Trabajos previos llevados a cabo en el laboratorio de acogida, usando como modelo el insecto basal Blattella germanica, mostraron que los microRNAs (miRNAs) son cruciales para completar la metamorfosis. El objetivo general de esta tesis fue identificar miRNAs que estuviesen implicados en este proceso. Como primer paso, se estableció un catálogo general de miRNAs en B. germanica mediante secuenciación con Solexa. A partir de ahí, se prepararon dos librerías de miRNAs, una en la etapa metamórfica y otro en la etapa no metamórfica, para distinguir miRNAs diferencialmente expresados entre las dos etapas y evaluar la influencia de las hormonas principales de la metamorfosis sobre la expresión de estos miRNAs. Nuestros experimentos también mostraron que los factores de transcripción Broad-complex inducen la expresión de let-7 y miR-100, y que estos miRNAs desempeñan un papel en la regulación del tamaño y del patrón de venas e intervenas de las alas de B. germanica. Por último, se estudió el papel de miR-8-3p y miR-8-5p en la regulación de los niveles de transcrito de atrofina, un factor implicado en la coordinación neuromuscular, que es importante para asegurar una adecuada ecdisis en la muda metamórfica. / Previous work carried out in the host laboratory, using the basal insect Blattella germanica as model, showed that microRNAs (miRNAs) are crucial to complete metamorphosis. The general goal of this thesis was to identify particular miRNAs involved in this process. As a first step, we established a general catalogue of miRNAs in B. germanica using high throughput Solexa sequencing. Thereafter, we prepared two miRNA libraries; one in the metamorphic stage and other one in the non-metamorphic stage, to distinguish miRNAs differentially expressed between the two stages, and to assess the influence of the main metamorphosis hormones on the expression of these miRNAs. Our experiments also showed that Broad complex transcription factors induce the expression of let-7 and miR-100, and that these miRNAs play a role in regulating the size and the vein-intervein patterning of B. germanica wings. Finally, we studied the role of miR-8-3p and miR- 8-5p in regulating the transcript levels of atrophin, a factor involved in neuromuscular coordination, which is important to ensure a proper ecdysis in the metamorphic molt.

Embryonic stem (ES) cells are able to differentiate into any cell type, a property called pluripotency, and have unlimited potential for self-renewal. Although the molecular mechanisms responsible for maintaining self-renewal and pluripotency in ES cells are not well known, recent studies have demonstrated the importance of epigenetic mechanisms in maintaining these processes. Histone modifying enzymes play decisive roles in differentiation and development. This study describes that SMYD2 (SET and MYND domain containing protein 2), a histone lysine methyltransferase, is induced during human ES cells differentiation and it is preferentially expressed in somatic cells versus pluripotent cells. Gain and loss-of-function experiments have shown that knockdown of SMYD2 in human ES cells promotes the induction of endodermal markers during differentiation, while overexpression has opposite effects. In vivo experiments in zebrafish revealed that knockdown of smyd2a (a homologue gene of human SMYD2) causes developmental delays and aberrant tail formation. The phenotype of smyd2a-morphant embryos correlates with a low expression of ntl and over induction Nodal-related genes during gastrulation. Finally, SMYD2 is shown to stimulate the activation of BMP signaling pathway and promotes the induction of BMP2-target genes in human ES cells. Overall, these findings suggest that SMYD2 plays a critical role at early stages during development and in human ES cells differentiation. / Les cèl·lules mare embrionàries (ES) són capaces de diferenciar-se a qualsevol tipus cel·lular, una propietat coneguda amb el nom de pluripotència, i presenten un potencial il·limitat d’auto-renovació. Tot i que els mecanismes moleculars responsables per al manteniment de la pluripotència i l’auto-renovació en ES encara no es coneixen bé, estudis recents han demostrat la importància dels mecanismes epigenètics en mantenir aquests processos. Els enzims modificadors d´histones juguen un paper decisiu durant la diferenciació i el desenvolupament. Aquest estudi descriu que SMYD2 (SET and MYND domain containing protein 2), una metiltransferasa d’histones, s’indueix durant la diferenciació de cèl·lules ES i s’expressa preferentment en cèl·lules somàtiques envers cèl·lules pluripotents. Experiments de guany i pèrdua de funció mostren que el noqueig de SMYD2 en cèl•lules ES humanes promou la inducció de marcadors d’endoderm durant la diferenciació, mentre que la sobre-expressió té efectes oposats. Experiments in vivo en el peix zebra van revelar que el noqueig de smyd2a (un gen homòleg de SMYD2 humà) causa retard en el desenvolupament i formació aberrant de la cua. El fenotip dels embrions absents de smyd2a es correlaciona amb una baixa expressió de ntl i una sobre-inducció dels gens relatius a Nodal durant la gastrulació. Finalment, SMYD2 estimula l’activació de la via de senyalització BMP i promou la inducció dels gens diana de BMP2 en cèl·lules ES humanes. En general, aquests descobriments suggereixen que SMYD2 juga un paper important durant els estadis primerencs en el desenvolupament embrionari i durant la diferenciació de cèl·lules ES humanes.

