El objetivo principal de esta tesis fue el de realizar una validación y caracterización de las posibles variables que pueden afectar la metodología empleada para identificar las isoformas presentes en algunas de las especies de EPO (uEPO, rEPO alfa, rEPO beta y el NESP) tras su identificación mediante la técnica de IEF e inmunodetección

Los agentes anabolizantes prohibidos por la Comisión Médica del Comité Olímpico Internacional (COI) deben estar ausentes en las muestras de orina objeto de análisis. El límite de detección está condicionado por la sensibilidad del instrumento y la relación señal/ruido debida al material biológico coextraído junto con los analitos de interés. Las nuevas exigencias de sensibilidad del COI como la detección de nuevas sustancias utilizadas en dosis sensiblemente inferiores, obliga al replanteamiento de la estrategia analítica utilizada. El objetivo general de esta tesis es: desarrollar nuevas técnicas analíticas de alta sensibilidad para la detección de esteroides y otros anabolizantes en orina humana mediante: 1.- Estudio de la cromatografía liquida capilar para la cuantificación de las concentraciones de testosterona y epitestosterona en orina humana. 2.- Estudio de la purificación de la muestra previa al análisis instrumental. - Estudio del uso de la cormatografía de inmunoafinidad (IAC) en la purificación selectiva dela muestra. - Desarrollo de procedimientos mediante cromatografía líquida de alta resolución para la purificación de fracciones en los análisis de confirmación. 3.- Incremento de la sensibilidad en el análisis instrumental. - Estudio de la formación de tert-butildimetilsilil derivados como alternativa a los trimestilsilil derivados habitualmente utilizados. - Estudio de la utilización de nueva instrumentación basada en la espectrometría de masas de trampa de iones y en tándem (MS/MS) para alcanzar la sensibilidad y selectividad requerida por los nuevos estánderes impuestos por las organizaciones internacionales del área de la salud, en particular en el deporte.

Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein hormone, the molecule comprises a single polypeptide chain of 165 aminoacids with two disulfide bonds, 1 O-linked (Ser-126), and 3 N-linked (Asn-24, 38, 83) glycans representing about 40 % of the total mass (30 kDa). It is secreted primarily by adult kidneys in response to tissue hypoxia and it is involved in the maturation and ultimately regulation of the level of red blood cells. The recombinant analogue (rhEPO), available since 1989 has found widespread use in the treatment of different diseases. Besides, rhEPO is illicitly used by athletes to boost the delivery of oxygen to the tissue and enhance performance in endurance sports. Current tests to differentiate between endogenous EPO and its recombinant analogues are based on differences in their isoelectric focussing (IEF) profiles and on differences in their molecular weight (SDS-PAGE). In this study, different methods to facilitate the detection of recombinant EPOs and analogues in antidoping control have been developed: A plasmatic EPO immunopurification method; a new screening method based on immunoaffinity techniques to detect the abuse of recombinant erythropietins in urine; and a liquid chromatography-mass spectrometry method that allows to detect the unambiguous differing structure between exogenous EPOs and endogenous, the N-glycolyl-neuraminic acid. / La eritropoetina (EPO) és una hormona glicoproteica formada per una cadena peptídica de 165 aminoàcids que conté dos ponts disulfur, un O-glicà (Ser-126) i tres N-glicans (Asn-24, 38, 83) que representen al voltant d’un 40% de la seva massa molar (~ 30kDa). Es produeix principalment en el ronyó, en resposta a la reducció d’oxigen en el teixits, i estimula l’eritropoesi a la medul·la òssia. La EPO recombinant (rhEPO) s’administra com a fàrmac pel tractament de diferents malalties. També s’ha observat la seva utilització en esportistes amb l’objectiu d’augmentar el nivells d’oxigen als teixits i així incrementar el seu rendiment. Els mètodes que s’utilitzen per diferenciar la EPO orinaria endògena de l’exògena estan basats en diferencies dels seus perfils isoelectroforètics (IEF) o en els seus pesos moleculars (SDS-PAGE). El problema d’aquests mètodes és que són llargs, costosos i només poden utilitzar la orina com a matriu biològica. En aquest estudi, s’ha dut a terme el desenvolupament dels següents mètodes que faciliten la detecció d’EPOs recombinants i anàlegs en el control antidopatge: Un mètode d’immunopurificació d’EPO en plasma; un mètode d’screening ràpid basat en tècniques d’immunoafinitat per detectar l’abús d’ eritropoietines recombinants en orina; i un mètode de cromatografia liquida acoblada a espectrometria de massa que permet detectar una clara diferencia estructural entre la majoria de les EPOs exògenes i la endògena, el N-glicolil-neuraminic àcid.

