Les macrophages sont une cible cellulaire du VIH-1, et jouent un rôle important dans la pathogenèse virale. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au rôle des macrophages dans la pathogenèse du VIH-1, mais aussi au cours de la co-infection avec Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose. J'ai tout d'abord participé à une étude mettant en évidence que l'infection par le VIH-1 reprogramme la migration des macrophages, favorisant notamment le mode migratoire protéolytique. Cet effet est médié par l'interaction de la protéine virale Nef avec les protéines de l'hôte Hck et WASP, ce qui conduit à une modification de l'organisation et de la fonction des podosomes, structures impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire et la migration dépendante des protéases. La meilleure capacité à migrer des macrophages infectés par le VIH-1 in vitro se traduit in vivo par une augmentation du recrutement des macrophages dans différents tissus de souris transgéniques qui expriment la protéine Nef. Ces travaux ont ainsi révélé un nouveau mécanisme par lequel le VIH-1 dissémine dans les tissus, via l'action de Nef dans les macrophages. L'association fréquente du VIH-1 avec Mtb complique le problème de santé publique posé par l'infection virale. En effet, Mtb aggrave la pathogenèse du VIH-1 chez les patients co-infectés. L'étude des mécanismes impliqués et le rôle des macrophages dans ce phénomène constituent les objectifs principaux de ma thèse. J'ai révélé que les macrophages infectés par Mtb génèrent un microenvironnement qui active les macrophages voisins vers un programme de polarisation anti-inflammatoire dit M(IL-10). J'ai mis en évidence que ces macrophages M(IL-10) sont particulièrement efficaces pour la production de VIH-1. J'ai démontré que le microenvironnement associé à la tuberculose entraîne la formation de nanotubes entre les macrophages, grâce à l'activation de la signalisation cellulaire médiée par l'axe IL-10/STAT3. Ces nanotubes, qui favorisent le transfert du virus d'un macrophage à un autre, sont à l'origine de la spectaculaire production de VIH-1 par les macrophages. Nous avons également constaté que ces cellules M(IL-10) s'accumulent dans la circulation sanguine des patients co-infectés ainsi que dans les poumons de primates non-humains co-infectés. Dans l'ensemble, mes travaux identifient les nanotubes comme des acteurs clés dans l'aggravation de la pathogenèse du VIH-1 lors de la co-infection avec Mtb. Ainsi, les nanotubes et la voie de signalisation IL-10/STAT3 pourraient représenter des cibles pour développer de nouvelles thérapies de lutte contre la comorbidité VIH/Mtb. Les résultats obtenus lors de ma thèse contribuent à une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la pathogenèse et la dissémination du VIH-1 dans un contexte de mono-infection, ou lors d'une co-infection avec Mtb. / Macrophages are both crucial host effector cells for HIV-1 and important leukocytes involved in viral pathogenesis. For my doctoral thesis, I was interested in further characterizing the role of macrophages in HIV-1 pathogenesis, and during co-infection with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the etiological agent for tuberculosis (TB). I first participated in a study that provided evidence that HIV-1 infection reprograms the migration of macrophages, particularly by triggering the protease-dependent migration mode. This effect was mediated by the interaction of the viral protein Nef with the host proteins Hck and WASP, which leads to modification in the organization and proteolytic activity of podosomes, important structures for protease-dependent migration. The higher migration capacity of HIV-1-infected macrophages translated in vivo by an increase in the recruitment of macrophages in several tissues of Nef-transgenic mice. This work revealed a novel mechanistic understanding of how HIV-1 infection drives macrophages into tissues, contributing to viral dissemination and possibly creating a hidden cellular reservoir of virus. Worsening this public health issue posed by the HIV-1 epidemic is the frequent association of the virus with Mtb. Indeed, Mtb aggravates HIV-1 pathogenesis in co-infected individuals. Yet, the mechanisms involved in this process are still poorly understood, including the contribution of macrophages. To investigate how Mtb exacerbates the HIV-1 infection in human macrophages was the main focus of my thesis. First, I revealed that Mtb-infected macrophages generate a microenvironment that drives bystander macrophages towards phenotypic and functional features of the so-called M(IL-10) anti-inflammatory program. I found that these M(IL-10) macrophages are highly efficient for HIV-1 production. I demonstrated that the TB-associated microenvironment induces the formation of macrophage-to-macrophage connecting tunneling nanotubes (TNTs) through the IL- 10/STAT3 axis, a phenomenon that is responsible for the dramatic increase of HIV-1 production in M(IL-10) macrophages. Moreover, I provided evidence that M(IL-10) cells are expanded in the peripheral blood of co-infected patients and accumulate in the lungs of co-infected non-human primates. Altogether, this central part of my PhD thesis sheds light to TNTs as key players in the aggravation of HIV-1 pathogenesis in human macrophages during co-infection with Mtb. Thus, this cellular mechanism (together with the IL- 10/STAT3 axis) could represent an unexpected target to develop novel therapeutics against AIDS/TB co-morbidity. Collectively, the results obtained during my thesis contribute to a better understanding of the role of macrophages during HIV-1 pathogenesis and their ability to disseminate the virus in a mono-infection context, or during co-infection with Mtb.