Seven linker histone H1 variants exist in human somatic cells with distinct prevalence among cell types and during differentiation. Despite being key chromatin structural components, it remains elusive how they participate in the regulation of nuclear processes. Moreover, it is not well understood whether the different variants have specific roles or are differentially distributed along the genome. By taking advantage of specific antibodies for H1 variants and HA-tagged recombinant H1s expressed in breast cancer cells, the distribution of somatic variants H1.2 to H1.5, H1.0 and H1X has been investigated by combining ChIP-qPCR, ChIP-chip, and ChIP-seq analysis. All H1 variants bind gene promoters and are depleted from the TSS in active genes, and also from regulatory sites. The extension of H1 depletion at promoters is dependent on the transcriptional status of the gene and differs between variants. Analyses show that histone H1 is not uniformly distributed along the genome and differences among variants exist, being H1.2 the variant showing a more specific pattern and a strongest correlation with gene repression in breast cancer cells. Results suggest that different variants may be present at different chromatin types, and this may depend on the cell type, differentiation state, and whether cells are originated from a neoplastic process. In a second part of the thesis, it is shown that a previously reported H1.4 knock-down cell line presents and off-target effect against lamin B2. Therefore, it has been developed a new inducible knock-down cell line specifically inhibiting H1.4, which resembles previously characterized H1.2 knock-down. Finally, combined depletion of H1.4/lamin B2 and H1.2/H1.4 causes similar effects in T47D breast cancer cell line. / Fins a set variants de la histona H1 s han identificat en mamífers, les quals mostres una prevalença diferent entre tipus cel lulars i durant el procés de diferenciació. Tot i que la histona H1 juga un paper clau en l estructuració de la cromatina, no s acaba d entendre encara com participa exactament en els diferent processos cel lulars. A més a més, encara no està clar si les diferents variants tenen funcions específiques ni si es distribueixen igual al llarg del genoma. Mitjançant anticossos específics per algunes variants d H1 i de línies cel lulars de càncer de mama que expressen H1s recombinant fusionades a un pèptid HA, s ha estudiat la distribució genòmica de H1.2 a H1.5, H1.0 i H1X, combinant ChIP-qPCR, ChIP-chip i ChIP-seq. Totes les H1s es troben a promotors gènics i empobrides a l inici de transcripció dels gens actius, i també a les regions reguladores. El grau de disminució d H1 al promotor depèn de l estat transcripcional del gen i presenta diferències entre variants. Els anàlisis mostren que la histona H1 no es distribueix uniformement al genoma i que hi ha diferències entre variants, essent H1.2 la variant que presenta un patró més específic i una correlació més forta amb repressió gènica a cèl lules de càncer de mama. Aquests resultats suggereixen que variants d H1 diferents es troben presents als diversos tipus de cromatina, i aquest fet podria dependre de la línia cel lular, l estat de diferenciació, o de si les cèl lules s han originat durant un procés neoplàsic. En una segona part de la tesi, es mostra que una línia cel lular anteriorment descrita que inhibeix H1.4 presenta un efecte inespecífic contra lamina B2. Així, s ha desenvolupat una altra línia que inhibeix H1.4 específicament, la qual s assembla a un mutant anteriorment caracteritzat que inhibeix H1.2. Finalment, la inhibició combinada de H1.4/lamina B2 i H1.2/H1.4 provoca efectes fenotípics semblants a cèl lules de càncer de mama T47D.

