En la presente Tesis se han analizado diferentes casos de estudio acerca del estrés abiótico en plantas, cuyos objetivos fueron: (a) estudiar la vinculación entre daño oxidativo y la fotoinhibición en plantas de soja sometidas a bajas temperaturas; (b) la fotoprotección en plantas de trigo duro sometidas a déficit hídrico (c) el daño oxidativo al aparato fotosintético del trigo blando bajo déficit hídrico (d) la respuesta fotosintética de la espiga y la hoja bandera de trigo duro bajo estrés hídrico post-antesis y (e) los rasgos fisiológicos asociados a un mejor comportamiento agronómico de dos cultivares de cebada en condiciones de déficit hídrico en clima mediterráneo. (a) La relación entre fluorescencia variable y fluorescencia máxima (Fv/Fm) decreció en plantas expuestas durante 24 hs. a 7ºC y 500 mol m-2 s-1 de irradiancia, pero no en hojas sometidas a frío en oscuridad. La fotoinhibición fue exacerbada mediante el tratamiento con lincomicina (inhibidor de la síntesis de proteínas cloroplásticas), sugiriendo que los mecanismos de reparación alivian el daño al fotosistema II (PSII) asociado al frío. El grado de daño oxidativo a proteínas tilacoidales (carbonilación) y a lípidos (malondialdehido) no cambia en respuesta al frío. La aplicación del precursor del ácido ascórbico (Gal), o del análogo del -tocoferol (Trolox) no previene la fotoinhibición por frío. Nuestros datos sugieren que el estrés por frío no causa daño oxidativo masivo a las proteínas tilacoidales y a lípidos.(b) El 'quenching no fotoquímico' (qN), así como el contenido de zeaxantina y anteraxantina aumentó con el estrés. El -caroteno se incrementó a estrés severo, sugiriendo un aumento de las defensas antioxidantes. El índice fotoquímico (PI), mostró una progresiva disminución, lo cual fue paralelo a un incremento en el estado de de-epoxidación del ciclo de las xantofilas (DPS). El PI estuvo negativamente correlacionado con el DPS y qN pudiendo ser un indicador de fotoprotección en el estudio del estrés vegetal.(c) En los tilacoides de plantas estresadas aumentó el daño oxidativo, asociado con una sustancial caída en el transporte electrónico fotosintético. La aplicación de Gal redujo el daño oxidativo a proteínas fotosintéticas de plantas estresadas, pero sólo revirtió parcialmente la disminución en la actividad del transporte electrónico. (d) La actividad fotosintética de la hoja bandera fue más afectada por el estrés hídrico que en la espiga, tanto en invernadero como en el campo. La menor sensibilidad de la espiga bajo estrés hídrico con respecto a la hoja bandera estuvo asociada a un mayor RWC y ajuste osmótico. Rasgos xeromórficos y el ajuste osmótico de brácteas y aristas estaría relacionado a la 'tolerancia' de la espiga a la sequía. Por otra parte, no se encontraron evidencias de metabolismo C4 tanto en espigas de plantas bien regadas como bajo estrés hídrico.(e) La producción del cultivar Graphic fue mayor que la de Kym en todas las condiciones, con más espigas por unidad de superficie, lo cual podría ser atribuido a mayor crecimiento potencial durante el ahijamiento. Graphic mostró mayor 13C de los granos, sugiriendo un mejor estatus hídrico. También mostró mayor biomasa aérea y de raíces, así como área foliar total por planta. Asimismo se observó una mayor cantidad de hijuelos por planta, pero la relación biomasa de vástago/raíz fue menor. La tasa fotosintética fue menor en Graphic., así como el rendimiento cuántico del PSII, sugiriendo que mecanismos distintos a la estructura foliar contribuyeron la mayor capacidad fotosintética de Kym. Sin embargo, como resultado en las diferencias en área foliar, la fotosíntesis total por planta fue mayor en Graphic. El mayor rendimiento de Graphic podrían ser sustentado por un mayor crecimiento de la planta y fotosíntesis total durante el ahijado, aunque la capacidad fotosintética por unidad de área foliar es menor que en el caso de Kym. Graphic tiene un mayor sistema radical que Kym, lo que podría mejorar el estatus hídrico. / In the present thesis we analyse several case studies about abiotic stress in plants. In particular we studied (a) the relationship between oxidative damage and fotoinhibition in soybean plants under light chilling (b) the photoprotection response in durum wheat subjected to water stress (c) the oxidative damage to photosynthetic apparatus in bread wheat under water deficit (d) the comparative response of the photosynthesis