Els teixits d'inervació tenen una funció esencial a la regulació de les poblacions neuronals definitives mitjançant el control del fenòmen de la mort neuronal fisiològica, basat en el subministrament limitat de neurotrofines (NT's) a les neurones embrionàries. Al cas de les motoneurones (MTN's) de la medul.la espinal, encara no s'ha establert amb precissió la identitat de les molècules neurotròfiques derivades del múscul que governen aquest procès. La primera part d'aquest estudi parteix del desenvolupament d'un model de cultiu de MTN's espinals d'embrió de pollastre. La tècnica utilitzada -de sedimentació sobre un gradient de densitat- permet obtenir una població pura de MTN's embrionàries d'acord amb criteris morfològics, bioquímics i immunocitoquímics. S'ha usat aquest sistema in vitro per la caracterització del procès de mort fisiològica de les MTN's com apoptòtic, i l'estudi de la dependència de les MTN's per a la seva supervivència de les activitats tròfiques presents al teixit muscular esquelètic. Així mateix, s'han analitzat alguns dels mecanismes implicats a la mort de les MTN's per deprivació neurotròfica, rebent especial atenció la participació del metabolisme de les pirimidines al control de la supervivència de les MTN's embrionàries. Durant el desenvolupament embriològic, les MTN's espinals modifiquen els seus requeriments tròfics. A les etapes tardanes del periode de mort fisiològica, aquestes neurones adquireixen la capacitat de respondre a les NT's BDNF, NT-3 i NT-4/5. En aquest estudi, s'ha correlacionat aquesta resposta amb el patró d'expressió dels receptors TrkB i TrkC a la superfície de les MTN's espinals. La seva activació pels factors corresponents comporta la fosforilació i, presumiblement, l'activació de les kinases citosòliques MAPK's. D'altra banda, emprant com a model el receptor TrkA present a la superfície de les neurones simpàtiques del gangli cervical superior de l'embrió de rata i de les cèl.lules PC12, s'ha comprovat com l'autofosforilació dels receptores Trk és necessària per les respostes de supervivència i diferenciació neuronal induïdes per les NT's, encara que d'una manera diferent. L'activitat bioelèctrica també sembla participar a la regulació de la supervivència neuronal embrionària. La despolarització crònica de la membrana cel.lular amb concentracions elevades de K + estimula la supervivència de les MTN's espinals embrionàries mitjançant l'increment de la [Ca 2+ ]i en relació amb l'activació de canals de Ca 2+ dependents de voltatge de tipus L. Així mateix, comporta l'activació de la via de transducció p21ras-MAPK, independentment de l'estimulació dels receptors Trk presents a la superfície de les MTN's. / Los tejidos de inervación tienen una función esencial en la regulación de las poblaciones neuronales definitivas a través del control del fenómeno de la muerte neuronal fisiológica, basado en un suministro limitado de neurotrofinas (NT's) a las neuronas embrionarias. En el caso de las motoneuronas (MTN's) de la médula espinal, aún no se ha establecido con precisión la identidad de las moléculas neurotróficas derivadas del músculo que gobiernan dicho proceso. La primera fase de este estudio parte del desarrollo de un modelo de cultivo de MTN's espinales de embrión de pollo. La técnica usada -de sedimentación sobre un gradiente de densidad- permite obtener una población pura de MTN's embrionarias según criterios morfológicos, bioquímicos e inmunocitoquímicos. Este sistema in vitro ha sido utilizado para caracterizar el proceso de muerte fisiológica de las MTN's como apoptótico, y estudiar la dependencia de las MTN's para su supervivencia de las actividades tróficas presentes en el tejido muscular esquelético. Asimismo, se han analizado algunos mecanismos implicados en la muerte de las MTN's por deprivación neurotrófica, mereciendo especial atención la participación del metabolismo de las pirimidinas en el control de la supervivencia de las MTN's embrionarias. Durante el desarrollo embrionario, las MTN's espinales modifican sus requerimientos tróficos. En las etapas tardías del período de muerte fisiológica, estas neuronas adquieren la capacidad de responder a las NT's BDNF, NT-3 y NT-4/5. En este estudio, se ha correlacionado dicha respuesta con el patrón de expresión de los receptores TrkB y TrkC en la superficie de las MTN's espinales. Su activación por los correspondientes ligandos comporta la fosforilación y, presumiblemente, activación de las kinasas citosólicas MAPK's. Por otra parte, tomando como modelo el receptor TrkA presente en la superficie de las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior del embrión de rata y de