At the metaphase-to-anaphase transition, spindle microtubules pull replicated chromosomes to the daughter cells, but full separation of long chromosome arms is achieved in late anaphase. We have created an allelic series of long chromosomes to elucidate the mechanisms involved in long chromosome resolution during mitosis. With this method we have shown that long chromosome cells are sensitized to the loss of genes involved in chromosome structure and segregation. We have discovered that Topoisomerase II is needed during anaphase to resolve distal regions of long chromosomes and that the activity of the microtubule polymerase Stu2 is crucial in the resolution of catenations. Moreover, we have identified the nuclear organization as a new source that contributes to the topological stress accumulated in chromosomes. Thus, topological constraints imposed by chromosome length and nuclear architecture determine the amount of sister chromatid intertwinings that must be resolved by Topoisomerase II and dynamic microtubules during anaphase. / A la transició entre metafase i anafase els microtúbuls del fus mitòtic transporten els cromosomes a les cèl·lules filles, tot i això la separació completa dels braços dels cromosomes no succeeix fins al final dʼanafase. Amb lʼobjectiu dʼentendre com es resolen els cromosomes llargs durant anafase, hem creat una sèrie al·lèlica de cromosomes artificalment llargs. Amb aquesta metodologia hem demostrat que les cèl·lules que contenen cromosomes llargs estan sensibilitzades a la pèrdua de gens involucrats en lʼestructura i la segregació de cromosomes. Hem descobert que la Topoisomerasa II es necesària durant anafase per resoldre les regions distals de cromosomes llargs i que lʼactivitat de la polimerasa de microtúbuls, Stu2, és essencial en la resolució de concatenacions entre cromàtides germanes. A més, hem pogut identificar lʼorganització nuclear com una nova font que contribueix a lʼestrés topològic acumulat als cromosomes. En conclusió, les restriccions topològiques que imposen tant la longitud dels cromosomes com lʼarquitectura nuclear determinen la quantitat de concatenacions entre cromàtides germanes que han de ser resoltes per la Topoisomerasa II i els microtúbuls dinàmics durant anafase.

Cellular senescence is an irreversible form of proliferative arrest, historically linked to tumour suppression and aging. Recent discoveries, however, have extended its known role to include complex biological processes such as tissue repair, tumour promotion and age-related disorders. These new insights are redefining our view of cellular senescence, that unlike a static endpoint, senescence represents a collective phenotype, composed of complex networks of effector programs. The biological outcome of these effector programs varies depending on the cellular context and nature of the stress. Here, we investigated the functional role of senescence in two polar contexts: first, within the epidermal stem cell population during the aging process, and second, during embryonic development. We identified that the primitive Keratin-15 positive (Krt-15) hair follicle stem cell population increases in number in an age-dependent manner, but exhibits decreased functional capacity and an inability to tolerate stress. While there was no evidence of Krt-15 stem cells entering directly into senescence, we identified an age-associated imbalance in epidermal Jak-Stat signalling surrounding the stem cells, reminiscent of extrinsic senescent cells that inhibit stem cell function. These findings suggest that epidermal stem cell decline contributes to the aging phenotype of tissue, and that this may be directed by extrinsic senescence. Conversely, we also describe cellular senescence as a normal developmental mechanism that occurs during mammalian embryonic development, specifically in the apical ectodermal ridge (AER) and the roof plate of the hindbrain neural tube. Interestingly, developmental senescence is strictly dependent on p21, wherein mice deficient in p21 present with defects in embryonic senescence, AER maintenance and abnormal limb patterning. Additionally, we found significant gene-expression overlap between developmental and oncogene-induced senescence in the adult, suggesting a commonality in function. Furthermore, we found that the underlying mesenchyme is a source for senescence instruction, while the fate of senescent cells is both apoptosis and immune-mediated clearance. These findings indicate that senescence also functions in non-pathological states and plays an instructive role during embryonic development, and suggests that senescence may have evolved initially as a developmental mechanism that was subsequently adapted for its role in adult life. / La senescencia celular es una forma irreversible de paro proliferativo ligado históricamente a la supresión tumoral y al envejecimiento. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que también juega un papel en complejos procesos biológicos como reparación tisular, promoción tumoral y desórdenes relacionados con la edad. Estos nuevos conocimientos están redefiniendo nuestra visión de la senescencia celular, no tanto como un proceso estático sino como un fenotipo colectivo compuesto por una compleja red de programas efectores. El resultado biológico de estos programas efectores varía dependiendo del contexto celular y la naturaleza del estrés. Aquí, hemos investigado el papel funcional de la senescencia en dos contextos antagónicos: primero, en la población de células madre del epidermis durante el proceso de envejecimiento, y segundo, durante el desarrollo embrionario. Hemos demostrado que la población de células madre del folículo piloso que expresan queratina 15 aumenta en número en función de la edad, pero presenta una disminución de la capacidad funcional y una incapacidad de tolerar el estrés. Si bien no hemos encontrado ninguna evidencia de que las células madre que expresan queratina 15 entren directamente a senescencia, hemos identificado un desequilibrio en la vía de señalización de Jak-Stat alrededor de las células madre, posiblemente procedente de células senescentes extrínsecas que inhiben la función de las células madre. Estos descubrimientos sugieren que el declive de las células madre epidérmicas contribuye al envejecimiento del tejido y que puede estar dirigido por la senescencia extrínseca. Por otra parte, también hemos descrito el proceso celular de la senescencia como un mecanismo normal en el desarrollo embrionario de los mamíferos, específicamente en la cresta ectodérmica apical (AER) y en la placa del techo del tubo neural. Cabe notar que la senescencia del desarrollo es estrictamente dependiente de p21. Así, los ratones deficientes de p21 presentan defectos en la senescencia embrionaria, el mantenimiento del AER y la formación de las extremidades. Además, hemos visto que hay un solapamiento importante en la expresión génica de la senescencia del desarrollo y la senescencia inducida por oncogenes en los adultos, sugiriendo una similitud en la función. Asimismo, hemos descubierto que el mesénquima subyacente actúa como instructor de la senescencia, y que el destino de las células senescentes es entrar en apoptosis y ser eliminadas por el sistema inmunitario. Estos hallazgos indican que la senescencia también tiene lugar en estados no patológicos y que juega un papel instructivo durante el desarrollo embrionario. Hacen pensar que la senescencia podría haber evolucionado inicialmente como un mecanismo del desarrollo que fue adaptándose para su papel en la vida adulta.

Mouse embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass of the blastocyst can be maintained in culture, under pluripotent conditions, using Serum+LIF medium. However, it has been published that the minimal combination of two compounds (GSK3 and MEK inhibitors) can sustain mouse ES cell self- renewal in absence of serum inhibiting ERK and Wnt/ β-catenin singaling pathways. Previous work of our laboratory has reported that periodic activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway enhances reprogramming of somatic cells. Here we have demonstrated a dynamical interplay between β-catenin and Nanog in regulating both pluripotency and reprogramming. Specifically, fluctuations of Nanog affect β-catenin dynamics in serum+LIF, whereas, activation of the Wnt pathway, using Wnt3a or GSK3 inhibitors, causes β-catenin oscillations independent from Nanog. Moreover we have also proved that Nanog-mediate reprogramming depends on the indirect activation of the Wnt/β-catenin pathway. With our work we proposed a novel interaction between two parallel signalling pathways and provided a comprehensive mathematical model describing Nanog and β-catenin dynamics in mouse ES cells. / Las células madre embrionarias de ratón (ES) derivadas de la masa celular interna del blastocisto, se pueden mantener en estado de pluripotencia, utilizando condiciones de cultivo que contiene Suero + factor LIF. Sin embargo, se ha publicado que la combinación mínima de dos compuestos (inhibidores de GSK3 y MEK) pueden sostener la autorrenovación de las ES en ausencia de un suero represor de las vías de señalización ERK y Wnt/β-catenina. Anteriores trabajos de nuestro laboratorio han demostrado que la activación periódica de la vía de señalización Wnt/β-catenina mejora la reprogramación de células somáticas. Aquí hemos demostrado que hay una interacción dinámica entre la β-catenina y Nanog en la regulación tanto de la pluripotencia como la reprogramación. Concretamente, las fluctuaciones de Nanog afectan a la dinámica de β-catenina en el medio con Suero + LIF, mientras que, la activación de la vía de señalización utilizando Wnt3a o inhibidores de GSK3, provoca oscilaciones de β-catenina independientes de Nanog. Por otra parte, también hemos demostrado que la reprogramación mediada por Nanog es dependiente de la activación indirecta de la vía señalización de Wnt/β-catenina. Nuestro trabajo ha propuesto una nueva interacción entre dos vías de señalización paralelas, además ha proporcionado un modelo matemático amplio que describe la dinámica de Nanog y de β-catenina en células ES de ratón.

