L’infection des cellules cibles par le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1(VIH-1) suit une succession d’étapes finement régulées par de nombreux facteurs cellulaires et viraux. Mon travail de thèse a consisté à étudier certains aspects de cette régulation, en particulier la protéine virale Nef et son impact sur l’infectivité des virus, mais aussi la susceptibilité des cellules cibles à l’infection. Tout d’abord, nous nous sommes intéressés aux mécanismes selon lesquels Nef augmente l’infectivité virale. Pour cela, nous avons identifié les différences entre le protéome des virus sauvages et des virus dépourvus du gène nef (Δnef) grâce à deux méthodes protéomiques, laDIGE et l’iTRAQ. Nous avons pu mettre en évidence que les protéines Ezrine et EHD4 sont impliquées dans des processus qui rendent les virus sauvages plus infectieux que les virusΔnef. L’augmentation de l’infectivité virale par Nef dépend des glycoprotéines d’enveloppes avec lesquelles les particules virales sont pseudotypées. Dans le but d’identifier les bases moléculaires de ce mécanisme, nous avons généré des constructions chimériques entre des glycoprotéines d’enveloppes qui permettent (enveloppes permissives) ou ne permettent pas(enveloppes non permissives) au phénotype Nef de se manifester. Cette approche a permis démontrer que le domaine cytoplasmique de la protéine d’enveloppe est un des déterminants qui dictent l’acquisition du phénotype Nef. Mon travail s’est aussi axé sur le mécanisme de co-infection cellulaire par le VIH-1.Après co-incubation des cellules avec des virus VIH rapporteur GFP et DsRed, nos résultats ont montré que les événements de co-infection sont plus fréquents qu’attendus dans le cas d’une infection stochastique. Nous montrons que ce biais qui semble favoriser la co-infection et qui suggère l’hétérogénéité de la population cible en terme de susceptibilité à l’infection par le VIH-1 provient en fait d’une sous-estimation des fréquences de cellules infectées en raison d’un phénomène de latence post-intégrative. Ainsi, mes études ont permis de mieux comprendre les mécanismes permettant à Nef d’augmenter l’infectivité des particules virales ouvrant de nouvelles perspectives à ce sujet, de même qu’elles ont permis de mettre en évidence que la co-infection était bien un processus aléatoire mais qui permettait de révéler des cellules arborant un provirus silencieux. / Pas de résumé en anglais

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L’infection par le VIH-1 est un problème majeur de la santé publique qui touche plus de 35 millions de personnes à l’échelle mondiale. La réplication du VIH-1 est déclenchée par l’activation du promoteur LTR, qui contient deux sites de liaison pour le facteur de transcription NF-κB. Ces sites de liaison sont hautement conservés dans le génome du VIH-1, illustrant ainsi l’importance de NF-κB dans l’activité transcriptionelle des gènes du VIH-1 et la production de nouvelles particules virales. La withaferin A (WA) est une substance bioactive extraite de la plante Withania somnifera, qui possède des propriétés pharmacologiques non négligeables dans la régulation de la réponse immunitaire. Des études récentes ont démontré que le potentiel anti-inflammatoire de la WA est dû principalement à l’inhibition de la voie de NF-κB. Le but de ce projet est de déterminer l’effet de la WA sur la réplication du VIH-1 dans les cellules T, qui sont les cibles principales du virus. Des essais de transfections transitoires de cellules T Jurkat E6.1 avec des plasmides contenant le promoteur du VIH-1 ayant différentes constructions de NF-κB, ont démontré que la WA peut réduire l’activité du promoteur d’une manière dépendante de NF-κB. Quant à la production de particules virales, des essais d’infection avec des virus pseudotypés démontrent que la WA diminue la production virale jusqu’à 90% dans des cellules T stimulées avec PMA/PHA et TNF-α, tandis que les mutants ayant des sites de liaison défective pour NF-κB ne sont pas affectés. Des essais de retardement sur gel ainsi que des immunobuvardages de type Western ont montré que la WA altère l’habilité de NF-κB à transloquer dans le noyau, ce qui se traduit par l’inhibition de la synthèse de l’IκB-α, protéine inhibitrice de NF-κB, phénomène sous contrôle étroite de ce facteur de transcription. Ces résultats suggèrent que la WA pourrait permettre une diminution de la réplication virale d’une manière dépendante de NF-κB et ainsi empêcher la propagation du virus aux cellules T chez les individus infectés.