las células PC12, se ha comprobado cómo la autofosforilación de los receptores Trk es necesaria para las respuestas de supervivencia y diferenciación neuronal inducidas por las NT's, aunque de forma diferente. La actividad bioeléctrica también parece participar en la regulación de la supervivencia neuronal embrionaria. La despolarización crónica de la membrana celular con elevadas concentraciones de K + estimula la supervivencia de las MTN's espinales embrionarias a través del incremento de la [Ca 2+ ]i en relación con la activación de canales de Ca 2+ dependientes de voltaje tipo L. Asimismo, comporta la activación de la vía de transducción p21ras-MAPK, independientemente de la estimulación de los receptores Trk presentes en la superficie de las MTN's. / Neuronal targets of innervation are major determinants in the regulation of the final neuronal populations by controlling naturally-occurring cell death. Such phenomenon is based upon the limited supply of neurotrophins (NT's) to embryonic neurons. The identity of muscle-derived neurotrophic molecules involved in the control of naturally-occurring cell death of motoneurons (MTN's), has not yet been established. First, a culture system for chick embryo spinal MTN's was developed. The methodology employed -a density-gradient sedimentation technique- yields a pure population of embryonic MTN's according to morphological, biochemical, and immunocytochemical criteria. This in vitro system was then used to characterize naturally-occurring death of MTN's as apoptotic, and to study the dependence of MTN's for survival on the trophic activities derived from skeletal muscle tissue. Moreover, some of the mechanisms mediating MTN death upon trophic deprivation were analyzed. The relevance of pyrimidine metabolism to this type of neuronal death merited special attention. Spinal MTN's switch their trophic requirements throughout embryonic development. Late during naturally-occurring death, these neurons become responsive to the NT's BDNF, NT-3, and NT-4/5. In this study, this property was correlated with the presence on the surface of spinal MTN's of receptors TrkB and TrkC. Their activation by the corresponding neurotrophic factors was shown to cause the phosphorylation and, presumably, activation of cytosolic MAPK's in cultured spinal MTN's. Furthermore, by using TrkA receptors present on the membrane surface of sympathetic superior cervical ganglion neurons and PC12 cells as an experimental model, autophosphorylation of Trk receptors was demonstrated to be necessary for both survival and differentiation induced by NT's, although in not in the same manner. Bioelectric activity also seems to participate in the regulation of neuronal survival during embryonic development. Chronic cell membrane depolarization with high concentrations of K + was found to stimulate survival of embryonic spinal MTN's. This effect was mediated by a rise in [Ca 2+ ]i related to the activation of type-L voltage-gated Ca 2+ channels. Moreover, membrane depolarization caused the activation of the p21ras-MAPK signal transduction pathway, which occurred independently of the stimulation of Trk receptors present on the surface of cultured MTN's.

Artículo 1. Activación de la apoptosis mitocondrial en el linfoma de células del manto (LCM): elevada sensibilidad a mitoxantrona en casos con genes de respuesta a daño a DNA funcionales.El LCM es un síndrome linfoproliferativo agresivo y altamente resistente a las terapias actuales. Al estudiar el efecto citotóxico de la fludarabina, la mitoxantrona y la ciclofosfamida sobre células primarias de LCM y sobre células de líneas celulares portadoras de la t(11;14)(q13;q32) se demuestra que la mitoxantrona, un inhibidor de la topoisomerasa II, ejerce el mayor efecto citotóxico. Además, la variante blástica es más sensible a la mitoxantrona que la variante típica posiblemente debido a los elevados niveles de expresión de la topoisomerasa-II-alfa en los casos blásticos. La citotoxicidad inducida por estos fármacos genotóxicos está mediada por la activación de la vía apotótica mitocondrial debido a un daño en el DNA, por lo que es necesario que los sensores de daño a DNA, p53 y/o ATM, sean funcionales.Artículo 2. La expresión del transportador equilibrativo de nucleósidos-2 (hENT2) correlaciona con la sensibilidad ex vivo a la fludarabina en células de leucemia linfática crónica-B (LLC-B).El efecto de la fludarabina sobre células de LLC-B viene determinado, en primera instancia, por el transporte vía hENT2, atribuyéndole importancia, por primera vez, en el efecto terapéutico de un análogo de nucleósidos. La expresión de este transportador