During mitosis, spindle assembly involves different sources of microtubules including centrosomes and chromosomes. While the role of centrosomes has been extensively studied, we still do not fully understand how chromosomes trigger microtubule assembly thereby contributing to the formation of the mitotic spindle. The chromosomal pathway is largely determined by a RanGTP gradient centered on the chromosomes that induces the local activation of spindle assembly factors. To get a better understanding on the RanGTP-dependent microtubule assembly during mitosis we aimed at: i) Identifying new RanGTP regulated proteins involved in spindle assembly. Our results pointed to three novel proteins with a putative mitotic role in the RanGTP pathway. ii) Understanding how the RanGTP pathway regulates microtubule nucleation during mitosis. We found that TPX2 together with Aurora-A and RHAMM are part of a RanGTP-dependent complex that binds and strongly stimulates the -TuRC nucleation activity. iii) Investigating the contribution of the RanGTP pathway to spindle assembly. Our data provided novel evidences that MTs nucleated close to the chromosomes participate in the k-fibers assembly process. / Durante la mitosis, el proceso de ensamblaje del huso mitótico implica diferentes fuentes de microtúbulos incluyendo centrosomas y cromosomas. Mientras que el rol de los centrosomas ha sido extensamente estudiado, no se entiende en su totalidad como los cromosomas inducen la formación de microtúbulos contribuyendo de esta manera al ensamblaje del huso mitótico. La vía de los cromosomas está mayormente determinada por un gradiente de RanGTP, centrado en los cromosomas, que induce la activación local de factores mitóticos. Para entender el mecanismo que promueve el ensamblaje de los microtúbulos vía RanGTP durante la mitosis, este trabajo tuvo los siguientes objetivos: i) La identificación de nuevas proteínas reguladas por RanGTP que participan en el ensamblaje del huso. Nuestros resultados apuntan a tres nuevas proteínas con un posible papel mitótico en la vía RanGTP de ensamblaje de los microtúbulos. ii) El estudio de el mecanismo para el cual RanGTP regula la nucleación de microtúbulos durante la mitosis. Hemos descubierto que TPX2 junto con Aurora-A y RHAMM son parte de un complejo RanGTP dependiente que estimula la actividad de nucleación de el TuRC. iii) El estudio del papel de la vía de RanGTP en el ensamblaje del huso. En particular, nuestros datos proporcionan nuevas evidencias sobre la participación de los MTs nucleados alrededor de los cromosomas en el proceso del ensamble de fibras cinetocóricas.

Non-coding RNA functions are emerging in the recent years. In this thesis we describe a Natural Antisense Transcript (NAT) that controls the expression of LEF1 transcriptional factor. This LEF1 NAT is transcribed from a promoter present in the first LEF1 intron and undergoes splicing in mesenchymal cells. In epithelial cells, there is no expression of LEF1 NAT. However, in metastable epithelial cells, LEF1 NAT is transcribed and a significant part of it remains unspliced and, contrarily to the spliced NAT, down-regulates the main LEF1 promoter and LEF1 mRNA and protein expression. Moreover, unspliced NAT also down-regulates cell migration and up-regulates Ecadherin expression. Unspliced LEF1 NAT interacts with LEF1 promoter and physically associates with Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) inducing its binding to the LEF1 promoter and trimethylating Lysine 27 in Histone 3. Spliced LEF1 NAT prevents the binding between unspliced LEF1 NAT and LEF1 promoter, inhibiting LEF1 promoter repression. Thus, these results indicate that LEF1 gene expression is finely controlled by splicing of the LEF1 NAT that, when is not processed, recruits PRC2 to LEF1 promoter to inhibit it. / En els darrers anys, les funcions exercides pels ARN no codificants estan creixent. En aquesta tesi es descriu un Natural Antisense Transcript (NAT) que controla l’expressió del factor de transcripció LEF1. Aquest NAT de LEF1 és transcrit des del promotor que es troba al primer intró de LEF1 i es processa mitjançant splicing en les cèl·lules mesenquimals. En les cèl·lules epitelials no hi ha expressió del NAT de LEF1. No obstant, en les cèl·lules epitelials que inicien la Transició Epiteli-Mesènquima (EMT), una part significativa de NAT no es processa i, contràriament al NAT que ha estat processat, fa baixar l’activitat del principal promotor de LEF1 i disminueix l’expressió de LEF1, a nivell d’ARN i proteïna. A més, el NAT que no ha estat processat també disminueix la migració cel·lular i incrementa l’expressió de l’E-caderina. El NAT de LEF1 interactua amb el promotor de LEF1 i s’uneix físicament amb Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) induint-ne la seva unió al promotor de LEF1 i trimetilant la Lisina 27 de l’Histona 3. El NAT de LEF1 que ha estat processat prevé la unió entre el NAT que no ho ha estat i el promotor de LEF1, prevenint la repressió del promotor de LEF1. Per tant, aquests resultats indiquen que l’expressió de LEF1 està finament controlada pel processament del NAT de LEF1 que, quan no ha patit splicing, recluta PRC2 al promotor de LEF1 per inhibir-lo.

