L’enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa o HMGR catalitza la reacció irreversible de reducció del HMG-CoA a mevalonat. Aquesta molècula, el mevalonat, es el primer intermediari específic de la ruta del mevalonat, una de les dues rutes biosintètiques de la síntesi de compostos isoprenoides en plantes. Els isoprenoides, també anomenats terpenoides, son un grup de molècules molt diversificat, no nomes pel que respecta a la seva funció, sinó també en estructura. A les plantes, s’han descrit mes de 29000 isoprenoides, amb funcions que van des de la formació i manteniment dels teixits fins a l’adaptació al medi. L’HMGR has estat objecte d’una gran quantitat d’estudis a llevats I animals, I s’ha descrit com el pas limitant pel que fa a la ruta de síntesi de colesterol. En aquests dos tipus d’organisme, el control sobre l’activitat de l’HMGR es molt complex, incloent diversos mecanismes de regulació com ara fosforilació, proteòlisi regulada o control transcripcional. En plantes, es conegut que l’HMGR es l’enzim que catalitza el pas limitant en la biosíntesi d’isoprenoides de la ruta del MVA. Al genoma d’Arabidopsis thaliana, trobem dos gens que codifiquen per tres isoformes diferents de l’HMGR. Les dues isoformes codificades al gen HMG1, difereixen entre elles únicament en una regió extra de 50 aminoàcids a la zona N-terminal de la proteïna, i degut a aquesta diferencia, han estat nominades d’acord amb això. D’aquesta manera trobem HMGR1S o isoforma curta de la proteïna, i HMGR1L o isoforma llarga. Ambdues isoformes es troben localitzades a la membrana del reticle endoplasmàtic (RE) però, mentre HMGR1L es troba present en una distribució uniforme dins la xarxa de túbuls i cisternes d’aquest orgànul, HMGR1S s’acumula específicament en unes vesícules associades amb aquesta xarxa. Aquest punt va esser demostrat gracies a la utilització d’un marcador de RE. Plantes transgèniques transformades amb una construcció quimèrica on el domini catalític de l’HMGR1S ha estat substituït per la proteïna verda fluorescent (GFP) han mostrat que aquestes vesícules son especifiques dels cotiledons, i que tenen una morfologia fusiforme. Estructures similars van ser trobades en plantes transgèniques que expressen la proteïna quimèrica GFP-HDEL, un altre marcador de la xarxa de RE. Aquestes vesícules van ser nomenades ER-bodies, i se sap que estan implicades en defensa i adaptació al medi ambient. Experiments de colocalització in planta han permès establir que la HMGR es troba present en aqeusts ER-bodies, i per tant aquest enzim podria estar implicat en la morfogènesi del RE o en la síntesi d’isoprenoides específics per a defensa. Anàlisis bioquímics d’activitat enzimàtica especifica HMGR en cèl•lules d’Arabidopsis van mostrar que l’activitat es troba disminuïda en situacions d’estres, sigui aquest biòtic o abiòtic, suggerint un reclutament de molecules d’HMGR cap als ER-bodies. Els nostres resultats suggereixen que, l’HMGR, una proteïna molt estudiada a nivell enzimàtic, presenta una funció paral•lela important per a l’estructuració del RE, que alhora es important enfront la resposta de la planta a estres, sense descartar, però, que al mateix temps l’HMGR podria estar implicada en la creació d’un entorn subcel•lular específic on la captació d’altres proteïnes amb activitat enzimàtica podria portar a la síntesi de compostos isoprenoides específics. / "Analysis of HMG-CoA Reductase of Arabidopsis thaliana: implication in the morphogenesis of the endoplasmic reticulum" The enzyme 3-hydroxi-3-methylglutharyl CoA Reductase or HMGR catalyzes the irreversible reaction of reduction of HMG-CoA to mevalonate, the first specific intermediate product of the mevalonate pathway, one of the two biosynthetic pathways of isoprenoid compounds in plants. Isoprenoid compoundsare a group of molecules with an extreme diversification. In plants, more than 29000 different isoprenoid have been identified, with completely different functions that range from formation and maintenance of tissues to adaptation to the environment. The HMGR has been extensively studies in yeast and mammals, as it is the limiting step of the synthesis of cholesterol. In plants, it is known that HMGR is also the limiting step in the biosynthesis of isoprenoides of the MVA pathway. In the genome of Arabidopsis thaliana, there are two genes that encode three different isoforms of HMGR. The two isoforms encoded in HMG1 gene differ only in an N-terminal extra region of 50 amino acids, and they were named according to that: HMGR1S or short, and HMGR1L or long isoform. HMGR1S is accumulated specifically in vesicles associated with it along its network. These vesicles are specific of the cotyledons and have an spin-shaped morphology. Similar structures called ER-bodies, involved in defense and adaptation to the environment have been described. Colocalization experiments in planta have shown that ER-bodies contain HMGR. Our results suggest that a very well-known metabolic protein, has a parallel function in the structure of the ER, important for the response to stress, without discarding that at the same time HMGR can produce an specific environment by recruiting other metabolic enzymes that lead to specific types of isoprenoid compounds.