correlaciona significativamente con el efecto citotóxico inducido por la fludarabina en células de LLC-B.Artículo 3. La expresión del transportador equilibrativo hENT1 correlaciona con el transporte de gemcitabina y la citotoxicidad in vitro del fármaco en células de linfoma de células del manto (LCM).Sin embargo, las células de LCM, que no responden in vitro a la fludarabina, expresan niveles más altos de mRNA y de proteína de hENT1 que de hENT2. Esta expresión diferencial podría explicar la diferente respuesta a la fludarabina entre células de LCM y LLC-B. La gemcitabina, fármaco transportado mayoritariamente por hENT1, induce un efecto citotóxico sobre células de LCM a dosis inferiores a las necesarias de fludarabina para ejercer el mismo efecto, lo que nos sugiere que el análisis de la expresión de transportadores de nucleósidos en las células de LLC-B y LCM resulta útil para la elección del tratamiento a seguir y posiblemente para predecir la respuesta al tratamiento.Artículo 4. La pérdida de expresión de MTAP en el linfoma de células del manto está asociada a una corta supervivencia. Implicación para una posible terapia dirigida.Los casos de LCM que presentan deleción del gen MTAP y pérdida de expresión de la proteína se asocian a una mayor agresividad de la enfermedad y peor pronóstico. Este fenómeno se debe, muy probablemente, a la estrecha relación entre el gen MTAP y el locus INK4a-ARF en este tipo de tumores, lo que sugiere que la detección inmunohistoquímica de MTAP puede ser un buen marcador de la pérdida de todo el locus. Además, el análisis de la expresión de MTAP puede ser una buena herramienta para identificar aquellos pacientes que podrían beneficiarse de una terapia dirigida mediante la inhibición de la vía de síntesis de novo de AMP. Nuestros resultados apoyan la idea del uso de la combinación de L-alanosina y EFA como tratamiento de esos casos con deleción de MTAP. / In this study we have analyzed the mechanisms of drug-induced cell death in four cell lines with the t(11;14) and in primary cells from 10 patients with MCL. Mitoxantrone, a topoisomerase II inhibitor, induced a strong cytotoxic effect in three cell lines (JVM-2, REC-1, and Granta 519), as well as in primary MCL cells. This cytotoxic effect due to apoptosis induction was observed despite the presence of either p53 or ATM abnormalities. However, no cytotoxic effect was detected after incubation with DNA damaging agents in the NCEB-1 cell line carrying p53 and ATM alterations, despite the presence of a functional mitochondrial machinery. These results support that mitoxantrone can be effective in the treatment of MCL but that this activity requires the integrity of functional DNA-damage response genes. Fludarabine is considered the treatment of choice for most patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). We have analyzed the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in CLL cells. In this study, we have observed a significant correlation between the expression of hENT2 by Western blot and fludarabine uptake via hENT carriers and also with ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. These results suggest that the equilibrative nucleoside transporter hENT2 plays a role in fludarabine responsiveness in CLL patients.MCL cells express high levels of hENT1 protein compared to CLL cells, and a good correlation was found between protein and mRNA levels of hENT1, thus indirectly suggesting that hENT1 might be transcriptionally regulated in MCL cells. More importantly, a significant correlation between these two parameters, drug uptake and sensitivity to gemcitabine was also observed. These results further support that NTs are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues, and suggest a particular and novel role for hENT1 in the genotoxic response to selected nucleoside analogues, such as gemcitabine, in MCL cells. In this study we have determined the methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) gene alterations in MCL and investigated whether the targeted inactivation of the alternative de novo AMP synthesis pathway may be an useful therapeutic strategy in tumors with inactivation of this enzyme. MTAP gene deletion and protein expression correlated with clinical behavior. L-alanosine induced cytotoxicity in MCL cells. 9-beta-D-Erythrofuranosyl adenine (EFA), an analogue of MTA, selectively rescued MTAP positive cells from Lalanosine toxicity. MTAP gene deletion and lack of protein expression are associated with poor prognosis in MCL and might identify patients who might benefit from treatment with "de novo" AMP synthesis pathway targeted therapies.

