de las herramientas de la GIRH. En la Parte III se presentan cuatro casos de estudio con dos objetivos. En primer lugar, el Capítulo 6 analiza a sostenibilidad de los patrones metabólicos en el uso del agua en Punjab y Mauricio para testear la aplicación de MuSIASEM a los estudios de agua y para mostrar cómo este tipo de análisis de formaliza. En segundo lugar, el Capítulo 7 muestra como los métodos de contabilidad del agua del análisis de la huella hídrica complementan el análisis de flujos de agua en MuSIASEM, encontrando además una referencia para su contextualización. / The research line presented in this dissertation is a first attempt to provide a bridge for the communication between Hydrological studies and Social Metabolism. It was born from the observation that water is neglected in Social Metabolism and that current water science, while certain about the need of evolving towards a more interdisciplinary field, still faces challenges in the connection of social and ecosystem analyses. The contribution made here is the definition of an analytical framework –the Water Metabolism of Socioecosystems- where this connection can be established and which is formed by a conceptual proposal and a methodological toolkit. The document is divided in three parts where the epistemological, the methodological and the formal novelties of the framework are discussed. Part I covers the epistemological reflections related to the analytical framework. It begins in Chapter 1 with the explanation of the challenges faced by current water science and that relate to the need of finding analytical frameworks that contribute useful inputs to integrated management of the water resources (IWRM). As with the case of other resources, IWRM requires the analytical connection of the social and ecosystem dynamics. As a key piece within Sustainability Science the analogy of the metabolism of societies can be used to establish this connection. However, the metabolism concept needs a close examination before its joint use with other conceptions of the relations between humans and nature. After highlighting the need of considering the societal and ecosystem metabolism of socio-ecosystems as two separate but connected processes, a conceptual scheme is proposed in Chapter 2 to describe the metabolic relations between them. In Chapter 3, this scheme is adapted to the specifics of water using some of the most relevant concepts in socio- and eco-hydrology. In this way the water metabolism of socio-ecosystems is defined as the metabolism of the coupled water-human systems. Part II describes the methodological framework. In Chapter 4 the Multi-Scale Assessment of the Societal and Ecosystem Metabolism (MuSIASEM) is presented as an established framework able to deal with the scale issues and the integration of narratives. MuSIASEM is selected as a root and adapted to the analyses of coupled water-human systems. Since water presents some differences with the previous energy-focus analyses, its adaptation requires the inclusion of new scales of analysis –problemshed and watershed- and new definitions of water as a metabolite –as flow and fund. In Chapter 5 the differences and synergies between MuSIASEM and the water footprint analysis –as one of the tools of the IWRM- are highlighted. In part III four case studies are presented with two objectives. First, Chapter 6 assesses the sustainability of the metabolic patterns I Punjab and Mauritius in order to test the adaptation of MuSIASEM to water and to show how this type of analyses is made functional. Second, Chapter 7 shows how the water footprint accounting methods can complement the analysis of the water flows in MuSIASEM and how MuSIASEM, in turn an provide a space for their contextualization. Keywords: Agriculture, Complex Systems, Integrated Water Resources Management, Flow/Fund Model, Grammar, Multilevel Matrixes, MuSIASEM, Scale Issues, Socio-Ecological System, Social Metabolism, Virtual Water, Water, Water Footprint, New Water Culture.

Aquesta tesi descriu l’ús de quantum dots (QDs) en el desenvolupament de noves eines per aplicacions biològiques. S’han utilitzat QDs comercials d’estructura core/shell de CdSe/ZnS amb propietats òptiques i electroquímiques úniques gràcies a les quals s’han desenvolupat diversos sensors òptics i electroquímics per detectar proteïnes, cèl·lules i ADN. Primerament es va descriure un protocol utilitzant QDs en immunocitoquímiques per visualitzar proteïnes intracel·lulars com la β-tubulina (proteïna de microtúbuls), la GM130 (proteïna de l’aparell de Golgi o la EEA1 (proteïna d’endosomes). L’ús de QDs va aportar una considerable estabilitat i robustesa a la tècnica, demostrant que podien ser usats rutinàriament com a marcadors òptics en immunocitoquímiques. Posteriorment es van utilitzar com a marcadors duals òptics/electroquímics per detectar cèl·lules apoptòtiques. Els QDs es van conjugar amb Annexina-V (AnnV), proteïna de reconeixement de la fosfatidilserina, que es transloca a la superfície externa de la membrana cel·lular en cèl·lules apoptòtiques. El marcador resultant va permetre l’adquisició d’imatges qualitatives utilitzant microscòpia confocal, l’obtenció d’imatges d’alta resolució utilitzant microscòpia electrònica de rastreig i la mesura quantitativa de cèl·lules apoptòtiques utilitzant citometria de flux. A més, la voltametria d’ona quadrada es va aplicar per desenvolupar un innovador biosensor electroquímic que permetia detectar cèl·lules apoptòtiques de manera ràpida, semiquantitativa i econòmica. Aquest