La vitamina E incluye una serie de compuestos amfipáticos esenciales en la dieta tanto para humanos como para animales y que únicamente puede ser sintetizada por organismos fotosintéticos, los tocoferoles y los tocotrienoles. Descubierta a principios del siglo XX, no fue hasta los años 60 que se asoció a propiedades antioxidantes. En plantas, se sabe que los niveles de tocoferol (la forma mayoritaria en hojas) aumenta en respuesta al estrés y que está implicado en el control de los niveles de las especies reactivas del oxígeno, la síntesis de las cuáles suele aumentar drásticamente en condiciones de estrés y pueden ir asociadas a graves daños celulares si no se regulan adecuadamente sus niveles. También interviene en la prevención de la propagación de la peroxidación lipídica en condiciones de estrés oxidativo, además de otras nuevas funciones que poco a poco se van descubriendo, como la importancia durante la germinación de semillas, la implicación en el transporte de fotoasimilados o un posible papel en señalización celular. En esta tesis se estudió la regulación de la biosíntesis de α- y γ-tocoferol en condiciones de estrés abiótico (déficit hídrico y estrés salino), así como su posible implicación en señalización celular en la planta modelo Arabidopsis thaliana y en la planta con metabolismo CAM, Aptenia cordifolia. Pero la vitamina E no actúa sola. Como antioxidante, puede trabajar coordinadamente con el ascorbato o con carotenoides además de con diversas fitohormonas, por lo que además, se estudió el papel como mecanismo fotoprotector, juntamente con los carotenoides y los niveles hormonales, tanto en condiciones de estrés como influenciados por la edad de la hoja. Los estudios en A. thaliana se llevaron a cabo utilizando diversos mutantes ya fueran de etileno o de tocoferol como aproximaciones a sistemas deficientes de ambos compuestos. Se observó que el etileno promueve la síntesis de tocoferol en A. thaliana, de forma especifica a través de las proteínas EIN2, EIN3 y EIL1. Además, niveles elevados de etileno promueven aumentos de tocoferol en hojas viejas y mutaciones en el gen que codifica para la proteína EIN3 es capaz de resistir dosis moderadas de salinidad, cambiando el balance hormonal foliar y aumentando el estrés oxidativo. Sorprendentemente, la biosíntesis de tocoferol no resultó estar regulada a nivel transcripcional. En el modelo de planta CAM, la A. cordifolia, el ABA jugó un papel importante en la regulación de la biosíntesis de tocoferol en condiciones de déficit hídrico. Juntamente con el β-caroteno y el ciclo de las xantofilas, los tocoferoles ayudan a la protección del PSII en condiciones de déficit hídrico y estrés salino cuando la demanda de fotoprotección es elevada, pero cuando los carotenoides se empiezan a degradar, el tocoferol es incapaz de substituirlos. Además, el γ-tocoferol parece tener funciones específicas además de precursor del α-tocoferol influenciando de forma específica los niveles de expresión de genes implicados en la biosíntesis, percepción y señalización del etileno en A. thaliana. Finalmente, cabe destacar que el tocoferol interviene en la comunicación cloroplasto-núcleo a través de regular los niveles de expresión de genes relacionados con el etileno, formando parte de la intrincada red de señalización retrógrada. / Vitamin E includes different amphipathic compounds, tocopherols and tocotrienols, essentials in the diet of humans and animals. It can be synthesized only by photosynthetic organisms and it was discovered in the early twentieth century but it was not until the 60‘s when it was associated with its antioxidant properties. In plants, it is known that the levels of α-tocopherol (the major form in leaves) increase in response to stress and they are involved in the control of the levels of reactive oxygen species (ROS). Under stress conditions the levels of ROS tend to increase dramatically and they could be associated with serious cell damage if their levels are not properly regulated. Moreover tocopherols are involved in prevention of the lipidic peroxidation propagation under oxidative stress conditions. Furthermore, new functions are gradually being discovered, like their importance in the process of seed germination, their role on the transport of the photoassimilates or their possible function in cell signalling. During this PhD I have studied the regulation of the biosynthesis of α- and γ-tocopherol under abiotic stress conditions (water and salt stress) and their possible role in cell signalling in the model plant Arabidopsis thaliana and in the CAM plant, Aptenia cordifolia. As an antioxidant, it might work in coordination with ascorbate or carotenoids as well as with some phytohormones. That is why we have studied their role as photoprotective mechanism together with carotenoids and the hormone levels in both stress conditions and the influence of leave age. The studies in A. thaliana were carried out using tocopherol or ethylene mutants as approximations to deficient systems of both compounds. It was observed that ethylene promotes synthesis of tocopherol in A. thaliana, specifically through EIN2, EIN3 and EIL1 proteins. In addition, elevated levels of ethylene induced tocopherol increase in old leaves. ein3-1 mutant plants were able to withstand moderate doses of salinity, changing leaf hormonal balance and increasing oxidative stress. Surprisingly, the biosynthesis of tocopherol was not being regulated at the transcriptional level. In the model CAM plant, A. cordifolia, the ABA played an important role in the regulation of tocopherol biosynthesis under water stress conditions. Together with β-carotene and the xanthophyll cycle, tocopherols help in the protection of PSII under both water and salt stress conditions when the demand for photoprotection is high. When carotenoids were beginning to degrade, tocopherols were unable to replace them. In addition, the γ-tocopherol seemed to have specific functions not only as α-tocopherol precursor. It can specifically influence the expression levels of genes involved in ethylene biosynthesis, perception and signalling in A. thaliana. Finally, in this PhD thesis it is demonstrated that tocopherol is involved in the chloroplast-nucleus communication by regulating the expression levels of genes related to ethylene as part of the intricate network of retrograde signalling.