Les macrophages et les lymphocytes T sont les deux cibles cellulaires du VIH-1 in vivo. Les macrophages sont des cellules à vie longue, résistantes à l'effet cytopathique du VIH-1. Les macrophages sont présents dans de nombreux tissus où ils semblent être relativement résistants aux médicaments antiviraux. Le cycle viral se déroule plus lentement dans les macrophages que dans les lymphocytes T et abouti à l’accumulation de stocks intracellulaires de virions. L'infection des macrophages est considérée comme un élément important pour le développement de la pathogenèse associée à l’infection par le VIH-1 et pour la mise en place d'un réservoir viral. Dans les macrophages les particules virales s’assemblent dans des compartiments intracellulaires méconnus appelés Virus Containing Compartments (VCCs). Pendant mon doctorat, j'ai caractérisé les phases tardives du cycle viral du VIH-1 dans les macrophages infectés. J'ai montré que le scavenger receptor CD36 est un composant des VCCs nécessaire à la réplication du VIH-1 dans les macrophages. Des compartiments avec des caractéristiques similaires à celles des VCCs et contenants CD36+ sont présents à la fois dans les macrophages infectés et non-infectés. En outre, j'ai montré que le VIH-1 pouvait directement bourgeonner dans des compartiments préexistants CD36+. L'exposition des macrophages infectés par le VIH-1 à des anticorps spécifiques de CD36 provoque l’accumulation intracellulaire de particules virales au niveau des VCCs. L’effet antiviral de l’anticorps anti-CD36 apparait très spécifique, puissant, rapide et durable. De façon intéressante, les anticorps anti-CD36 provoquent une diminution frappante à la fois de la libération virale et de la transmission du VIH à partir des macrophages infectés aux cellules T. Par ailleurs, étant donné que l’incorporation de la protéine Env dans les particules virales est essentielle pour l'infectivité du virus, je me suis intéressé au transport de la protéine Env dans les macrophages primaires. Mes résultats suggèrent que l'interaction entre Gag et la queue cytoplasmique de la Gp41 est importante pour le transport de la protéine Env vers les VCCs et pour la formation de virus infectieux. Ce travail introduit de nouveaux concepts sur l’assemblage du VIH-1 dans les macrophages et suggère un rôle important pour les VCCs dans le cycle de vie du VIH. Nos résultats pourraient être d'intérêt pour le développement de nouvelles stratégies antivirales / Macrophages and T cells are the two cellular targets of HIV-1 in vivo. Macrophages are long-lived cells resistant to the cytopathic effect of HIV-1, and are present in many tissues where they appear to be relatively resistant to antiviral drugs. This is in sharp contrast to HIV-1-infected T cells that rapidly produce new virions before dying. Infection of macrophages is considered an important feature for the development of HIV-1-associated pathogenesis and for the establishment of a viral reservoir. In macrophages, the virus is assembled and accumulated into poorly characterized intracellular compartments called Virus-Containing Compartments (VCCs). During my PhD, I characterized the late phase of the HIV-1 life cycle in infected macrophages. I describe the Scavenger Receptor CD36 as a new component of the VCC required for HIV-1 replication in macrophages. VCC-like CD36+ compartments were observed in both HIV-1-infected and uninfected macrophages. Furthermore, I show that, in some cases, HIV-1 could directly bud into pre-existing CD36+ compartments. Exposure of HIV-1-infected macrophages to CD36-specific antibodies caused the intracellular retention of viral particles within VCCs. The effect of the anti-CD36 antibody was highly specific, potent, rapid and long lasting and, caused a striking reduction both of viral release and of HIV-transmission from macrophages to T cells. In addition, since the incorporation of the Envelope protein (Env) into viral particles is crucial for virus infectivity, I investigated the Env trafficking in primary macrophages. My results suggest that the interaction between Gag and the Gp41 cytoplasmic tail is critical for Env localization to the VCC and for the formation of infectious virions. This work introduces new concepts in the field of HIV-1 assembly in macrophages and suggests an important role for VCC in the HIV life cycle. Our results also unravel novel targets for the development of new antiviral strategies

