Al SNC, la neuroinflamació és un procés desencadenat per varies circumstàncies incloent infeccions, toxicitat, lesió traumàtica o autoimmunitat i sempre implica la ràpida activació de les cèl·lules glials, en particular astròcits i micròglia. Com a major component del sistema immunitari al SNC, la micròglia juga un paper fonamental regulant la neuroinflamació. Un cop activada, la micròglia es transforma, prolifera, migra i secreta molècules immunomoduladores com les citoquines. A la mateixa vegada, les citoquines poden influenciar el fenotip microglial. Així, la IL-6 pot ser un potent inductor i modulador de l’activació microglial, mentre que la IL-10 pot reprimir el fenotip pro-inflamatori de la micròglia. Un dels models millor caracteritzats de lesió de nervi perifèric es la lesió del nervi facial (FNA), caracteritzada per la degeneració neuronal retrògrada, l’activació glial i el reclutament limfocític. Per entendre el paper de la IL-6 i la IL-10 en la regulació de la resposta inflamatòria després de FNA, utilitzem dos soques de ratolins transgènics, GFAP-IL6Tg i GFAP-IL10Tg, que produeixen les citoquines IL-6 i IL-10, respectivament, sota el promotor de GFAP en astròcits. Els nostres resultats demostren que després de FNA, la IL-6 té un lleu efecte atenuant l’activació astroglial, però indueix importants efectes en termes d’activació micròglia, que correlacionen amb una major mort neuronal. Així, trobem que la IL-6 augmenta la densitat microglial i modifica l’expressió de moltes molècules relacionades amb la comunicació cel·lular. La IL-6 produeix una baixada en les molècules d’adhesió microglial, les quals poden afectar la manera com la micròglia es comunica amb les neurones axotomitzades. Remarcablement, la IL-6 indueix menor formació de clústers microglials, qüestionant la noció de que aquests clústers corresponen a llocs de neurones degenerant-se i micròglia fagocítica. També, demostrem que la IL-6 provoca un augment en el nombre de limfòcits-T infiltrats al nucli facial. Tot i que la infiltració de limfòcits-T, especialment els Th2, es considera neuroprotectora en WT, podem especular que la IL-6 indueix el reclutament de limfòcits-T no-neuroprotectors i, per tant, es modificaria la supervivència neuronal. Malgrat els efectes detrimentals en supervivència neuronal als 21 dies, la IL-6 no continua augmentant la mort neuronal 7 setmanes desprès de FNA però sembla que empitjora la regeneració funcional efectiva a aquest temps. Per una altra banda, la IL-10 augmenta la supervivència neuronal comparada amb el WT, correlacionant amb canvis en la resposta microglial i immunitària. Remarcablement, la IL-10 provoca una major formació de clústers de micròglia, demostrant de nou que no hi ha correlació entre el nombre de clústers i la quantitat de mort neuronal. A més, la IL-10 disminueix l’expressió de molècules associades amb la fagocitosis microglial al principi de la lesió. Aquests resultats, conjuntament amb l’observat amb els animals GFAP-IL6Tg, ens duen a proposar que els clústers de micròglia poden tenir unes altres funcions, més enllà de la fagocitosis de residus neuronals. En aquest sentit, la IL-10 incrementa l’expressió de molècules coestimuladores en la micròglia dels clústers, senyalant aquestes estructures com a llocs d’interacció amb els limfòcits-T. Demostrem també que la IL-10 provoca un major reclutament de limfòcits-T al nucli facial, tot i que el mecanisme pel qual els limfòcits-T promouen la supervivència neuronal no ha estat encara aclarit. Malgrat els efectes beneficiosos en supervivència neuronal a 21 dies, la IL-10 no té efectes en aquesta ni en la regeneració funcional efectiva 7 setmanes desprès de FNA. En resum, els resultats obtinguts en la present tesis mostren que la producció dirigida en astròcits de IL-6 i IL-10 modula la resposta neuroinflamatòria orquestrada desprès de FNA i influencien la supervivència neuronal i la regeneració del nervi. / In the CNS, neuroinflammation is a process triggered by a variety of circumstances including infection, toxicity, traumatic injury or autoimmunity and as hallmark always involves the quick activation of glial cells, in particular astrocytes and microglia. As the prime component of the CNS immune system, microglia plays a major role regulating neuroinflammation. Once activated, microglial cells transform, proliferate, migrate and release immunomodulatory molecules like cytokines. In turn, cytokines can strongly influence microglial phenotype. In this sense, IL-6 can be a potent inducer and modulator of microglial activation while IL-10 can downregulate the pro-inflammatory phenotype of microglia. One of the most-well described models of peripheral nerve injury is facial nerve axotomy (FNA), characterized by retrograde neuronal degeneration, glial activation and lymphocyte recruitment. To understand the role of IL-6 and IL-10 in the orchestration of the inflammatory response after FNA, we used two transgenic mice, GFAP-IL6Tg and GFAP-IL10Tg, which produce the cytokines IL-6 and IL-10, respectively, under the GFAP promoter in astrocytes. Our results showed that after FNA, IL-6 elicited a slight effect on attenuating astroglial activation, but induced intensive effects in terms of microglial activation that correlated with a higher neuronal death. Thus, we found that IL-6 increased microglia density and modify the pattern of expression of several molecules related with cellular cross-talk. IL-6 produced a drop in microglial adhesion molecules, which may affect how microglia communicate with the lesioned motorneurons. Importantly, IL-6 led to less microglial cluster formation, calling in question the assumption that these clusters correspond just to places of dying neurons and phagocytic microglia. Also, our findings showed that IL-6 produced an increase in the number of infiltrated T-cell within the lesioned facial nucleus. Although infiltration of T-cells, specifically Th2 lymphocytes, has been reported to play a neuroprotective role in WT, we can speculate that IL-6 induced the recruitment of non-neuroprotective T-cells and therefore modify