of the ear and the flag leaf of durum wheat and (e) physiological traits involved in the yield performance of two barley cultivars under Mediterranean conditions. The results of the present thesis can be summarised as follow: (a) light-chilling stress does not cause rampant oxidative damage to thylakolids protein and lipids. Reactive oxygen species do not seem to be involved in fotoinhibition (b) electron transport rate decreased in water-stressed leaves of durum wheat, associated with a rise in non-radiative dissipation at PSII level (and a rise in the de-epoxidation state of xanthophyll cycle, DPS) and a drop in the proportion of PSII centres in open state. Intactness of PSII was not affected, even at severe water stress. Photochemical Index (derived from spectroradiometrical measurements) showed a strong correlation with qN and DPS, and may be a reliable indicator of photoprotection in the study of plant stress.(c) in thylakoids of water-stressed plant there was an increase in oxidative damage in proteins. Oxidative damage was associated with a decrease in electron transport rate activity. Treatment with an precursor of ascorbic acid reduced the oxidative damage to photosynthetic proteins of droughted plants and partially reverted the decrease in electron transport (d) photosynthetic activity of the flag leaf was more affected by water stress than that of the ear. The lower sensitivity under water stress of the ear was linked to higher relative water content and osmotic adjustment in ear bracts and awns. C4 metabolism was not detected in the ear (e) Graphic production was greater than Kym in all conditions, sustained mainly by more ears per unit ground area. Graphic showed greater carbon isotopic discrimination, suggesting improved water status. Photosynthetic rate in area basis was lower in Graphic than Kym, although the former showed higher total leaf area and lower shoot/root ratio.

In order to improve our understanding on LEA proteins and their molecular functions in drought tolerance, the present work analyzes in the first place, the composition of LEA subproteomes from Arabidopsis seeds and maize embryos; second, three maize embryo LEA proteins from groups 1, 2, and 3 are analyzed in order to detect functional differences among them and finally, transgenic maize plants over-expressing group 5 “rab28” lea gene are characterized. The following results are presented: - Chapter 1. Proteomic approach to analyze the composition of LEA subproteomes from Arabidopsis seeds by mass spectrometry. The main objective was the development and isolation method to obtain enriched LEA populations from Arabidopsis seeds. LEA subproteomes were obtained using an extraction procedure that combines heat stability and acid solubility of LEA proteins. To identify the protein content, we followed two approaches: first, a classical 1D (SDSPAGE) gel-based procedure associated with MS analysis using an electrospray ionization source coupled on-line to liquid chromatography (LC-ESI-MSMS) and second, a gel-free protocol associated with an off-line HPLC and analysis via matrix assisted laser desorption/ionization (LC-MALDI-MSMS). - Chapter 2. Proteomic analysis of LEA proteins accumulated in maize mature seeds. Identification of LEA protein content by mass spectrometry and selection of three LEA proteins, Emb564, Rab17 and Mlg3, as representatives of groups 1, 2 and 3 for further study. Comparative functional analysis covering different aspects of maize Emb564, Rab17 and Mlg3 proteins, posttranslational modifications, subcellular localization and their properties in in-vitro and in- vivo assays. - Chapter 3. Characterization of transgenic maize plants expressing maize group 5 rab28 LEA gene under the ubiquitin promoter. Evaluation of Rab28 transcripts and protein levels, phenotype and stress tolerance traits of transgenic plants under drought stress. Investigation of the subcellular localization of transgenic and wild-type Rab28 protein using immunocytochemical approaches. / Las proteínas LEA, originalmente fueron descritas en las semillas de algodón; se acumulan en grandes cantidades en estructuras tolerantes a la desecación (semillas, polen) y en tejidos vegetativos sometidos a estrés abiótico, sequía, salinidad y frío. También se hallan en organismos anidrobióticos, en plantas de resurrección, algunos invertebrados y microorganismos. La presencia de proteínas LEA se correlaciona