Plus de 34 millions de personnes dans le monde vivent avec le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Cette pandémie est partiellement contrôlée par l’utilisation de combinaison d’agents antirétroviraux spécifiques. Cependant l’émergence de nouvelles souches virales multi-résistantes nécessite le développement de nouvelles stratégies antirétrovirales. Notre laboratoire porte une attention particulière à la compréhension des évènements cellulaires et viraux impliqués dans les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1. Récemment, nous avons révélé l’existence d’une nouvelle voie de signalisation cellulaire, impliquant un canal membranaire (la Pannexine-1), un signal de danger (l’ATP extracellulaire) et un récepteur purinergique (P2Y2) participant à l’entrée du VIH-1 dans ses cellules cibles. Etant donnée que ces trois évènements cellulaires sont également des acteurs de la réponse immunologique, nous avons décidé de poursuivre l’étude du rôle des protéines de la réponse immunologique innée dans les étapes précoces d’infection par le VIH-1.Au cours de mes travaux de thèse, nous avons révélé une interaction entre le récepteur purinergique P2Y2 et la protéine de l’inflammasome NLRP3. Dans un premier temps, nous avons démontré que la migration cellulaire dépendante du récepteur purinergique P2Y2 est réprimée pendant l’activation de l’inflammasome NLRP3. A l’inverse, nous avons également observé que la polarisation des macrophages, la sécrétion de l’interleukine-1β et la pyroptose déclenchées par l’activation de NLRP3 sont sous le contrôle de l’autophagie induite par l’activation du récepteur purinergique P2Y2. Ces résultats suggèrent que l’interaction entre NLRP3 et P2Y2 constitue un nouveau point de contrôle immunologique qui régule les fonctions des macrophages. A la suite de ces travaux, nous avons analysé le rôle de ce point de contrôle immunologique lors de l’infection par le VIH-1 et avons démontré que l’activation de l’inflammasome NLRP3 empêche l’activation de la voie de signalisation purinergique qui implique l’ATP, la pannexine-1 et le récepteur P2Y2, et qui permet l’entrée du VIH-1 dans ses cellules cibles. Nos travaux de recherche mettent ainsi en lumière la capacité de l’inflammasome NLRP3 à représenter un nouveau facteur de restriction inductible du VIH-1. L’ensemble de mes travaux recherche souligne l’existence au niveau des macrophages d’un nouveau point de contrôle du système immunitaire impliquant la protéine NLRP3 et le récepteur P2Y2 et qui peut être moduler afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de lutter contre l’émergence de virus résistants aux traitements rétroviraux classiques. / In 3 decades infection with the virus of the human immunodeficiency of type 1 (HIV-1) caused over than 34 million deaths and the surge of new multiresistant virus strains require the development of novel antiretroviral strategies.Our laboratories revealed a new signaling pathway involving in the early step of HIV-1 infection, involving a hemichannel (Pannexin-1), a common danger signal (extracellular ATP) and a purinergic receptor (P2Y2). These three cellular events are also players in the immune response; we decided to continue the study of proteins involved in the innate immune response during the early stages of infection by HIV -1.Here we demonstrated during this work a new interaction between the purinergic receptor P2Y2 and protein of the inflammasome NLRP3. We demonstrate that P2Y2-stimulated migration of macrophages is inhibited by NLRP3 inflammasome activation. Conversely, NLRP3-dependent macrophage polarization, interleukin-1 β secretion and pyroptosis are under the control of P2Y2-induced autophagy.Finally, the results suggest that the interaction between NLRP3 and P2Y2 is a new immunological checkpoint that regulates macrophage functions. Following this work, we analyzed the role of this immunological control during infection by HIV -1 and have demonstrated that activation of the inflammasome NLRP3 prevents the activation of the purinergic signaling channel involving ATP, pannexin -1 and the P2Y2 receptor, and which allows the entry of HIV -1 in its target cells. Our research and bring to light the capacity of the NLRP3 inflammasome to represent a new inducible restriction factor of HIV-1.All of this research work highlights the existence in macrophages of a new immune system checkpoint involving NLRP3 protein and P2Y2 receptor and can be modulated in order to develop new therapeutic approaches to fight against the emergence of viruses resistant to conventional retroviral treatments.