the outcome of lesioned motor neurons. Despite its detrimental effects in neuronal survival at 21 days, IL-6 did not continue increasing neuronal death 7 weeks after axotomy but seemed to impair effective functional regeneration at this time-point. On the other hand IL-10 promoted an increase in neuronal survival, in front to WT, correlating with changes in microglial and immune responses. Remarkably, IL-10 led to increased microglial clusters formation, showing again no correlation between the number of microglial clusters and the amount of neuronal death. Moreover, IL-10 decreased the expression of molecules associated with microglial phagocytosis during early time-points. These findings, together with the observations in GFAP-IL6Tg animals, lead us to propose that microglial clusters may have another functions rather than phagocytosis of neuronal debris. In this sense, IL-10 increased co-stimulatory molecule expression in clustering microglia, pointing to these clusters as locations of interaction with recruited lymphocytes. We showed that also IL-10 promoted the recruitment of T-cells into the facial nucleus, yet the mechanism by which infiltrated T-cells contribute to enhanced neuronal survival has not been yet elucidated. Despite its beneficial effects on neuronal survival at 21 days, IL-10 was not able to increase neither neuronal survival nor functional regeneration 7 weeks after FNA. In summary, the results obtained in the present thesis show that astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 modulates the neuroinflammatory response orchestrated after FNA and influence the neuronal survival and nerve regeneration.

Per tal de protegir les cèl·lules germinals de sofrir inestabilitat genòmica, diversos mecanismes de control s’encarreguen de que la progressió de la meiosis sigui correcte. En mamífers, els espermatòcits que presenten defectes de recombinació o de la formació de la vesícula sexual pateixen un bloqueig a l’estadi de paquitè. Estudis previs del nostre laboratori descriuen que la via complex MRE11-ATM-CHK2 activa l’arrest dependent de recombinació en presència de trencaments de doble cadena (DSBs) no reparats. L’objectiu d’aquest treball ha estat identificar si els membres de la família p53, els quals són possibles substrats de ATM i CHK2, participen en l’activació del arrest depenent de recombinació. En una aproximació genètica, hem obtingut ratolins doble mutants portadors d’una mutació de un membre de la família p53 (p53, Tap63 o p73) en un fons defectiu per Trip13. La mutació de Trip13 causa defectes de recombinació, el qual activa l’arrest depenent de recombinació en els espermatòcits a l’estadi de paquitè. Per tant, hem estudiat com l’absència d’algun membre de la família p53 afectava aquest fenotip d’arrest el espermatòcits Trip13mod/mod. Els nostres resultats demostren que tant la deficiència de p53 com Tap63, però no p73, permeten que els espermatòcits progressin més enllà i arribin a l’estadi de paquitè tardà tot i acumular nombrosos DSBs no reparats. Addicionalment, l’absència de p53 o Tap63 resulta en una disminució del nombre d’espermatòcits apoptòtics a l’estadi de paquitè primerenc. Així, els nostres resultats indiquen que p53 i TAp63 són responsables d’activar l’arrest dependent de recombinació en els espermatòcits de ratolí. Tot i així, els espermatòcits doble mutants encara presenten un bloqueig a l’estadi de paquitè. Per tal d’estudiar si els espermatòcits doble mutants arresten a causa de l’activació de l’arrest depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, hem analitzat la funcionalitat del MSCI en els mutants Trip13. Per tant, el fet de saltar-se l’arrest dependent de recombinació ens ha permès elucidar el paper de TRIP13 en el silenciament meiòtic, de manera que al fallar la vesícula sexual es desencadena l’apoptosi i bloqueig dels mutants Trip13. Aquests resultats infereixen que el bloqueig depenent de recombinació i el depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, són mecanismes que s’activen per mecanismes genèticament separats. A partir de l’observació que TRIP13 és necessari per implementar el silenciament del MSCI, he dut a terme un anàlisis exhaustiu de la transcripció en els mutants de Trip13. Els nostres resultats de marcatge de RNA amb EU i activació de la RNA polimerasa II fosforilada (S2) suggereixen que la expressió de RNA en els espermatòcits mutants per Trip13 es troba incrementada en els estadis inicials de la meiosis. Addicionalment, la seqüenciació del RNA ha permès observar que els gens dels cromosomes sexuals i gens pre-meiòtics es troben sobre expressats en els mutants de Trip13, suggerint que TRIP13 és necessari per mantenir l’expressió d’aquests gens a nivells baixos. En conjunt, els resultats presentats en aquest treball contribueixen a entendre com els mecanismes de control regulen diversos passes crucials de la progressió de la profase meiòtica en els espermatòcits de mamífer. / In order to protect germinal cells from genomic instability, surveillance mechanisms ensure that meiosis occurs properly. In mammals, spermatocytes that display recombination or sex body defects experience an arrest at pachytene stage. Previous studies from our lab described that the MRE11 complex-ATM-CHK2 pathway activates the recombination-dependent arrest in the presence of unrepaired double strand breaks (DSBs). In this work we aimed to identify if p53 family members, which are putative targets of ATM and CHK2, participate in the activation of the recombination-dependent arrest. As a genetic approach, we bred double mutant mice carrying a mutation of a member of the p53 family (p53, TAp63, p73) in a Trip13 defective background. Trip13 mutation causes recombination defects, which activate the recombination-dependent arrest in pachytene-stage spermatocytes. Thus, we studied how the absence of p53 family members affected the arrest phenotype of Trip13mod/mod spermatocytes. Our data showed that p53 and TAp63 deficiency, but not p73, allowed spermatocytes to progress further into late pachynema, despite accumulating numerous unrepaired