con la adquisición de tolerancia a la desecación. Desde un principio se les atribuyó un papel en las respuestas de las plantas en la adaptación al estrés (revisado en Bartels and Salamini 2001, Tunnacliffe 2007, Shih et al. 2010, Tunnacliffe 2010, Hand et al. 2011). Las proteínas LEA se clasifican en diversos grupos en función de dominios y secuencias de aminoácidos específicos (Wise 2010, Batagglia et al 2008, Bies-Ethève et al 2008). Los grupos 1, 2 y 3 son los más relevantes ya que abarcan la mayoría de las proteínas de la familia LEA. Una característica general de estas proteínas es su elevada hidrofilicidad, alto contenido de aminoácidos cargados y su falta de estructura en estado hidratado. A pesar de encontrarse mayoritariamente en forma de “random coil”, algunas adquieren un cierto grado de estructura durante la deshidratación o en la presencia de agentes promotores de α-hélices (Shih et al. 2010, Hand et al. 2011). A nivel celular se han hallado en todas las localizaciones, citosol, núcleo, nucleolo, mitocondria, cloroplasto, vacuola, retículo endoplásmico, peroxisoma y membrana plasmática, donde se supone ejercen su función protectora frente al estrés (Tunnacliffe and Wise 2007, Hundertmark and Hincha 2008). En relación a las modificaciones post-traduccionales, algunas se hallan fosforiladas (Jiang and Wang 2004; Plana et al. 1991, Heyen et al. 2002, Rohrig et al. 2006). Los efectos protectores de las varias proteínas LEA se han demostrado mediante ensayos in vitro y en aproximaciones transgénicas que han dado lugar a fenotipos resistentes a la sequía, sal y frío. Por lo general, se considera que estas proteínas contribuyen a la protección y a la estabilización de macromoléculas y estructuras celulares en las respuestas de adaptación al estrés en plantas; sin embargo, sus funciones específicas aún no han sido esclarecidas. A nivel molecular se ha propuesto que las funciones de las proteínas LEA pueden ser variadas: estabilización y renaturalización de proteínas, mantenimiento de membranas, en combinación, o no, con azúcares, tampones de hidratación (substitución de moléculas de agua), afinidad por iones y función antioxidante (Tunnacliffe and Wise 2007, Shih et al. 2010, Batagglia et al. 2008). Para finalizar, diremos que los objetivos principales de esta tesis consisten en ampliar los conocimientos sobre las proteínas LEA y sus funciones relativas a la tolerancia a la sequía. Los resultados están presentados en forma de capítulos.

La vitamina E incluye una serie de compuestos amfipáticos esenciales en la dieta tanto para humanos como para animales y que únicamente puede ser sintetizada por organismos fotosintéticos, los tocoferoles y los tocotrienoles. Descubierta a principios del siglo XX, no fue hasta los años 60 que se asoció a propiedades antioxidantes. En plantas, se sabe que los niveles de tocoferol (la forma mayoritaria en hojas) aumenta en respuesta al estrés y que está implicado en el control de los niveles de las especies reactivas del oxígeno, la síntesis de las cuáles suele aumentar drásticamente en condiciones de estrés y pueden ir asociadas a graves daños celulares si no se regulan adecuadamente sus niveles. También interviene en la prevención de la propagación de la peroxidación lipídica en condiciones de estrés oxidativo, además de otras nuevas funciones que poco a poco se van descubriendo, como la importancia durante la germinación de semillas, la implicación en el transporte de fotoasimilados o un posible papel en señalización celular. En esta tesis se estudió la regulación de la biosíntesis de α- y γ-tocoferol en condiciones de estrés abiótico (déficit hídrico y estrés salino), así como su posible implicación en señalización celular en la planta modelo Arabidopsis thaliana y en la planta con metabolismo CAM, Aptenia cordifolia. Pero la vitamina E no actúa sola. Como antioxidante, puede trabajar coordinadamente con el ascorbato o con carotenoides además de con diversas fitohormonas, por lo que además, se estudió el papel como mecanismo fotoprotector, juntamente con los carotenoides y los niveles hormonales, tanto en condiciones de estrés como influenciados por la edad de la hoja. Los estudios en A. thaliana se llevaron a cabo utilizando diversos mutantes ya fueran de etileno o de tocoferol como aproximaciones a sistemas deficientes de ambos compuestos. Se observó que el etileno promueve la síntesis de tocoferol en A. thaliana, de