The TRPV4 cation channel is expressed in a broad range of tissues where participates in the generation of a Ca2+ signal. TRPV4 participation in osmo- and mechanotransduction contributes to important functions such as cellular and systemic volume homeostasis, among others. TRPV4 also responds to temperature and 4α-phorbol 12,13-didecanoate (4αPDD) thus showing multiple modes of activation. Besides, dozens of TRPV4 mutations have been linked to osteoarticular and neuromuscular diseases. However, little is known about the domains relevant for TRPV4 activation by different stimuli. This Thesis research aims to elucidate the participation of the N-terminal cytosolic tail in the gating of TRPV4 by physiological stimuli and the channel implication in cell motility. I provide evidences that activation of TRPV4 by hypotonic shocks and temperature requires PIP2 binding within the sequence 121KRWRK125 of the N-terminus tail and rearrangement of the cytosolic tails. My results also point to the participation of TRPV4 in cell migration by modulating the dynamics of trailing adhesions, a function that may require the interplay of TRPV4 with other cation channels present at the focal adhesion sites. Resumen El canal TRPV4 es un canal / El canal TRPV4 es un canal catiónico capaz de generar señales intracelulares de Ca2+ en diversos tejidos. La participación del canal TRPV4 en procesos de mecano-osmotransducción le implica en funciones tan importantes como la regulación del volumen celular y sistémico. El TRPV4 también se activa en respuesta a calor y al agonista sintético 4αPDD, lo que implica la presencia de varios modos de activación. Además, existen numerosas mutaciones en el TRPV4 que se han encontrado en pacientes que sufren de patología osteoarticular y neuromuscular. Sin embargo, aún se desconocen aspectos de su función relacionados con los mecanismos de activación. Mi trabajo de Tesis doctoral aborda el estudio de la región N-terminal del TRPV4, su participación en la activación del canal por estímulos fisiológicos y la relevancia del canal en proceso de migración celular. Esta Tesis doctoral proporciona evidencias de que el TRPV4 necesita unir PIP2 a través de la secuencia 121KRWRK125 de la cola N-terminal y que las colas se reorganicen para que el canal se abra en respuesta a estímulos osmóticos y de calor. Mis estudios también sugieren que el canal TRPV4 participa en la modulación de la adherencia de la cola durante el proceso de la migración celular, posiblemente interaccionando con otros canales presentes en las adhesiones focales.