L’intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé qui catalyse l’insertion stable du génome viral dans celui de la celluleinfectée. D’autre part, l’IN participe également à de nombreuses étapes du cycle viral telles que la transcriptioninverse ou la maturation virale. La compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de l’intégrationcellulaire au cours de l’infection est un enjeu important. L’IN fait partie du complexe de préintégration composé defacteurs cellulaires et viraux. La dynamique des interactions au sein de ce complexe régule les activités catalytiquesmais également non catalytiques de l’IN. C’est dans ce contexte de recherche de nouveaux cofacteurs de l’intégraseque nous avons identifié une interaction entre l’IN et la protéine Kinase GCN2.Mon travail de thèse s’est orienté sur trois questions autour de l’étude du rôle de cette interaction IN/GCN2.- Dans un premier temps, le rôle de la protéine kinase cellulaire GCN2 au cours du cycle viral a été étudié. Nousavons pu montrer que l’infection par le VIH-1 provoque un stress activant GCN2. Cette activation aboutit à uneinhibition de la traduction dès les premières heures de l’infection.- GCN2 est capable de phosphoryler l’IN du VIH-1 sur deux positions : les sérines en position 24 et 255. L’étude durôle de la phosphorylation de l’IN par GCN2 a permis de montrer que l’absence de phosphorylation de l’IN entraîneune stimulation de l’infection. GCN2 via la phosphorylation de l’IN a donc un effet restrictif sur l’infection par le VIH-1.- L’étude du domaine d’interaction entre l’IN et GCN2 a permis d’identifier un résidu essentiel de l’IN, l’acideglutamique en position 85 (E85). En effet, la mutation E85A de l’IN entraîne la production de virus non infectieux,suite à un défaut de maturation / HIV-1 integrase (IN) catalyzes the integration of the viral DNA into the cellular genome. Besides, IN is also involved inother steps of the viral life cycle like the reverse transcription or the viral maturation. Our group is interested in themechanisms involved in the regulation of cellular integration during the infection. IN is part of a pre-integrationcomplex composed of cellular and viral proteins. The dynamic of these interactions regulates IN activities but also noncatalytic activities such as nuclear import and tethering of the complex to the integration site. During theidentification of news partners of IN, an interaction between IN and the kinase GCN2 was characterizedMy PhD project is composed of 3 topics:- The role of the cellular kinase GCN2 was studied during the viral cycle. We showed that GCN2 is activated uponHIV-1 infection. This activation leads to a general decrease of cellular translation during the first hours of infection.-GCN2 is able to phosphorylate IN on two positions: the serines in position 24 and 255. The absence of INphosphorylation causes a stimulation of HIV-1 infection. We demonstrate that GCN2 affects the viral cycle via thephosphorylation of IN.- Binding domain analysis between IN and GCN2 led to the identification of a critical residue of IN, the glutamicacid in position 85 (E85). Mutations E85A of IN impair the viral production by inhibiting the viral maturation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'une des principales barrières à la prise en charge optimale des patients sous traitement antirétroviral est l'accès limité aux tests de charge virale (CV) et de génotypage particulièrement en milieu décentralisé. Ces tests ne sont généralement disponibles qu'au niveau des structures sanitaires centrales de grandes villes et le plasma en est l'échantillon de référence. Or, son transfert des régions périphériques vers les laboratoires de références est difficile, voire