En aquest treball de tesi hem estudiat per primera vegada l’expressió funcional dels canals de calci dependents de voltatge (CCDV) en melanòcits humans i un ampli rang de línies cel.lulars i biòpsies de melanoma humà, mitjançant tècniques de biologia molecular i d’imatge. Els nostres resultats demostren que els melanòcits control i les cèl.lules de melanoma expréssen isoformes de les famílies de gens Cav1 i Cav2. De forma destacable, l’expressió d’isoformes de la família Cav3 (canals de tipus T) es troba restringida a les cèl.lules de melanoma, en les que promouen la progressió del cicle cel.lular. Aquests resultats motiven l’anàlisi dels CCDV-T com a dianes terapèutiques contra la tumorigènesi i/o progressió tumoral del melanoma. En aquesta línea, hem trobat que mibefradil i pimozida, dos bloquejants de CCDV-T d’us clínic, inhibeixen el creixement de les cèl.lules de melanoma in vitro, i que aquest efecte és degut tant a una reducció de la proliferació cel.lular, com a una inducció de la mort dependent de caspases. Hem explorat les vies moleculars implicades en el procés apoptòtic i hem trobat que ambdues drogues indueixen estrés de reticle endoplasmàtic (RE) i la inhibició subsequent de l’autofàgia basal constitutiva present a les cèl.lules de melanoma. Finalment, hem demostrat, a través del seu silenciament gènic, que la isoforma Cav3.2 és la diana molecular dels bloquejants de CCDV-T, en el que respecta als seus efectes sobre l’estrés de RE i l’autofàgia. Conjuntament, els resultats obtinguts en el decurs d’aquesta tesi apunten als canals de tipus T como a possibles marcadors de pronòstic i/o dianes terapèutiques contra la metastasi del melanoma. / Hemos estudiado por primera vez la expresión funcional de los canales de calcio voltaje-dependientes (CCDV) en melanocitos humanos y un amplio rango de líneas celulares y biopsias de melanoma humano, mediante técnicas de biología molecular y de imagen. Nuestros resultados demuestran que los melanocitos control y las células de melanoma expresan isoformas pertenecientes a las famílias de genes Cav1 y Cav2. De forma destacable, la expresión de isoformas de la família Cav3 (canales de tipo T) se encuentra restringida a las células de melanoma, en las que promueven la progresión del ciclo celular. Estos resultados motivan el análisis de los CCDV-T como dianas terapéuticas contra la tumorigénesis y/o progresión tumoral del melanoma. En esta línea, hemos encontrado que mibefradil y pimozida, dos bloqueantes de CCDV-T de uso clínico, inhiben el crecimiento de las células de melanoma in vitro, y que este efecto es debido tanto a una reducción de la proliferación celular como a una inducción de la muerte dependiente de caspasas. Hemos explorado las vías moleculares implicadas en el proceso apoptótico y hemos hallado que ambas drogas inducen estrés de retículo endoplasmático (RE) y la inhibición subsiguiente de la autofagia basal constitutiva presente en las células de melanoma. Finalmente, hemos demostrado, a través de su silenciamiento génico, que la isoforma Cav3.2 es la diana molecular de los bloqueantes de CCDV-T en lo concerniente a sus efectos sobre el estrés de retículo endoplasmático y la autofagia. Conjuntamente, los resultados obtenidos en el curso de esta tesis apuntan a los canales de tipo T como posibles marcadores de pronóstico y/o dianas terapéuticas contra la metástasis del melanoma. / We have addressed for the first time the functional expression of voltage-gated calcium channels (VGCCs) in human melanocytes and a range of melanoma cell lines and biopsies, by molecular biology and imaging techniques. Our results show that control melanocytes and melanoma cells express channel isoforms belonging to the Cav1 and Cav2 gene families. Importantly, the expression of isoforms of Cav3 (T-type) channels is restricted to melanoma cells, in which they promote cell cycle progression. These results encourage the analysis of T-type VGCCs as targets for therapeutic intervention in melanoma tumorigenesis and ⁄or tumour progression. In this regard, we have found that mibefradil and pimozide, two clinically-used T-type Ca2+ channel blockers, inhibit the in vitro growth of melanoma cells, and that this effect is due to both a reduction in the cell proliferation rate and an induction of caspase-dependent cell death. We have further explored the molecular pathways leading to T-type channels blockers-mediated apoptosis, and found that both drugs induce endoplasmic reticulum (ER) stress and a subsequent inhibition of the basal autophagy present in melanoma cells. Finally, we have demonstrated by a gene silencing approach that the Cav3.2 isoform is the molecular target of T-type channel blocker mediated effects on ER-stress and autophagy. Altogether, the results attained in this thesis point to T-type Ca2+ channels as putative prognosis markers and/or therapeutic targets to tackle melanoma metastasis.