One of the major goals of current stem cell research is understanding the mechanism of somatic cell reprogramming by Oct4, Sox2, Klf4 and Myc (OSKM) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the finding that only a small proportion of the cells become reprogrammed, typically requiring >12 days, has hampered progress towards this goal. C/EBPα is a transcription factor specifically expressed in myelomonocytic cells within the hematopoietic system whose forced expression in B cells efficiently induces transdifferentiation into macrophages. We have now found that an 18-hour pulse of C/EBPα expression followed by OSKM activation induces an approximately 100-fold increase in the iPSC reprogramming efficiency, involving up to 95% of the cells within a week. Concomitantly, the cells undergo an epithelial-mesenchymal transition and pluripotency genes become upregulated to levels comparable to embryonic stem and iPS cells. In serum-free conditions the process is further accelerated, with 60% of the poised and OSKM induced B cells becoming Oct4-GFP positive within 2 days. These results are consistent with the idea that the C/EBPα pulse helps to overcome the stochastic phase of iPSC reprogramming. In addition, our work shed new light on the role of C/EBPα in induced pluripotency. Our data indicate that C/EBPα acts as a pathbreaker, at least in part mediated by the dioxygenase Tet2. C/EBPα binds to the Tet2 gene, induces its expression and translocates the protein to the nucleus. Here Tet2 binds to regulatory regions of pluripotency genes and converts methylated cytosine residues into hydroxymethylated cytosines. The pulse also renders the chromatin at regulatory sites of pluripotency genes accessible to DNase I digestion and, following OSKM induction, leads to local demethylation and to the binding of Oct4, correlating with the observed rapid upregulation of pluripotency genes. In line with an important role of Tet2 as a mediator of reprogramming, coexpression of the gene with OSKM enhanced B cell reprogramming substantially. The rapid and highly efficient iPSC reprogramming approach described herein should help to fully elucidate the early events of reprogramming to pluripotency and, if applicable to human cells, could have potential clinical applications. / Actualmente uno de los principales objetivos de la investigación con células madre es la comprensión de los mecanismos por los cuales las células somáticas se pueden reprogramar a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) por la acción de los factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4 y Myc (OSKM). Sin embargo, la baja eficiencia de este proceso, que tiene lugar sólo en un pequeño porcentaje de células y que típicamente requiere más de 12 días para llevarse a cabo, ha impedido la consecución de grandes avances en este campo en los últimos años. C/EBPα es un factor de transcripción específico de células del linaje mielo-monocítico del sistema hematopoyético. La expresión ectópica de esta proteína en células B puede inducir su transdiferenciación a macrófagos. En nuestro estudio de investigación hemos descubierto que la exposición de C/EBPα durante 18 horas seguida de la activación de OSKM, aumenta en 100 veces la eficiencia de reprogramación de las iPSC, resultando en la reprogramación del 95% de las células después de una semana. En detalle, durante este proceso de reprogramación las células experimentan una transición epitelio-mesénquima y los genes de pluripotencia se expresan en niveles comparables a los expresados en células madre embrionarias y iPSC. Cuando la reprogramación se lleva a cabo en medio de cultivo sin suero el proceso es aún más rápido, de tal modo que el 60% de las células B inducidas por C/EBPα y OSKM son positivas para Oct4-GFP en tan sólo dos días. Estos resultados apoyan la idea de que una exposición transitoria de C/EBPα ayuda a superar la fase estocástica de la reprogramación de las iPSC. Además, nuestros descubrimientos aclaran el papel de C/EBPα en el proceso de pluripotencia inducida, indicando que actúa como un catalizador, mediado en parte por la actividad de la dioxigenasa Tet2. De tal modo, que C/EBPα se une a regiones reguladoras del locus de Tet2, induciendo de esta manera su expresión y translocando la proteína al núcleo. Una vez en el núcleo, Tet2 se une a las regiones regulatorias de los genes de pluripotencia y convierte los residuos de citosinas metilados existentes en estas regiones en citosinas hidroximetiladas. Además, la exposición transitoria de C/EBPα deja la cromatina más accesible a la digestión con DNasa I alrededor de las regiones regulatorias de los genes de pluripotencia y, tras la inducción con OSKM, desencadena una demetilación local favoreciendo la posterior unión de Oct4 a estas regiones. Todo ello finalmente promueve la expresión concomitante de los genes de pluripotencia. Adicionalmente, en nuestro estudio se demuestra que la coexpresión de Tet2 y OSKM aumenta significativamente la reprogramación de las células B, lo cual se encuentra en línea con un papel importante de Tet2 en la reprogramación. En resumen, en este estudio se presenta el sistema de reprogramación de iPSC más rápido y eficiente descrito a día de hoy. El cual, facilitará la comprensión de los eventos precoces en el proceso de reprogramación a pluripotencia y, en el caso de que se pueda extrapolar a células humanas, podrá tener aplicaciones clínicas relevantes en el campo de la medicina regenerativa.