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Les glycoprotéines d'enveloppe (Env) du VIH-1 se caractérisent par leur long domaine cytoplasmique (DC) qui joue un rôle essentiel dans la morphogenèse et l’infectivité virales. La multiplication virale in vitro et in vivo dépend ainsi étroitement de l’intégrité de ce domaine. Nous avons cependant identifié un patient infecté par un VIH-1 présentant des Env avec un DC tronqué de 20 acides aminés. Cette anomalie structurale aurait dû aboutir à la production de virions dont la capacité infectieuse était fortement diminuée. Mon travail de thèse a donc consisté à évaluer les conséquences fonctionnelles d’une telle troncation et à explorer les mécanismes moléculaires permettant au virus présentant cette anomalie de se multiplier efficacement in vivo. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont abouti à l’identification de mécanismes de compensation des capacités de multiplication de ce virus portant des Env tronquées dans leur DC impliquant des mutations dans la protéine de matrice. En conclusion, toutes ces données ont permis d’apporter des éléments de compréhension nouveaux quant à l’assemblage du VIH-1 et son fort potentiel d’évolution in vivo. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) typically encodes envelope glycoprotein transmembrane subunits with long cytoplasmic tails (CTs) involved in viral infectivity and morphogenesis. The integrity of the gp41 CT thus seems to be essential for viral replication in vitro and in vivo. However, we report here the emergence and dominance in vivo of a primary HIV-1 variant carrying a natural 20-amino-acid truncation of the gp41 CT. Such a deletion would therefore be expected to impair viral replication. The aims of this study were thus to assess the functional consequences of the gp41 truncation and to identify the molecular mechanisms by which a primary HIV-1 harboring such a deletion in the gp41 CT maintained its ability to replicate efficiently in vivo. Our findings reveal that replication capacity of a primary HIV-1 carrying truncated CT could be rescued by compensatory mechanisms involving mutations in the matrix protein. In conclusion, our findings provide new insignt into HIV-1 assembly and evolution potential in vivo.

En organismos eucariontes, el inicio de la síntesis de proteínas comienza con el reclutamiento de la subunidad 40S del ribosoma al mRNA. Sin embargo, dependiendo de cómo se efectúe este reclutamiento, el inicio de la traducción puede ser dependiente o independiente de la estructura 5’cap. El mecanismo cap-dependiente se basa en el reconocimiento de la estructura cap (7mGpppN), presente en el extremo 5’ de todos los mRNA, por el complejo de iniciación eIF4F. El complejo eIF4F está constituido por tres proteínas: eIF4E, la proteína de unión al cap; eIF4A, una RNA helicasa ATP dependiente y la proteína de andamiaje, eIF4G. La subunidad 40S ribosomal es reclutada al mRNA como parte de un complejo formado por eIF2-GTP/Met-tRNAi, eIF1A y eIF3. El factor de iniciación eIF4G cumple la función de proteína puente entre la subunidad 40S del ribosoma (vía eIF3) y el mRNA (vía eIF4E). Luego del reclutamiento de la subunidad 40S ribosomal en la vecindad de la estructura cap, el complejo de iniciación migra en dirección 5’ a 3’ hasta encontrar un codón de inicio de la síntesis de proteína, AUG, en un contexto óptimo. El estudio del mecanismo de traducción de los mRNA de la familia Picornaviridae, los cuales carecen de estructura 5’cap, permitió la caracterización de un mecanismo alternativo de iniciación de la síntesis de proteína. El mecanismo de inicio de la traducción en los mRNA de Picornavirus está mediado por regiones de RNA altamente estructuradas que son capaces de reclutar la subunidad 40S ribosomal de manera independiente a los extremos del mRNA. Estas estructuras de RNA se denominaron sitios internos de entrada de ribosomas, IRES (por sus siglas en inglés). Desde su caracterización inicial en los mRNA de la familia Picornaviridae, la existencia de IRES se ha extendido a otras familias virales incluyendo a la familia Retroviridae. El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) pertenece al género Lentivirus de la familia Retroviridae. El genoma de VIH-1 está constituido por dos hebras idénticas de un RNA de cadena simple de polaridad positiva, unidas entre si por enlaces no covalentes. El mRNA de VIH-1 posee cap, 3’poli(A) y dos elementos IRES, el primero, IRES-1, en su región 5’ no traducida (5’UTR) y el segundo en su región codificante para la proteína viral Gag (IRES-40K). Este trabajo se focalizó en el estudio de la función del IRES-1 de VIH-1 partiendo del