L’enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa o HMGR catalitza la reacció irreversible de reducció del HMG-CoA a mevalonat. Aquesta molècula, el mevalonat, es el primer intermediari específic de la ruta del mevalonat, una de les dues rutes biosintètiques de la síntesi de compostos isoprenoides en plantes. Els isoprenoides, també anomenats terpenoides, son un grup de molècules molt diversificat, no nomes pel que respecta a la seva funció, sinó també en estructura. A les plantes, s’han descrit mes de 29000 isoprenoides, amb funcions que van des de la formació i manteniment dels teixits fins a l’adaptació al medi. L’HMGR has estat objecte d’una gran quantitat d’estudis a llevats I animals, I s’ha descrit com el pas limitant pel que fa a la ruta de síntesi de colesterol. En aquests dos tipus d’organisme, el control sobre l’activitat de l’HMGR es molt complex, incloent diversos mecanismes de regulació com ara fosforilació, proteòlisi regulada o control transcripcional. En plantes, es conegut que l’HMGR es l’enzim que catalitza el pas limitant en la biosíntesi d’isoprenoides de la ruta del MVA. Al genoma d’Arabidopsis thaliana, trobem dos gens que codifiquen per tres isoformes diferents de l’HMGR. Les dues isoformes codificades al gen HMG1, difereixen entre elles únicament en una regió extra de 50 aminoàcids a la zona N-terminal de la proteïna, i degut a aquesta diferencia, han estat nominades d’acord amb això. D’aquesta manera trobem HMGR1S o isoforma curta de la proteïna, i HMGR1L o isoforma llarga. Ambdues isoformes es troben localitzades a la membrana del reticle endoplasmàtic (RE) però, mentre HMGR1L es troba present en una distribució uniforme dins la xarxa de túbuls i cisternes d’aquest orgànul, HMGR1S s’acumula específicament en unes vesícules associades amb aquesta xarxa. Aquest punt va esser demostrat gracies a la utilització d’un marcador de RE. Plantes transgèniques transformades amb una construcció quimèrica on el domini catalític de l’HMGR1S ha estat substituït per la proteïna verda fluorescent (GFP) han mostrat que aquestes vesícules son especifiques dels cotiledons, i que tenen una morfologia fusiforme. Estructures similars van ser trobades en plantes transgèniques que expressen la proteïna quimèrica GFP-HDEL, un altre marcador de la xarxa de RE. Aquestes vesícules van ser nomenades ER-bodies, i se sap que estan implicades en defensa i adaptació al medi ambient. Experiments de colocalització in planta han permès establir que la HMGR es troba present en aqeusts ER-bodies, i per tant aquest enzim podria estar implicat en la morfogènesi del RE o en la síntesi d’isoprenoides específics per a defensa. Anàlisis bioquímics d’activitat enzimàtica especifica HMGR en cèl•lules d’Arabidopsis van mostrar que l’activitat es troba disminuïda en situacions d’estres, sigui aquest biòtic o abiòtic, suggerint un reclutament de molecules d’HMGR cap als ER-bodies. Els nostres resultats suggereixen que, l’HMGR, una proteïna molt estudiada a nivell enzimàtic, presenta una funció paral•lela important per a l’estructuració del RE, que alhora es important enfront la resposta de la planta a estres, sense descartar, però, que al mateix temps l’HMGR podria estar implicada en la creació d’un entorn subcel•lular específic on la captació d’altres proteïnes amb activitat enzimàtica podria portar a la síntesi de compostos isoprenoides específics. / "Analysis of HMG-CoA Reductase of Arabidopsis thaliana: implication in the morphogenesis of the endoplasmic reticulum" The enzyme 3-hydroxi-3-methylglutharyl CoA Reductase or HMGR catalyzes the irreversible reaction of reduction of HMG-CoA to mevalonate, the first specific intermediate product of the mevalonate pathway, one of the two biosynthetic pathways of isoprenoid compounds in plants. Isoprenoid compoundsare a group of molecules with an extreme diversification. In plants, more than 29000 different isoprenoid have been identified, with completely different functions that range from formation and maintenance of tissues to adaptation to the environment. The HMGR has been extensively studies in yeast and mammals, as it is the limiting step of the synthesis of cholesterol. In plants, it is known that HMGR is also the limiting step in the biosynthesis of isoprenoides of the MVA pathway. In the genome of Arabidopsis thaliana, there are two genes that encode three different isoforms of HMGR. The two isoforms encoded in HMG1 gene differ only in an N-terminal extra region of 50 amino acids, and they were named according to that: HMGR1S or short, and HMGR1L or long isoform. HMGR1S is accumulated specifically in vesicles associated with it along its network. These vesicles are specific of the cotyledons and have an spin-shaped morphology. Similar structures called ER-bodies, involved in defense and adaptation to the environment have been described. Colocalization experiments in planta have shown that ER-bodies contain HMGR. Our results suggest that a very well-known metabolic protein, has a parallel function in the structure of the ER, important for the response to stress, without discarding that at the same time HMGR can produce an specific environment by recruiting other metabolic enzymes that lead to specific types of isoprenoid compounds.