impossible. Pour rapprocher les patients du laboratoire, nous avons démontré la possibilité d'assurer un suivi virologique complet (CV et génotypage) à partir des DBS collectés et acheminés dans des conditions de terrain. Nous avons également pour la première fois, documenté la réponse virologique au traitement antirétroviral et la diversité génétique du VIH-1 chez des patients adultes suivis en milieux décentralisés au Sénégal, au Mali et en Guinée Conakry. Globalement, malgré les défauts d'observance au traitement souligné, les résultats de nos travaux ne montrent pas de différences significatives dans la survenue de l'échec virologique entre patients suivis dans les structures sanitaires centrales et périphériques, ceci quelque soit le pays considéré. Au Sénégal, chez les enfants nés de mères séropositives, la résistance vis à vis des INNTI était plus prépondérante, probablement du fait de l'utilisation systématique de la Névirapine durant la PTME. Par ailleurs, aucune mutation de résistance aux inhibiteurs d'intégrase n'a été observée malgré des taux de résistance élevés chez des patients en échec de première et deuxième ligne de traitement. Nos travaux confirment également une grande diversité génétique des sous-types viraux avec cependant la prédominance du CRF02_AG dans la sous région Ouest Africaine. Ces travaux de thèse mettent en évidence la faisabilité et la pertinence du DBS comme support pour le suivi virologique des patients en milieux décentralisés. Son utilisation a permis de montrer d'autre part des taux d'échecs virologiques élevés indiquant la nécessité de renforcer l'adhérence au traitement. Enfin, nos résultats soulignent l'utilité de prendre davantage en considération les profils de résistance pour initier un traitement de relais. / One of the major barriers to the optimal care of patients undergoing antiretroviral therapy is the limited access to viral load (VL) and genotyping tests, especially in remote areas. These technologies are usually available only at central health facilities in larger cities and plasma is the reference sample. However, plasma or whole blood samples shipment from remote areas to reference lab faces several constraints or even impossible. In order to bring closer patients to reference lab, we have demonstrated the ability of DBS (Dried Blood Spots) collected and shipped in field conditions to provide complete virological monitoring (VL and genotyping). We also documented for the first time, virological outcome of ART and HIV-1 genetic diversity in adult patients followed up in decentralized settings in Senegal, Mali and Guinea Conakry. Overall, despite the low treatment adherence noted sometimes, our findings show no significant differences in the occurrence of virological failure among patients followed up in the central and peripheral health facilities, whatever the country. In Senegal, no integrase inhibitors associated DRM has been found despite the high rate of resistance in patients failing first and second-line treatment. Furthermore, among children born to HIV infected mothers, NNRTI-associated drug resistant mutations (DRM) were more predominant, probably because of systematic use of Nevirapine in MTCT. Our studies also confirm the high genetic diversity of viral subtypes, with the dominance of CRF02_AG in West Africa. This work presented here highlights the feasibility and relevance of DBS as support for the virological monitoring of patients in decentralized settings in West Africa. Furthermore, its use showed high rate of virological failure indicating the need to reinforce adherence to treatment. Finally, our results highlight the utility to considering carefully drug resistance patterns before switching to another ART regimen.