DBSs. In addition, lack of p53 or TAp63 resulted in a decrease of apoptotic spermatocytes at early pachytene stage. Therefore, our results indicate that p53 and TAp63 are responsible to activate the recombination-dependent arrest in mouse spermatocytes. Even though, double mutant spermatocytes still arrested at pachytene stage. To study if double mutant spermatocytes were arresting due to the activation of the sex body deficient arrest we analyzed MSCI functionality in Trip13 mutants. Thus, by bypassing the recombination-dependent arrest has allowed us to elucidate a role for TRIP13 protein in meiotic silencing, which consequently triggers apoptosis in double mutants at late pachytene stage due to sex body impairment. These results infer that the recombination-dependent and the sex-body deficient arrest are activated by two genetically separated mechanisms. From the observation that TRIP13 is required to implement MSCI silencing, we performed an exhaustive analysis of transcription in Trip13 mutants. Our results suggested that RNA expression in Trip13 mutants was increased in early meiotic stage spermatocytes, assessed by EU-labeling RNA and phosphorylated(S2)-RNA polymerase II. Moreover, RNA sequencing data highlighted the observation that sex chromosome genes and pre-meiotic genes are overexpressed in Trip13 mutants, suggesting that TRIP13 is required to maintain the expression of these genes at low levels. Overall, the data presented in this work contributes to the understanding on how surveillance mechanisms control several crucial steps of meiotic prophase progression in mammalian spermatocytes.

Des de la preocupació envers els riscos derivats dels programes de cribratge mamogràfic en la població i la impossibilitat d’analitzar-los de manera completa a partir d’estudis epidemiològics, es va analitzar la capacitat de les cèl·lules epitelials mamàries humanes de fer front als trencaments de cadena doble induïts pel mamògraf. Els resultats mostren que després de rebre una dosi de raigs X de 20 mGy, equivalent a la dosi estàndard rebuda per la superfície de la mama en una exploració mamogràfica, les cèl·lules epitelials mamàries (HMECs) envellides in vitro presenten un nombre major de trencaments de cadena doble (DSBs) que les cèl·lules més joves. Els nostres estudis apunten a una resposta ineficient del dany en les cèl·lules envellides a causa d’una mobilització incompleta i endarrerida de les proteïnes de reparació en els punts de trencament. Aquesta resposta ineficient es tradueix en un retard important en la reparació dels trencaments de cadena doble en les cèl·lules de population doublings (PD) més avançats, que dóna lloc a un augment de la inestabilitat genètica. Mitjançant la posta a punt d’una tècnica automatitzada i molt sensible de seguiment de la fosforilació de H2AX, un dels primers esdeveniments que tenen lloc en la senyalització dels DSBs, es va poder determinar també l’eficiència de la resposta al dany en cèl·lules BPECs de diferents donants transduïdes amb hTERT. Aquest segon estudi va permetre establir, tot i que de manera molt preliminar, que la lentitud en la reparació dels DSBs, no només apareixia a mesura que augmentaven el nombre de passes en cultiu, com havíem vist en les HMECs, sinó que també augmentava amb l’edat de la donant. Per l’establiment d’aquesta tècnica es va tenir en compte la rellevància de la fase del cicle cel·lular en el recompte dels foci de γH2AX deguda als canvis en el patró de marcatge de la histona al llarg d’aquest. Un cop avaluades les cinètiques d’aparició i desaparició de foci d’histona fosforilada, tant en HMECs com en BPECs es va observar que la re-expressió de la telomerasa i el conseqüent allargament dels telòmers no evitava que les cèl·lules presentessin una DDR (DNA Damage Response) alentida a PDs avançats. Aquests resultats ens va conduir a realitzar una revisió exhaustiva de la bibliografia per explorar quins factors, a banda de l’escurçament telomèric, podrien jugar un paper important en la relació entre envelliment i radiosensibilitat. Entre aquests, s’ha vist que l’estrès oxidatiu que pateixen les cèl·lules amb l’envelliment té un paper molt rellevant, tant pel seu rol com a agent nociu i generador de trencaments en el DNA com en relació a l’oxidació que té lloc en altres estructures cel·lulars. Per altra banda, també tenen lloc un seguit de canvis en l’organització nuclear relacionats amb l’envelliment, com la reestructuració de la heterocromatina, la pèrdua de funcionalitat de la lamina A o la manca d’integritat dels porus nuclears. En la revisió es va fer molta incidència en les relacions entre aquests canvis en l’organització nuclear i el detriment de la DDR observat en varis estudis i en el nostre. La conclusió més destacada és que s’observa una relació multifactorial entre la radiosensibilitat i l’edat. Fent palès des de diferents assajos que la capacitat de les cèl·lules de fer front al dany en el DNA es veu reduïda amb l’envelliment i que aquesta reducció podria contribuir a explicar l’augment dels riscos carcinogènics de l'exposició a radiacions en edats més avançades revelats pels estudis epidemiològics. Davant d’un augment en l’esperança de vida es fa cada cop més necessari tenir en compte l’envelliment alhora d’establir polítiques de radioprotecció. / Concerned about the risks of mammography screening and in order to overcome the limitations of the epidemiological studies, we analyzed the ability of human mammary epithelial cells to cope with mammogram-induced DNA damage. Our results show that an X-ray dose of 0.02 Gy, which is the standard dose received by the breast surface per two-view mammogram X-ray exploration, induces an increase in the DNA double-strand breaks number to in vitro aged–but not to young–human mammary epithelial cells. Our studies point to an ineffective DDR (DNA damage response) of aged cells due to both delayed and incomplete mobilization of repair proteins to DNA strand breaks. This inefficient response results in an important delay in double-strand break disappearance in cells of Population doublings (PD) advanced, causing an increased genetic instability. By setting up an automated and highly sensitive method of phosphorylated histone (γH2AX) foci scoring, an early step in DSB repair pathway, we determined the DDR efficiency of the Breast primary epithelial cells (BPECs) transduced with hTERT, obtained from several donors. The establishment of this method provided us with the insight that the delay in the DDR observed as the number of population doublings progressed was also relevant when comparing only the donor’s age. To establish this technique we took into account the importance of the cell cycle phase in the γH2AX foci counting since the phosphorylated histone staining pattern changes through the cycle. Once evaluated the kinetics of appearance and disappearance of foci of the γH2AX foci in both HMEC and BPECs we proved that the re-expression of hTERT on these cells did not avoid the DDR’s delay on the in vitro aged cells. These results drove us to perform an exhaustive review of the literature to explore what factors, in addition to telomeric shortening, are playing an important role in the relationship between aging and radiosensitivity. Among these, the oxidative stress that the aged cells suffer has a significant role, both as an agent that generates harmful breaks in DNA and in relation to corrosion that induces to other relevant cellular structures. On the other hand, there are several the age-related changes in the nuclear organization such as the restructuring of the heterochromatin, loss of functionality of the laminate or lack of integrity of the nuclear pores. In the review we tried to highlight the relationship between these changes in the nuclear organization and the deterioration of the DDR observed in several studies and in ours. The most important conclusion is that there is a multifactorial relationship between radiosensitivity and age. It seems clear that the ability of cells to cope with DNA damage is reduced with aging and such reduction could help to explain the increased carcinogenic risks of radiation exposure at older ages revealed by epidemiological studies. Challenged with an increase in life expectancy is ever more necessary to consider aging while establishing radiation protection policies.

Una forma d’analitzar la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules normals és l’anàlisi de l’expressió dels llocs fràgils. Aquests són regions del genoma caracteritzats per la seva inestabilitat sota condicions d’estrès replicatiu. Sota aquestes condicions es poden induir alteracions en loci relacionats amb càncer. L’estudi d’inestabilitat es pot centrar en sang perifèrica, i en altres tipus de teixit, d’entre els quals la bufeta és un bon model donat l’elevada freqüència de recidives i la multifocalitat o presència de tumors sincrònics en aquest òrgan. Els objectius d’aquest treball són: a) estudiar l’expressió de llocs fràgils comuns en limfòcits de sang perifèrica d’una sèrie de pacients afectats de càncer de bufeta i comparar-la amb una sèrie de controls aparellats per edat i hàbit fumador; b) analitzar si les condicions d’estrès replicatiu sota les quals s’expressen els llocs fràgils indueixen alteracions dels loci 9p21 i CCND1 en pacients i comparar-ho amb controls; c) analitzar la presència d’aneuploïdies afectant als cromosomes 1, 7, 8, 9, 11 i 17 en el tumor i en la resta de l’uroteli vesical aparentment normal del mateix pacient. Els nostres resultats demostren que l’afidicolina indueix alteracions en limfòcits de sang perifèrica en forma de delecions i duplicacions en loci tals com 9p21 i CCND1 normalment alterats en cèl·lules tumorals. Aquestes alteracions no difereixen entre pacients i controls. De la mateixa manera, l’expressió de llocs fràgils no presenta diferències entre ambdós grups, i en general els dos fenòmens estudiats estarien relacionats amb la pèrdua d’integritat del genoma relacionada amb l’edat. En l’epiteli urotelial, l’anàlisi cromosòmica d’inestabilitat numèrica indica que la mucosa aparentment normal acumula alteracions en major o menor freqüència i que s’observa variabilitat entre pacients. Els nostres resultats permeten confirmar que la presència d’inestabilitat en cèl·lules normals i en individus aparentment sans és un fenomen més freqüent de l’esperat i que probablement està relacionat amb l’envelliment. / One way to analyse chromosomal instability in normal cells is the analysis of the expression of fragile sites. These are regions of the genome characterized by instability under conditions of replicative stress. Under these conditions, alterations in cancerrelated loci may be induced. The study of instability can focus on peripheral blood and other tissue types, among which the bladder is a good model given the high frequency of recurrences and the presence of multiple synchronous tumours in this organ. The aim of this work is: a) to study the expression of common fragile sites in peripheral blood lymphocytes of a series of patients with bladder cancer and controls matched by age and smoking habit; b) to analyse if the replicative stress also induce alterations in loci 9p21 and CCND1 in the same subjects; c) to analyse the presence of aneuploidies for chromosomes 1, 7, 8, 9, 11 and 17 in bladder tumour and the apparently normal urothelium of the same patient. Our results show that aphidicolin induces deletions and duplications in loci 9p21 and CCND1 in peripheral blood lymphocytes. These alterations did not differ between patients and controls. Similarly, the expression of fragile sites presents no differences between both groups, and generally both phenomena would be related with the loss of integrity of the genome associated with age. The urothelial epithelium analysis indicates that numerical chromosomal instability is present in apparently normal mucosa, where alterations accumulates in varying frequency, and shows variability between patients. In summary, our results confirm the presence of instability in normal cells and in apparently healthy individuals. This phenomenon is more common than expected and probably is related to aging.