forma especifica a través de las proteínas EIN2, EIN3 y EIL1. Además, niveles elevados de etileno promueven aumentos de tocoferol en hojas viejas y mutaciones en el gen que codifica para la proteína EIN3 es capaz de resistir dosis moderadas de salinidad, cambiando el balance hormonal foliar y aumentando el estrés oxidativo. Sorprendentemente, la biosíntesis de tocoferol no resultó estar regulada a nivel transcripcional. En el modelo de planta CAM, la A. cordifolia, el ABA jugó un papel importante en la regulación de la biosíntesis de tocoferol en condiciones de déficit hídrico. Juntamente con el β-caroteno y el ciclo de las xantofilas, los tocoferoles ayudan a la protección del PSII en condiciones de déficit hídrico y estrés salino cuando la demanda de fotoprotección es elevada, pero cuando los carotenoides se empiezan a degradar, el tocoferol es incapaz de substituirlos. Además, el γ-tocoferol parece tener funciones específicas además de precursor del α-tocoferol influenciando de forma específica los niveles de expresión de genes implicados en la biosíntesis, percepción y señalización del etileno en A. thaliana. Finalmente, cabe destacar que el tocoferol interviene en la comunicación cloroplasto-núcleo a través de regular los niveles de expresión de genes relacionados con el etileno, formando parte de la intrincada red de señalización retrógrada. / Vitamin E includes different amphipathic compounds, tocopherols and tocotrienols, essentials in the diet of humans and animals. It can be synthesized only by photosynthetic organisms and it was discovered in the early twentieth century but it was not until the 60‘s when it was associated with its antioxidant properties. In plants, it is known that the levels of α-tocopherol (the major form in leaves) increase in response to stress and they are involved in the control of the levels of reactive oxygen species (ROS). Under stress conditions the levels of ROS tend to increase dramatically and they could be associated with serious cell damage if their levels are not properly regulated. Moreover tocopherols are involved in prevention of the lipidic peroxidation propagation under oxidative stress conditions. Furthermore, new functions are gradually being discovered, like their importance in the process of seed germination, their role on the transport of the photoassimilates or their possible function in cell signalling. During this PhD I have studied the regulation of the biosynthesis of α- and γ-tocopherol under abiotic stress conditions (water and salt stress) and their possible role in cell signalling in the model plant Arabidopsis thaliana and in the CAM plant, Aptenia cordifolia. As an antioxidant, it might work in coordination with ascorbate or carotenoids as well as with some phytohormones. That is why we have studied their role as photoprotective mechanism together with carotenoids and the hormone levels in both stress conditions and the influence of leave age. The studies in A. thaliana were carried out using tocopherol or ethylene mutants as approximations to deficient systems of both compounds. It was observed that ethylene promotes synthesis of tocopherol in A. thaliana, specifically through EIN2, EIN3 and EIL1 proteins. In addition, elevated levels of ethylene induced tocopherol increase in old leaves. ein3-1 mutant plants were able to withstand moderate doses of salinity, changing leaf hormonal balance and increasing oxidative stress. Surprisingly, the biosynthesis of tocopherol was not being regulated at the transcriptional level. In the model CAM plant, A. cordifolia, the ABA played an important role in the regulation of tocopherol biosynthesis under water stress conditions. Together with β-carotene and the xanthophyll cycle, tocopherols help in the protection of PSII under both water and salt stress conditions when the demand for photoprotection is high. When carotenoids were beginning to degrade, tocopherols were unable to replace them. In addition, the γ-tocopherol seemed to have specific functions not only as α-tocopherol precursor. It can specifically influence the expression levels of genes involved in ethylene biosynthesis, perception and signalling in A. thaliana. Finally, in this PhD thesis it is demonstrated that tocopherol is involved in the chloroplast-nucleus communication by regulating the expression levels of genes related to ethylene as part of the intricate network of retrograde signalling.