Le lymphome de Burkitt (BL) est due dans 80% des cas à une translocation chromosomique t(8;14)(q24;q32). Cette translocation marque l’évènement initial de la transformation maligne d’une cellule B normale, par délocalisation de l’oncogène CMYC à proximité du locus du gène codant pour la chaîne lourde d’immunoglobuline IGH par le mécanisme de réparation de l’ADN NHEJ durant l’hypermutation somatique (SMH). La probabilité de cette translocation est inversement proportionnelle à la distance qui sépare les loci portés par les deux chromosomes. La translocation (8;14) (q24;q32) qui apparaît durant les étapes de différentiation des lymphocytes B est encore plus importante chez les patients infectés par le virus Epstein-Barr (EBV) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). L’objectif de notre étude est de déterminer les origines possibles de la translocation t(8;14) (q24;q32)dans les lymphocytes B normaux humains. Nous nous sommes intéressés tout d’abord à la dynamique de la localisation nucléaire des loci IGH et CMYC dans les lymphocytes B activés. Nous avons particulièrement étudié l’impact des virus EBV et VIH-1 sur l’organisation des gènes IGH et CMYC.Nous avons utilisé la technique d’hybridation in situ à fluorescence FISH pour la détection de CMYC (8q24) et IGH (14q32). Dans les lymphocytes B naïfs, CMYC est localisé du côté de la périphérie nucléaire, en revanche IGH est central, les deux loci sont complétement distants dans le noyau.L’activation des lymphocytes B induisait une augmentation de la colocalisation IGH-CMYC. La proximité physique entre les deux loci augmente la probabilité de leur translocation durant la SHM et favorise la t(8;14) (q24;q32) dans les lymphocytes B. Nous avons montré que les virus EBV et VIH-1ont un effet important sur la délocalisation IGH-CMYC dans les lymphocytes B. Nous avons aussi déterminé une molécule virale VIH-1 qui intervenait aussi dans la dérégulation de la localisation nucléaire des gènes IGH et CMYC. Nous avons déterminé deux mécanismes différents et indépendants impliqués dans la dynamique des loci IGH et CMYC : le premier mécanisme intervient dans le processus de développement normal des lymphocytes B, et le deuxième mécanisme dépend des virus ainsi que des molécules virales (particulièrement la Tat-HIV-1). / Eighty percent of Burkitt's lymphomas (BL) cases bear translocation t(8;14)(q24;q32). Thistranslocation is the initial event in malignant transformation of normal B-cell and derives from nonhomologousend joining of the oncogene CMYC to the immunoglobulin heavy chain locus IGH duringSomatic Hypermutation (SHM) of IGH. The probability of this translocation is inversely proportionalto the distance between the loci of involved chromosomes. The translocation t(8;14)(q24;q32) occursduring normal development of B-lymphocytes and more probable in patients infected with Epstein-Barr virus (EBV) and the human immunodeficiency virus (HIV-1).The subject of this study was to determine the possible origin of the translocation t(8;14)(q24;q32) inhuman normal B-lymphocytes. We followed the dynamics of the nuclear localization of IGH andCMYC genes in activated B-lymphocytes. We payed particular attention to the impact of EBV andHIV-1 viruses on dynamics of both IGH and CMYC. We applied Fluorescence in situ hybridization(FISH) for detection of CMYC (8q24) and IGH (14q32). In naïve B-cells CMYC is mainly localized inthe periphery of nucleus, whereas IGH is preferentially localized in the nuclear centre, i.e. these lociare distanced by a radius of cell nucleus. Activated B-lymphocytes displayed dramatic increase ofnumber of cells with colocalized IGH and CMYC. Close physical proximity of CMYC to IGH duringSHM amplifies the probability of occurance of translocation t(8;14)(q24;q32) in human Blymphocytes.Interestingly, we observed even more pronounced impact of EBVand HIV-1onproximity of IGH and CMYC. Finaly, among the molecules of HIV-1 we revealed those which possessthe most regulative role on dynamics of both IGH and CMYC. Our results suggest about twoindependent mechanisms of IGH and CMYC dynamics: the first is appropriate for normal developmentof B-lymphocytes and the second depends on virus and viral molecules, such as transactivator of viraltranscription HIV Tat.