El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioteràpia és la tolerància del teixit normal. Aquesta tolerància mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioteràpia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s’han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de càncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l’estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues línies cel·lulars limfoblastoides, una línia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d’expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues línies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d’intensitat d’immunofluorescència en la línia RS en comparació amb la línia RR. A més, el sistema microscòpic automàtic va ser la metodologia més ràpida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La línia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, així com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la línia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d’alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues línies 24 h després d’irradiar. La línia RS va mostrar una freqüència significativament major d’ICE en comparació amb la línia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la línia RS que en la línia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d’expressió gènica diferencial de les dues línies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la línia RR, la línia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d’irradiar. L’anàlisi funcional 24 hores després d’irradiar va mostrar que la línia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la línia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que les dues línies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de càncer després de la radioteràpia. / The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients.

L’ús de materials biocompatibles ha assolit una importància creixent en aplicacions ortopèdiques i quirúrgiques, degut a l’envelliment de la població. Els aliatges metàl·lics que s’empren actualment en medicina presenten propietats físiques i mecàniques diferents a les de l’os humà, incrementant la probabilitat de pèrdua de l’implant. Per aquesta raó, s’estan desenvolupant nous aliatges metàl·lics amb millors propietats. En aquest sentit, la present tesi té com objectiu l’anàlisi de la biocompatibilitat de nous aliatges pel seu ús en implants ortopèdics. En primer lloc, s’ha demostrat la biocompatibilitat del vidre metàl·lic massís TiZrCuPd en termes de citotoxicitat, i d’adhesió i de diferenciació d’osteoblasts. En segon lloc, s’ha avaluat l’efecte de dues modificacions de superfície, anodització electroquímica i modificació física, dels aliatges TiZrCuPd i Ti-6Al-4V sobre el comportament dels osteoblasts. En aquest cas, no hem observat cap efecte de la topografia en la proliferació, l’adhesió i la diferenciació. En tercer lloc, hem demostrat que els aliatges TiZrPdSi i TiZrPdSiNb són biocompatibles i afavoreixen l’adhesió, la proliferació i la diferenciació d’osteoblasts. Finalment, hem avaluat l’efecte electroestimulador de dos nous nanogeneradors piezoelèctrics, basats en ZnO, emprant dues línies cel·lulars implicades en la regeneració òssia (osteoblasts i macròfags). Els resultats observats indiquen que els nanogeneradors són biocompatibles i que la seva interacció amb les cèl·lules produeix un camp elèctric local que estimula la motilitat dels macròfags i l’augment de la concentració intracel·lular de Ca2+ en osteoblasts. Aquests nous materials intel·ligents presenten propietats força interessants pel seu ús en aplicacions biomèdiques. En conjunt, els resultats obtinguts en els nostres estudis contribueixen en el desenvolupament de materials per millorar la reparació i la regeneració òssia. / The use of biocompatible materials has attained an increasing importance for medical surgery and orthopaedics due to population aging. Metallic alloys currently used in bone implants have physical and mechanical properties different from those of the bone, which increases the probability of implant loosening. For this reason, new metallic alloys with better properties are being developed. In this regard, the present thesis aims to analyse the biocompatibility of new biomaterials for orthopaedic applications. First, we demonstrated the biocompatibility of TiZrCuPd bulk metallic glass in terms of cytotoxicity, and osteoblast adhesion and differentiation. Second, we assessed the effect of surface modification of TiZrCuPd and Ti-6Al-4V alloys by electrochemical anodization and physical modification on osteoblast behaviour. Differences in topography did not cause changes on osteoblasts adhesion, proliferation and differentiation. Third, we demonstrated that TiZrPdSi and TiZrPdSiNb alloys are also biocompatible and enhance osteoblasts adhesion, spreading, proliferation and differentiation. Fourth, we evaluated the electrostimulation effect of two new ZnO piezoelectric nanogenerators using two cell lines involved in bone regeneration (osteoblasts and macrophages). We observed that both nanogenerators are biocompatible and that their interaction with cells produces a local electric field that stimulate macrophages motility and the increase in intracellular Ca2+ concentration in osteoblasts. Thus, these new smart materials have interesting properties for their use in biomedical devices. Collectively, the results obtained in our studies contribute to the progress in the development of better materials for bone repair and regeneration.