El di(2-etilhexil) ftalat (DEHP) és un plastificant que s’afegeix als productes de clorur de polivinil (PVC) per a dotar-los de més flexibilitat. El material mèdic fet de PVC, i en particular els dispositius i bosses que s’utilitzen en les transfusions de sang, conté el DEHP com additiu. Així, el receptor d’una transfusió està altament exposat a aquest compost. L’objectiu de la tesi va ser estudiar els metabòlits del DEHP en orina com a possibles marcadors de la pràctica d’una transfusió de sang en l’esport. Es va desenvolupar i validar un mètode d’anàlisi per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem per a la quantificació dels principals metabòlits del DEHP en orina humana: mono-(2-etilhexil) ftalat (MEHP), mono-(2-etil-5-hidroxihexil) ftalat (MEHHP), mono-(2-etil-5-oxohexil) ftalat (MEOHP), mono-(2-carboximetilhexil) ftalat (2cx-MMHP) i mono-(2-etil-5-carboxipentil) ftalat (5cx-MEPP). El mètode es va aplicar a mostres procedents de voluntaris sans (grup control), de pacients hospitalitzats que havien rebut una transfusió de sang i de pacients hospitalitzats sotmesos a tractaments mèdics amb materials de PVC i no a transfusions. Es van obtenir diferències significatives en les concentracions dels tres metabòlits estudiats (MEHP, MEHHP, MEOHP) entre les mostres dels pacients transfosos respecte els altres dos grups de població. El mètode també es va aplicar a mostres d’orina de vint-i-cinc voluntaris sans que s’havien sotmès a un procediment d’autotransfusió. Els resultats van indicar concentracions elevades dels cinc metabòlits del DEHP en orina fins a les 48 hores després d’haver rebut la sang. Finalment, es van determinar les concentracions dels cinc metabòlits de DEHP en una població d’esportistes i es van calcular límits de referència que permetessin sospitar d’una transfusió. Així doncs, els resultats indiquen que la mesura dels metabòlits de DEHP en orina pot ser usada com una eina pel cribatge de l’ús de transfusions en l’esport. / The plasticizer di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) is used in polyvinyl chloride products (PVC) to increase its flexibility. Medical devices made of PVC, especially blood bags used in blood transfusions, contain DEHP as additive. Therefore, subjects submitted to blood transfusion are widely exposed to this compound. The aim of the project was to evaluate DEHP metabolites in urine as possible markers of the use of a blood transfusion in sports. An analytical method was developed and validated to quantify the main DEHP metabolites mono-(2-ethylhexyl)phthalate (MEHP), mono-(2-ethyl-5-hydroxyhexyl)phthalate (MEHHP), mono-(2-ethyl-5-oxohexyl)phthalate (MEOHP), mono-(2-carboxymethylhexyl)phthalate (2cx-MMHP) and mono-(2-ethyl-5-carboxypentyl)phthalate (5cx-MEPP), in human urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The methodology was applied to samples belonging to healthy volunteers (control group), hospitalized patients subjected to blood transfusions and hospitalized patients subjected to medical treatments involving plastic material different to blood transfusions. Significant differences were obtained in the concentrations of the three metabolites studied (MEHP, MEHHP, MEOHP) between transfused patients samples’ and the other two population groups. The method was also applied to urine samples from twenty-five healthy volunteers who were subjected to an autologous blood transfusion. The results indicated high concentrations of the five DEHP metabolites in urine up to 48 hours after the blood transfusion. Finally, the concentration of the five DEHP metabolites were evaluated in a sportsmen population and reference limits to allow suspicion of blood transfusion were calculated. Thus, the results indicate that the DEHP metabolites could be used as markers of blood transfusions in sports.