Le 1er transfert de brin, étape cruciale de la transcription inverse impliquant la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC), repose sur l’appariement de la séquence r de l’ADN « strong stop » (ADNss) avec la séquence 3’ R de l’ARN viral (3’UTR) qui forme les tiges-boucles TAR et polyA. La séquence r est supposé former les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Le transfert repose donc probablement sur l’hybridation de molécules structurées. La structure secondaire de l’ADNss n’a jamais été déterminée. L’objectif a été d’identifier les interactions et structures gouvernant l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Les outils de la biologie moléculaire et trois sondes de structure ciblant l’ADN ont été utilisés pour atteindre cet objectif. Nos résultats sont les suivants : 1) l’ADN cTAR nu se replie sous la forme de deux conformations différentes qui sont en équilibre ; 2) la NC peut déplacer l’équilibre vers l’une des conformations et se fixer préférentiellement sur la boucle interne du cTAR ; 3) la NC est exigée pour former un hétéroduplex constitué de l’intégralité de l’ADNss et du 3’ UTR ; 4) l’hybridation ADNss-3’UTR peut être initiée à partir de plusieurs sites dans 0,2 mM MgCl2 ; 5) l’ADNss forme deux conformations en équilibre dans 0,2 mM MgCl2 et principalement une seule dans 2 mM MgCl2 ; 6) dans l’ADNss, la NC se fixe préférentiellement au niveau de la région simple-brin qui relie les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Cette fixation joue probablement un rôle important dans l’hybridation des tiges-boucles ARN et ADN complémentaires. Notre étude permet de mieux comprendre la transcription inverse et la recombinaison qui dépend du transfert de brin interne. / The 1st strand transfer, a crucial step of reverse transcription involving the HIV-1 nucleocapsid protein (NC), relies on base pairing of the r sequence of strong-stop DNA (ssDNA) with the 3’ R sequence of viral RNA (3’ UTR) which forms the TAR and polyA stem-loops. The r sequence can form the cTAR and cpolyA stem-loops. Therefore, the transfer relies probably on annealing of folded molecules. This process is not well known at the molecular and structural level. The tools of molecular biology and three DNA-targeted probes were used to get insights into the annealing process. Our results were the following: 1) in the absence of NC, the cTAR DNA folds into two distinct conformations in equilibrium; 2) NC slightly shifts the equilibrium toward one conformation and binds tightly the internal loop of the cTAR hairpin; 3) NC is required for the formation of heteroduplex of the full-length ssDNA and 3’ UTR; 4) the annealing of ssDNA to 3’ UTR can be initiated from different sites in the presence of 0.2 mM MgCl2; 5) the full-length ssDNA folds into two conformations in equilibrium in 0.2 mM MgCl2 but mainly into one conformation in 2 mM MgCl2 ; 6) NC preferentially binds to the single-stranded region between the cTAR and cpolyA hairpins in ssDNA. This binding site probably plays an important role in the annealing of complementary DNA and RNA hairpins. This study helps us to gain insights into the reverse transcription process and the associated genetic recombination.

Les fonctions catalytiques de l'intégrase (IN) du Virus de l'Immunodéficience humaine (VIH-1) sont strictement nécessaires pour l'intégration du génome viral dans les cellules hôtes. Aujourd'hui, trois inhibiteurs anti-IN appartenant à la famille des dikétoacides sont utilisés en thérapie : le raltegravir, l'elvitegravir et le dolutegravir. Cependant, les patients traités par ces médicaments développent des mutations de résistance. Dans ce travail, nous cherchons à mieux comprendre le mécanisme d'interaction de ces drogues avec l'ADN viral. Ce travail a également contribué à la conception de molécules qui devraient être dotées d'une affinité augmentée pour l'ADN, permettant de surmonter le problème de la résistance virale. La compréhension du mécanisme d'inhibition de IN s'est poursuivie par l'étude de deux anticorps monoclonaux anti-K159 (peptide 147-175 du coeur catalytique de IN), 4C6 et 4F4. Les résultats montrent que les anticorps reconnaissent leurs épitopes dans l'IN. D'autre part, du fait de son implication dans de nombreuses étapes du cycle du VIH-1, nous ciblons la protéine 7 de la nucléocapside (NCp7). Pour ce faire, nous avons étudié la structure de nos systèmes (NCp7 et NCp7-ADN) et nous avons pu déterminer les interactions clés responsables de la structuration, ainsi que des fonctions, de ces systèmes. Dans un second temps, nous avons évalué les interactions de NCp7 avec un inhibiteur éjecteur de zinc (C247) de la famille des thioesters. Enfin, sur le plan méthodologique, nous avons raffiné dans le potentiel SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) la représentation des doublets libres de type sp et sp2 dans les molécules conjuguées. / The catalytic functions of integrase (IN) of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) are strictly necessary for the integration of the viral genome into the host cells. To this day, three anti-IN inhibitors belonging to the diketoacids are used in therapy: raltegravir, elvitegravir and dolutegravir. However, under treatments with these drugs, patients develop resistance mutations. In this work, we seek to better understand the interaction of the three drugs with viral DNA. This work also contributed to the design of novel molecules. These should be endowed with increased DNA binding affinities as a step towards overcoming viral resistance. The understanding of the inhibition mechanism of IN was pursued by the study of two monoclonal antibodies, 4F4 and 4C6, which are directed against sequence 147-175 of the catalytic core of HIV-1 IN, a peptide denoted K159. The results show that the antibodies recognize their epitopes in IN. We also aim to target an HIV-1 nucleocaspid protein NCp7 involved in many stages of the viral cycle. We have thus studied the structure of NCp7 and its viral DNA complex. We were able to determine the interactions responsible for the structuring and thus the functions of these complexes. Then, we evaluated the interactions of NCp7 with an inhibitor of the thioester family, C247, which acts as a zinc ejector. Finally, from the methodological standpoint, we have refined in SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) the representation of the sp2 and sp lone pairs in conjugated molecules.