En estudis previs realitzats en el nostre laboratori vam demostrar que la infusió de cèl·lules de medul·la òssia (MO) transduïdes amb un autoantigen (MOG40-55), dirigit a la via de presentació d'antígens per MHC de classe II, induïen tolerància immunològica en un model experimental d'esclerosi múltiple, la encefalomielitis autoimmune experimental (EAE), tant en un abordatge preventiu com terapèutic (Eixarch et al. 2009). Per altra banda, l'absència d'empelt de les cèl·lules que expressaven la MOG va permetre eliminar la mieloablació i ens va conduir a la hipòtesis de que l'efecte terapèutic observat no estava mediat per cèl·lules amb capacitat d'empeltar sinó més aviat per unes cèl·lules més madures que presentaven l'autoantigen de forma tolerogènica. Estudis posteriors van revelar que la majoria de les cèl·lules que es generaven en els cultius de transducció amb retrovirus de cèl·lules de MO eren d'origen mieloide i que, de fet, eren cèl·lules mieloide supressores (MDSCs, sigles en anglès) (Gomez et al.2014). Per tant, la primera part d'aquesta tesi es va iniciar amb el propòsit de caracteritzar millor aquestes MDSCs i de determinar si eren elles les responsables de la inducció de tolerància immunològica observada en la EAE a més d'estudiar els possibles mecanismes d'acció implicats. Amb aquesta finalitat es van transduïr cèl·lules de MO amb un vector retroviral que codificava per l'autoantigen (MOG40-55) o amb un vector control. Es van aïllar les MDSCs i es van administrar als ratolins set dies abans (braç preventiu) o 13-14 dies després (braç terapèutic) de la inducció de la EAE. Els resultats mostren que una única administració de MDSCs antigen-específiques va induir tolerància immunològica in vivo i que va prevenir i millorar els signes clínics de la EAE de manera antigen-específica. A més a més, els animals toleritzats presentaven una neuropatologia reduïda, proporcions de limfòcits activats reduïdes i proporcions de limfòcits B amb un fenotip regulador augmentades. D'altra banda, aquestes MDSCs generades ex vivo expressaven la molècula inhibitòria programmed death ligand 1 (PD-L1) i produïen espècies reactives d'oxigen, mecanismes associats amb la inhibició dels limfòcits T autoreactius i amb la inducció de tolerància immunològica. Després d'obtenir resultats prometedors amb les MDSCs antigen-específiques de ratolí, vam decidir donar un pas més i la segona part d'aquesta tesi està enfocada a desenvolupar mètodes eficients per generar MDSCs humanes a partir de progenitors hemopoètics per la seva potencial aplicació clínica. Es van cultivar progenitors CD34+ obtinguts de productes d'afèresis de donants sans durant 9, 14 i 20 dies en presència de diferents combinacions de citoquines bàsicament formades per SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF i IL-6. Els resultats mostren que les MDSCs es poden generar de manera eficient a partir de progenitors hemopoètics i que les seves proporcions augmentaven amb els dies de cultiu. A més, aquestes cèl·lules expressaven la molècula immunosupressora PD-L1, eren molt poc al·loreactives, suprimien la proliferació de cèl·lules T induïda per un estímul policlonal i reduïen els nivells de les citoquines proinflamatòries mentre que augmentaven el nivell de la citoquina immunomoduladora IL-10. Per aquests motius creiem que les MDSCs generades in vitro són una eina potencial pel tractament de malalties autoimmunes i per evitar la malaltia de l'empelt contra l'hoste després del trasplantament. / In previous studies conducted at our laboratory we demonstrated that infusion of bone marrow (BM) cells transduced with a self-antigen (MOG40-55), targeted to the MHC class II antigen presentation pathway, induced immunological tolerance in an experimental model of multiple sclerosis, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), both preventively and therapeutically (Eixarch et al. 2009). Moreover, the absence of engraftment of the MOG-expressing cells allowed to eliminate myeloablation and hypothesize that the therapeutic effect observed was not mediated by cells with engrafting potential but rather by a more mature cell type that expressed the self-antigen in a tolerogenic manner. Subsequent studies revealed that the majority of cells generated in standard retroviral transduction cultures of BM cells were of myeloid origin and that, indeed, were myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) (Gomez et al. 2014). Therefore, the first part of this thesis was initiated with the purpose of better characterizing these MDSCs generated in BM retroviral transduction cultures and determining whether these cells were responsible for the induction of the immunological tolerance observed in the EAE model as well as studying the potential mechanisms of action involved. To this end, BM cells were transduced either with a retroviral vector encoding for the self-antigen or with a control vector. Both BM cells and isolated MDSCs were infused to the animals seven days before (preventive arm) or 13-14 days after (therapeutic arm) EAE induction. Results showed that a single infusion of antigen-specific MDSCs induced immunological tolerance in vivo and was able to prevent and ameliorate established EAE in an antigen-specific manner. In addition, tolerized animals presented a decreased neuropathology, reduced proportions of activated T cells and increased proportions of B cells with a regulatory phenotype. Moreover, the ex vivo generated MDSCs expressed the inhibitory molecule programmed death ligand 1 (PD-L1) and produced reactive oxygen species, mechanisms associated with the inhibition of autoreactive T cells and with the induction of immunological tolerance. After obtaining these promising results with the murine antigen-specific MDSCs, we decided to move one step further and, therefore, the second part of this thesis was aimed at developing efficient methods to generate human MDSCs from hematopoietic progenitor cells for its potential clinical application. To this end, CD34+ progenitor cells from apheresis products of healthy donors were cultured for 9, 14 and 20 days in the presence of different cytokine combinations mainly consisting of SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF and IL-6. Results showed that MDSCs can be efficiently generated from hematopoietic progenitor cells and that their proportions significantly increased along with the days of the culture. Moreover, these cells expressed the immunosuppressive molecule PD-L1, had very little alloreactivity, suppressed polyclonal-induced T-cell proliferation and decreased the levels of proinflammatory cytokines while increasing the levels of the immunomodulatory cytokine IL-10. For these reasons, we believe that in vitro generated MDSCs constitute a potential tool for the treatment of autoimmune diseases and to prevent graft-versus-host disease (GVHD) in transplantation settings.