treball va provar la versatilitat dels QDs, convertint-los en una eina única per fer estudis complets d’un estat biològic específic en cèl·lules vives, com ara l’apoptosi. Després, l’enfoc es va posar cap al desenvolupament d’un dispositiu per testar fàrmacs basat en l’ús de QDs i microfluídica utilitzant la mateixa estratègia de marcatge (QD-AnnV). Una sèrie de microcanals interconnectats es van dissenyar amb diferents geometries per dur a terme diverses funcions: el primer per preparar diferents concentracions de camptotecina (fàrmac pro-apoptòtic model), el segon per conjugar els QDs amb l’AnnV i, l’últim, per cultivar les cèl·lules i detectar l’efecte de la camptotecina en aquestes. L’ús de la microfluidica no només va fer els experiments més robustos, donat que tots els passos eren gairebé automatitzats, sinó que va fer el procés més econòmic, ja que la despesa de reactius era menor. L’exitosa detecció en chip de cèl·lules apoptòtiques va demostrar que la combinació d’eines innovadores, com els QDs i la microfluídica, pot donar lloc a una nova generació de plataformes de “punt de cura” (point of care) per testar fàrmacs. Finalment, els QDs es van utilitzar, conjugats amb estructures d’ADN en forma de forquilla anomenades Molecular beacons (MBs), per detectar àcids nucleics. Els MBs estaven modificats amb una molècula extintora de manera que, quan els QDs es conjugaven amb els MBs, la seva fluorescència s’apagava. Aquesta estratègia es va utilitzar per detectar seqüències d’ADN que, quan hibridaven amb els QD-MBs, feien obrir l’estructura de forquilla, fent recuperar la fluorescència dels QDs. A més, aquest procés es va integrar en un canal microfluídic transparent que permetia seguir en temps real tots els esdeveniments: la immobilització dels QDs al canal, la conjugació dels QDs amb els MBs i la hibridació amb l’analit a detectar. Per tant es pot concloure que, els QDs, a més de poder reemplaçar els fluoròfors orgànics, poden ser combinats amb mètodes electroquímics i altres tecnologies com la microfluídica, generant un ventall de biosensors i dispositius versàtils i alternatius. / This PhD thesis describes the use of quantum dots (QDs) in the development of new tools for biological applications. Commercial CdSe/ZnS core/shell QDs with unique optical and electrochemical properties have been used to develop a variety of optical and electrochemical sensors for the detection of proteins, cells and DNA. An optimized protocol to use QDs in immunocytochemistries is described to visualize intracellular proteins such as β-tubulin (microtubules protein), GM130 (golgi apparatus protein) and EEA1 (endosomes protein). The use of QDs provided a considerable stability and robustness to the technique, proving that they can be routinely used as optical labels in immunocytochemistry. In addition, QDs have been successfully used as dual optical/electrochemical labels to detect apoptotic cells. QDs were conjugated with Annexin-V (AnnV), a protein specific to phosphatidilserine, which is translocated to the outer surface of the plasma membrane in apopototic cells. The resulting label (QD-AnnV) provided excellent fluorescence images using confocal microscopy, high resolution images using scanning electron microscopy and a quantitative measurement of apoptotic cells using flow cytometry. Furthermore square wave voltammetry was applied to develop a novel electrochemical biosensor for a fast, semiquantitative and cheap detection of apoptotic cells. This work has proved the versatility of the QDs, making them a unique tool to be used for a complete study of a biological state of cells, such as apoptosis. Later on efforts were put towards the development of a device based on the use of QDs and microfluidics for drug screening using the same labeling strategy (QD-AnnV) and detecting apoptosis as well. Interconnected microchannels were designed with different geometries to perform specific tasks: the first one to prepare different concentrations of camptothecin (the pro-apoptotic drug used as model for drug screening), the second to carry out the conjugation of QDs with AnnV, and the last to culture the cells and detect the effect of the drug on them. The use of microfluidics did not only made the experiments more robust, since all the steps were mostly automated, but also more economic as less amount of reagents were required.. The successful fluorescence detection of apoptotic cells in the chip demonstrated that the combination of novel tools, such as QDs and microfluidics, allows for a new generation of point of care platforms for drug screening. Finally, QDs were also used for the detection of nucleic acids. QDs were conjugated with specific hairpin structures of DNA so called molecular beacons (MBs). MBs were modified with a quencher so, when QDs were conjugated to them, their fluorescence was turned off. This strategy was used to detect specific DNA targets which, while hybridized with the QDs-MBs hybrids, opened the hairpin structure making the fluorescence of QDs recovery from their quenching state. Furthermore, we integrate all this process in a transparent microfluidic channel, which let us monitor in real time all the steps, from the immobilization of QDs on the channel surface, followed by the conjugation with MBs and up to the hybridization of the target analyte. Thus, QDs are not only able to replace organic dyes as fluorescent labels, but they can also be combined with electrochemical methods and microfluidics, generating whole new alternatives in biosensing and drug screening.