postulado que a diferencia de otros mRNAs virales que poseen un elemento IRES, y sólo pueden iniciar la traducción de manera IRES dependiente, el mRNA de VIH-1 posee la capacidad de iniciar la síntesis de proteína de manera dual, es decir, de manera dependiente y/o independiente de la estructura cap. Este trabajo establece que el mRNA completo de VIH-1 puede iniciar su traducción utilizando un mecanismo tanto dependiente como independiente de su estructura 5’cap. En este contexto se establece que el mRNA de VIH-1 comparte características funcionales descritas sólo para mRNA celulares, diferenciándose de manera importante de los otros mRNA virales que poseen un elemento IRES que inician su traducción exclusivamente de manera dependiente de IRES.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias, mención Microbiología. / El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) es un gran problema de salud a nivel mundial. Durante años se ha estudiado su ciclo replicativo con el objeto de generar estrategias que permitan inhibir su multiplicación. Se ha descrito que el virus genera tres clases de transcritos, de 2-, 4- y 9-kb, los cuales son producidos mediante corte y empalme alternativo. El transcrito de 9-kb, o ARN mensajero completo (ARNmc), es traducido por la maquinaria celular para producir las poliproteínas estructurales Gag y Gag-Pol. El ARNmc ha sido foco de especial interés debido a los mecanismos no convencionales que utiliza para asegurar su expresión, entre los cuales destacan su exportación nuclear y traducción. Mientras la exportación nuclear está regulada por la proteína viral Rev y la carioferina celular CRM1, se ha descrito que el ARNmc puede ser traducido por mecanismos que son dependientes e independientes de la estructura cap presente en el extremo 5´. Este proyecto se enfocó en estudiar el rol de dos componentes del complejo nuclear de unión a cap (CBP80 y CTIF) en la síntesis de la proteína estructural Gag a partir del ARNmc de VIH-1. En este trabajo, mostramos que CBP80 estimula la síntesis de Gag mediante la estimulación de la acumulación del ARNmc en el citoplasma y un aumento de la eficiencia de la traducción, esto en un mecanismo que es dependiente de Rev. También observamos que el factor CTIF, a diferencia de CBP80, inhibe la síntesis de Gag, principalmente impidiendo la traducción del ARNmc. Nuestros resultados señalan que CTIF, a través de su dominio Nterminal, impide la asociación entre CBP80 y Rev, que sería relevante para la traducción del ARNmc e induce la acumulación de esta proteína viral en el citoplasma celular. Finalmente, observamos que el efecto inhibitorio producido por CTIF es conservado en VIH-2, pero no en el virus de la leucemia murina (MLV). / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a major health problem worldwide. The replication cycle of the virus has been studied for several years with the aim of generate strategies to interfere with its multiplication. It has been described that the virus produces three different classes of transcripts of 2-, 4-, and 9-kb in size, which are generated by alternative splicing. The 9-kb transcript or full-length unspliced mRNA (usmRNA) is translated to generate the structural polyproteins Gag and Gag-Pol. The usmRNA has been a focus of special interest from many years due to its ability to exploit non-conventional mechanisms of nuclear export and translation to ensure its expression. As such, while nuclear export is regulated by the viral protein Rev and the cellular karyopherin CRM1, it has also been described that the usmRNA is translated by cap-dependent and cap-independent mechanisms. The goal of this project was to study the role of two components of the nuclear cap-binding complex (CBP80 and CTIF) on the synthesis of the structural protein Gag from the usmRNA of HIV-1. In this work, we show that CBP80 stimulates the synthesis of Gag by stimulating the accumulation of the usmRNA in the cytoplasm as well as by an increasing the efficiency of translation, all this in a Rev-dependent mechanism. We also observed that the CBC co-factor CTIF, unlike CBP80, inhibits the synthesis of Gag, mainly preventing the translation of the usmRNA. Our results indicate that CTIF, through its N-terminal domain, prevents the association between CBP80 and Rev, which would be relevant for the translation of the usmRNA. We also observed that CTIF induced the accumulation of Rev in the cellular cytoplasm. Finally, we observed that the inhibitory effect of CTIF is conserved in HIV-2, but not in the murine leukemia virus (MLV).

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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