Depuis quelques décennies, le syndrome d'immunodéficience acquise a causé la mort de millions de personnes. La recherche des dernières années a permis de caractériser l'agent causal, le virus de l'immunodéficience humaine, d'identifier des cibles thérapeutiques ainsi que de développer des drogues permettant de contrôler la réplication de ce virus. Toutefois, nous constatons l'émergence de souches virales résistantes à un ou plusieurs des médicaments disponibles. De plus, bien qu'elle permette de bien contrôler la réplication du virus, la thérapie actuelle ne permet pas son éradication et il n'existe aucun vaccin efficace pour la prévention de l'infection. Le virus persiste ainsi dans certaines cellules infectées, lesquelles formeront un réservoir viral. Les monocytes représentent une population cellulaire favorable à la formation d'un tel réservoir viral. Leur dissémination et leur accumulation dans les ganglions lymphatiques constitueraient une étape critique dans la persistance du virus. Les mécanismes menant à la migration des monocytes vers les ganglions lymphatiques sont actuellement méconnus. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse avaient pour objectif de mieux comprendre les évènements immunologiques et moléculaires contrôlant la migration des monocytes vers les ganglions lymphatiques. Dans un premier temps, nous avons démontré le rôle de la prostaglandine E[indice inférieur 2], une cytokine produite massivement au cours de l'infection, dans le contrôle de l'expression du récepteur de chimiokine CCR7 chez les monocytes. Ce récepteur est responsable de la migration des leucocytes vers les ganglions lymphatiques sous l'action chimiotactique des chimiokines CCL19 et CCL21. Nous avons démontré qu'une exposition des monocytes à la prostaglandine E[indice inférieur 2] entraînait une augmentation de leur migration vers ces chimiokines. Nous avons caractérisé les voies de signalisation intracellulaire activées par la prostaglandine E[indice inférieur 2] menant à l'expression de CCR7 chez les monocytes. Nous avons ainsi établi que la synthèse d'AMPc résultant de l'activation des récepteurs EP[indice inférieur 2] et EP[indice inférieur 4] entraînait l'expression de CCR7 chez les monocytes. Nous avons ensuite démontré l'implication des kinases PKA, ERK et p38 dans ce processus. Dans un second temps, nous avons vérifié l'effet de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine sur l'expression et la fonctionnalité du récepteur CCR7 chez les monocytes exposés à la prostaglandine E[indice inférieur 2]. Notre modèle expérimental démontre que l'exposition des monocytes au virus de l'immunodéficience humaine diminue le niveau de surface ainsi que la fonctionnalité du récepteur CCR7. Toutefois, la prostaglandine E[indice inférieur 2] augmente l'expression de CCR7 à la surface des monocytes exposés au virus, ce qui résulte en une augmentation de la sensibilité des monocytes pour la chimiokine CCL19. Nos résultats suggèrent que lors de la transmission mucosale du virus de l'immunodéficience humaine, l'exposition des monocytes au virus ainsi qu'à la prostaglandine E[indice inférieur 2] pourrait favoriser la dissémination du virus vers les ganglions lymphatiques. Une meilleure compréhension de la pathogenèse du virus ainsi que des mécanismes menant à la dissémination virale pourrait conduire à l'amélioration de l'approche thérapeutique actuelle.