Els micromaterials i nanomaterials presenten unes propietats fisicoquímiques úniques i controlables, les quals han permès la creació d’eines innovadores per tal d’afrontar alguns dels reptes que presenten diferents branques de la ciència i tecnologia, incloent la medicina moderna. El creixement exponencial de la microtecnologia i nanotecnologia en els últims anys ha generat la necessitat de conèixer millor el comportament dels micromaterials i nanomaterials en ambients fisiològics, especialment a nivell cel·lular, per tal d’assegurar un desenvolupament segur i eficient. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la interacció entre diferents tipus de micropartícules i cèl·lules. Amb aquesta finalitat, es van dur a terme tres treballs diferents. Primer, s’ha avaluat l’impacte del recobriment de micropartícules amb lípids i polímers catiònics en la seva internalització en cèl·lules no fagocítiques HeLa. En concret, s’ha observat que la utilització de PEI a una concentració de 0.05 mM presenta el millor balanç entre eficiència d’internalització i citotoxicitat. En segon lloc, s’ha analitzat si la modificació de la superfície de les micropartícules té un efecte diferent segons la línia cel·lular utilitzada. En concret, s’ha observat que les cèl·lules epitelials mamàries tumorals (SKBR-3) i no tumorals (MCF-10A) mostraven diferències significatives, tant pel que fa a la eficiència d’internalització de micropartícules com als mecanismes d’endocitosi involucrats. Finalment, s’ha demostrat que els xips intracel·lulars compostos de polisilici, crom i or, són bons candidats per a la seva utilització en aplicacions biològiques, ja que presenten una alta biocompatibilitat i són capaços de desenvolupar diferents funcions mitjançant la seva bifuncionalització. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi posen de manifest la importància de determinar la citotoxicitat, l’eficiència d’internalització, la localització intracel·lular i l’efecte de la línia cel·lular a l’hora de dissenyar nous microsistemes i nanosistemes per tal de maximitzar la seva eficiència i minimitzar els efectes adversos. / Los micromateriales y nanomateriales presentan propiedades fisicoquímicas únicas y controlables que han permitido la creación de herramientas innovadoras para abordar algunos de los mayores retos que presentan distintas ramas de la ciencia y tecnología, incluyendo la medicina moderna. El crecimiento exponencial de la microtecnología y nanotecnología durante los últimos años ha generado la necesidad de comprender el comportamiento de los micromateriales y nanomateriales en ambientes fisiológicos, especialmente a nivel celular, para conseguir un desarrollo eficiente y seguro. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar las interacciones entre diferentes tipos de micropartículas y células. Para ello, se han llevado a cabo tres estudios diferentes. Primero, se ha evaluado el impacto del recubrimiento de micropartículas con lípidos y polímeros catiónicos en la internalización de estas en la línea celular no fagocítica HeLa. Se ha determinado que utilización de PEI a una concentración de 0.05 mM presenta el mejor balance entre internalización y citotoxicidad. En segundo lugar, se ha analizado si la modificación de la superficie de las micropartículas tenía un efecto diferente según la línea celular utilizada. Concretamente, se ha observado que las células epiteliales mamarias tumorales (SKBR-3) y no tumorales (MCF-10A) presentaban diferencias significativas con respecto a la eficiencia de internalización y a los mecanismo de endocitosis involucrados. Finalmente, se ha demostrado que los chips intracelulares compuestos de polisilicio, cromo y oro, son buenos candidatos para su utilización en aplicaciones biológicas, ya que muestran una alta biocompatibilidad y son capaces de desempeñar distintas funciones mediante su bifuncionalización. En conjunto, los resultados de esta tesis ponen de manifiesto la importancia de determinar la citotoxicidad, eficiencia de internalización, localización intracelular y el efecto de la línea celular de los nuevos microsistemas y nanosistemas para maximizar su eficiencia y minimizar sus efectos adversos. / The unique and controllable physico-chemical properties of micro- and nanomaterials have allowed the creation of ground-breaking approaches to overcome some of the major challenges of different branches of technology and science, including modern medicine. The fast advances in micro- and nanotechnology have lead to an increasing demand for understanding the behaviour of micro- and nanomaterials within the physiological environments as well as their interactions at the bio-interface, including the cellular level, for an efficient and safe development. In this scenario, the present Thesis aimed to provide an integrated understanding about microparticle interactions with cells. First, we assessed the impact of cationic lipids and polymer coating of microparticles on their uptake by non-phagocytic (HeLa) cells. We found that non-covalently conjugated PEI at a 0.05 mM concentration offers the best balance between uptake efficiency and cytotoxicity. Second, we observed that surface modified microparticles were differently uptaken by tumoral (SKBR-3) and non-tumoral (MCF-10A) human breast epithelial cells, not only in terms of uptake efficiency but also of their endocytic pathways. Third, we demonstrated that polysilicon-chromium-gold multi-material intracellular chips (MMICCs) are suitable for biological applications due to their biocompatibility and capability of developing multiple functions through their bi-functionalization using orthogonal chemistry. Collectively, our results highlight the importance of assessing cell-particle interactions, in terms of cytotoxicity, uptake, intracellular location and cell type effect of newly designed micro- and nanomaterials, not only with respect to the target cells but also the neighbouring cells, in order to ensure their safety and efficiency.