En 2002, el petrolero Prestige se hundió vertiendo una gran cantidad de fuel que poco después llegó a las costas gallegas. En las tareas de limpieza del fuel colaboraron un gran número de personas que se expusieron a los compuestos químicos potencialmente tóxicos y algunos, como el benceno, carcinógenos. En un estudio genotóxico realizado dos años después de la exposición al fuel, por nuestro grupo (Prestige I), se observó un incremento de alteraciones cromosómicas estructurales en los individuos expuestos. Las conclusiones de este estudio evidenciaron la importancia de realizar un estudio de seguimiento de los mismos individuos a más largo plazo (Prestige II), dada la asociación existente entre aumento de alteraciones cromosómicas y riesgo a desarrollar cáncer. El objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar si el efecto genotóxico detectado persiste transcurridos 4 años del estudio anterior. Para ello se han estudiado 105 pescadores gallegos expuestos (E) y no expuestos (NE) al fuel. Además, 9 individuos se han incluido en un grupo especial de cáncer. Se han llevado a cabo cultivos convencionales de linfocitos de 72h en medio RPMI-1640. En total se han analizado 11.651 metafases con tinción secuencial uniforme-bandas G y 3.130 cariotipos para la detección de lesiones cromosómicas y alteraciones cromosómicas estructurales, respectivamente. La frecuencia de lesiones cromosómicas observada es similar en individuos expuestos y no expuestos en ambos estudios (Prestige I y Prestige II), indicando que las lesiones cromosómicas no son un buen biomarcador para analizar el efecto del fuel, si este ya no está presente. Se ha detectado una frecuencia elevada de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos E, indicando que el efecto genotóxico detectado anteriormente aún persiste 4 años después y que las células de la médula ósea podrían haber sido afectadas por la exposición al fuel. Así mismo, la frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos no expuestos era mayor que la observada en el Prestige I, lo que hace pensar que dichos individuos han estado sometidos, durante estos años, a una exposición indirecta al fuel de menor intensidad. Los individuos diagnosticados de cáncer presentan una frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales similar a la observada en individuos expuestos al fuel en Prestige II. Estos datos muestran la necesidad de hacer un seguimiento de los individuos que estuvieron muy expuestos al fuel, con el fin de detectar el cáncer en etapas más tempranas. Los estudios de genotoxicidad del Prestige I y II son, hasta el momento, los únicos que han analizado la exposición aguda al fuel en un elevado número de individuos muy seleccionados, a medio y largo plazo (2 y 6 años después de la exposición). / In 2002 the oil tanker Prestige wrecked near the Spanish region of Galicia, in the northwestern Atlantic coast of Spain. A big quantity of oil was spilt and reached the nearby coast soon after. An important amount of people took part in the cleaning tasks of the fuel and were therefore exposed to potentially toxic chemicals, some of them being carcinogens, as it is the case of benzene. A genotoxic study, carried out by our group (Prestige I) 2 years after the exposure to the fuel, showed an increase in structural chromosome aberrations in the exposed individuals. The conclusions from that study revealed the importance of conducting a follow up study of the same individuals in a longer term period (Prestige II), due to the existing association between the increase of chromosome aberrations and the risk of developing cancer. The main objective of this doctoral thesis is to determine if the genotoxic effect detected in these individuals persist four years after the previous study, by analyzing 105 fishermen, exposed (E) and not exposed (NE) to the fuel. Furthermore, 9 individuals have been included in a special cancer group. Conventional culturing of 72-hour lymphocytes in RPMI-1640 medium was carried out. A total of 11.651 metaphases were analysed sequentially stained, uniform- G-bands, and 3.130 karyotypes in order to detect chromosome lesions (gaps and breaks) and structural chromosome aberrations respectively. The observed frequency of chromosome lesions is similar in both groups exposed and not exposed, in both studies (Prestige I and Prestige II), indicating that chromosome lesions are not a good biomarker to analyse the fuel effect, when the fuel is not longer present. An elevated amount of structural chromosome aberrations has been detected in exposed individuals, which indicates that the genotoxic effect previously observed still persists four years later, and that the cells of the bone marrow could have been affected due to the exposure to the fuel. Moreover, the frequency of structural chromosome aberrations in not exposed individuals has been greater than observed in Prestige I, which makes us believe that these individuals have undergone, during these years, a less intense and indirect exposure to the fuel. The individuals diagnosed with cancer present a frequency in structural chromosome aberrations similar to the observed in individuals exposed to the fuel in Prestige II. Such data proves the need for following up of the most exposed individuals, aiming to detect cancer in the initial stages. The genotoxic studies in Prestige I and II are, so far, the only studies that have analysed the acute exposure to the fuel in an important quantity of well chosen individuals, in a medium and long-term period (2 and 6 years after the exposure).

El petrolier Prestige (2002) es va enfonsar abocant al mar unes 65.000 tones de fuel que, dies després, van contaminar les costes gallegues. Durant les tasques de neteja, més de 300.000 persones van estar exposades als components genotòxics del fuel, com el benzè i el benzopirè. El nostre grup va realitzar un estudi genotòxic dos anys després de l’exposició al fuel (Prestige I), observant un augment de les alteracions cromosòmiques estructurals en els individus exposats. L’associació existent entre l’augment de les alteracions cromosòmiques i el risc de desenvolupar càncer va fer que es plantegés la necessitat de realitzar un estudi de seguiment (Prestige II). Aquesta tesi doctoral té com objectiu principal determinar si l’efecte genotòxic, prèviament detectat, persisteix sis anys després de l’exposició. S’han estudiat 104 pescadors gallecs, 58 exposats i 46 no exposats al fuel, amb cultius estàndards de limfòcits de 48 h. A més, s’han realitzat cultius de limfòcits amb afidicolina en 44 d’aquests mateixos individus, per comprovar l’existència d’errors en la reparació de l’ADN. Basant-nos en els resultats d’aquest treball, en els obtinguts prèviament (Prestige I i Prestige II cultius de 72 h) i en les comparacions realitzades entre ells, podem concloure que: a) en els estudis de seguiment només s’han d’incloure els individus prèviament analitzat, b) les lesions cromosòmiques no són un bon biomarcador de genotoxicitat quan el temps transcorregut des de l’exposició al fuel és superior a dos anys, c) el temps de cultiu no afecta a la detecció de dany cromosòmic després de dos anys de l’exposició, d) la freqüència d'alteracions cromosòmiques estructurals en individus exposats al fuel és entre dos i tres vegades superior a la descrita en la població normal, confirmant que l'efecte genotòxic persisteix sis anys després de l'exposició, e) l’augment d’alteracions cromosòmiques en els individus no exposats suggereix que han estat sotmesos a una exposició secundària al fuel (aliments contaminats o residus emmagatzemats) o a algun altre agent genotòxic, que els ha fet empitjorar des del Prestige I, f) l’augment del dany detectat en individus exposats al fuel, tan en Prestige I com en Prestige II, està associat a errors en la reparació de l’ADN. Finalment, l’interès socio-sanitari dels nostres resultats, posa de manifest la necessitat de portar a terme estudis semblants que permetin confirmar si l’exposició accidental al fuel incrementa el risc de desenvolupar càncer. / The tanker Prestige (2002) wrecked and spill about 65.000 tons of oil and pollutants into the sea at the Galician coasts. During the cleaning tasks, more than 300.000 people were exposed to genotoxic oil components, like benzene and benzopyrenne. Our group carried out a genotoxic study two years after the exposure to oil (Prestige I) and showed an increase in structural chromosome alterations in exposed individuals. The associations between the increase of chromosomal alterations and the risk of developing cancer revealed the importance of conducting a follow-up study (Prestige II). The main objective of this doctoral thesis is to determine if the previously detected genotoxic effect persists six years after the exposure. We have analyzed 104 fishermen, 58 exposed and 46 not exposed to the oil, with conventional culturing of 48 h lymphocytes. And 44 of the same individuals were studied with culturing with aphidicolin, to test possible errors in DNA repair. Based on our results, the results of the previous studies (Prestige I 72 h and Prestige II 72h) and the comparison between them, we must conclude that: a) follow-up studies only have to include previously studied individuals, b) chromosomal lesions are not a good genotoxicity biomarker when the fuel is not present, c) the time of culturing does not affect the detection of chromosomal damage two years after the exposure, d) the frequency of structural chromosome alterations is about two times higher than described in normal population, which confirms that genotoxic effect previously detected still persists six years after the exposure, e) the increase of damage in non-exposed individuals makes us believe that these individuals have undergone a less intense exposure to the oil (contaminated food or stored residues) or to another genotoxic agent, which affected them, f) the high damage in exposed individuals, in Prestige I and Prestige II, is associated with errors in DNA repair. Finally, the socio-sanitary interest of our results shows the need for similar studies to confirm if accidental exposure to oil increases the risk of developing cancer.

La correcta trazabilidad de las muestras derivadas de la práctica de las técnicas de reproducción asistida principalmente ovocitos, semen y embriones es esencial, tanto en la reproducción asistida de humanos como de animales de renta. Los sistemas actualmente destinados a mantener identificada la muestra durante su paso por el laboratorio y a preservar dicha trazabilidad presentan ciertas limitaciones. En esta tesis se ha desarrollado un sistema de etiquetaje directo de ovocitos y embriones utilizando microdispositivos codificados de polisilicio que permite mantener la muestra identificada, y por lo tanto trazarla durante todo su procesamiento cubriendo así la mayoría de las limitaciones detectadas en los sistemas actualmente disponibles para esta función. / The correct traceability of samples derived from the practice of assisted reproductive technologies mainly oocytes, semen and embryos is essential, both in human and livestock assisted reproduction. Current systems designed to maintain the sampleidentifiedduringallthe laboratory procedures and to preserve its traceability have certain limitations. In this thesis a direct tagging system for oocytes and embryos, using encoded polysilicon microdevices, has been developed. This system keeps the sample identified throughout its processing, allowing its traceability at any time. Thus, the limitations detected in the systems currently available can be overpassed by means of the implementation of the direct tagging system developed here.