Actuellement, l'infection au virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est considérée comme une infection chronique contrôlable à moyen et long terme. En effet, l'utilisation appropriée de combinaisons d'antirétroviraux ainsi qu'un suivi du développement de la résistance chez le virus peut diminuer la charge virale pendant des décennies et retarder l'apparition du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Cependant, certains de ces médicaments, et tout particulièrement les inhibiteurs de protéase du VIH-1 pénètrent difficilement dans certains organes pouvant servir de réservoirs viraux comme c'est le cas pour le cerveau. Cette limitation favorise la persistance du virus permettant la réapparition rapide d'une forte virémie si les traitements sont interrompus. La réplication du VIH-1 dans le cerveau favorise le développement de déficits cognitifs, comportementaux et moteurs à long terme chez les personnes qui en sont atteintes. L'objectif principal de ce mémoire est de vérifier la possibilité d'utiliser les monocytes comme outil de transport des antirétroviraux sous forme de nanoparticules vers le réservoir du VIH-1 dans le système nerveux central (SNC). Cet objectif est vérifié à l'aide d'une reconstitution de la barrière hématoencéphalique (BHE), où la migration des monocytes chargés de nanoantirétroviraux est évaluée avec une lignée cellulaire monocytoïde, soit les Mono-Mac-1 (MM-1). Des particules de tailles nanométriques dans lesquelles la ritonavir est encapsulée (nanoRTV) ont été développées afin de faciliter leur chargement à l'intérieur des cellules. Des essais de cytotoxicité ont montré que la ritonavir encapsulée n'était pas plus toxique que la ritonavir seule. Par la suite, la capacité de chargement, de rétention ainsi que de relâchement de nanoRTV ont été mesurés dans le temps avec les cellules MM-1. Les résultats démontrent que les cellules MM-1 sont tout à fait capables de stocker des quantités importantes de ritonavir et de garder près de 40 % de la quantité initialement chargée sur une période de sept jours. Les essais de migration à travers la BHE reconstituée indiquent que les MM-1 chargées avec la nanoRTV perdent plus de la moitié de leur capacité de migration à travers la BHE en présence de chimiokines. Cependant, la pré-stimulation des cellules à la PGE[indice inférieur 2] avant le chargement des nanoRTV semble rétablir la capacité de la migration à travers cette barrière. Cette étude est complémentaire à d'autres travaux de recherche visant l'utilisation de cellules comme outil de transport pour la livraison de médicaments à des sites anatomiques ciblés. De plus, nos résultats suggèrent que les monocytes pourraient être des acteurs importants dans ce type de thérapie, étant des cellules avec une forte capacité de migration à travers la BHE.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'ARN d'interférence (ARNi) est un mécanisme de régulation du gène qui permet un ciblage spécifique d'ARNmessager (ARNm) par reconnaissance de séquence. Les effecteurs de l'ARNi sont de petites molécules d'ARN non codants (siARN, microARN et piARN). Evoluant dans le contexte de l'ARNi, les virus de différentes familles ont adopté des stratégies afin utiliser l'ARNipour leur propre bénéfice. Le principal objectif de ma thèse a été d'étudier la fonction de l' ARNmiRTAR, un miARN viral dérivé de l'extrémité 3 'de l'ARN VIH-1 TAR dans la réplication du VIH-1. Nous avons constaté que miRTAR réguleà la fois l'activité basale et la transactivation induite par Tat du promoteur du VIH-1. L'effet de miRTAR ne nécessite pas de sa liaison à l'ARN TAR. miRTAR agit en augmentant l'activité de NF-kB, un facteur important pour la transcription du promoteur du VIH-1. En effet, la mutation des sites NF-kB, mais pas des sites Sp1 dans le LTR, abroge l'amélioration miRTARmédiée par la transcription. De plus, l'inhibition de l'expression de NF-kBpardes siARNspécifiquesdes les sous-unités p50 et p65, entraîne une perte d'activité dumiRTAR. Bien que nous n'avons pas pu identifier le(s) gène(s) cellulaire(s) ciblé par miRTAR, sa surexpression conduit à l'activation de la voie NF-kB. Mutation de l'extrémité 3 'du VIH-1 dans les résultats TAR réduction spectaculaire de la réplication virale Tat sans affecter médiée par la transcription, en raison de la perte de production de miRTARsauvage. Enfin, la surexpression de miRTARrestaure la réplication de ce virus contenant une mutation au niveau de la séquence TAR. En conclusion, nos résultats démontrent clairement que lemiRTARencodé par le VIH-1 joue un rôle clé dans la réplication du virus. Sur la base de ces résultats, nous proposons le modèle suivant pour la fonction de miRTAR. La transcription du LTR du VIH-1 conduit à la production de courts ARN dénommés TAR contenant une structure en épingle à cheveux. TAR est « processé » pour générer le miARN miRTAR. L'ARN miRTAR est ensuite chargé dans le complexe RISC et régule l'expression de plusieurs gènes cellulaires impliqués dans la régulation négative de NF-kB. miRTARmédiée par l'activation de NF-kB résultats dans la régulation de gènes viraux et par conséquent augmente la production de virus. L'ensemble de nos résultats montrent que le VIH-1 utilise la voie de l'ARNiinterférence pour optimiser l'environnement intracellulaire requis pour une réplication optimale. / RNA interference (RNAi) is a gene regulatory mechanism that offers a sequence specific targeting of mRNA. Evolving in the context of RNAi, viruses of different families adopted strategies to use RNAi for their benefit. The main objective of my thesis was to understand the function of miRTAR, a viral miRNA derived from 3' end of the HIV-1 TAR RNA, in HIV-1 replication. We found that miRTAR regulates both basal and Tat-mediated transactivation of HIV-1 promoter. The effect of miRTAR does not require its binding to TAR RNA. miRTAR acts by inducing NF-κB transcription factor important for the LTR activity. Indeed, mutation of NF-κB sites but not Sp1 sites within the LTR abrogate miRTAR-mediated enhancement of transcription from the LTR. Additionally, Inhibition of NF-κB using specific siRNA directed against p50 and p65 subunits results in loss of miRTAR activity. Although, we were unable to identify the cellular gene(s) targeted by miRTAR, its overexpression lead to the activation of NF-κB pathway. Mutation of the 3' end of HIV-1 TAR results in dramatic reduction of viral replication without affecting Tat-mediated transcription. Importantly, overexpression of miRTAR rescued the replication of miRTAR HIV-1 mutant virus.In conclusion, our results strongly demonstrate that the HIV-1 encoded miRTAR plays a key role in virus replication. On the basis of these findings, we propose the following model for the function of miRTAR. Transcription of the HIV-1 LTR leads to production of short, TAR containing, RNA hairpin sequences. TAR is processed to generate miRNA, miRTAR. miRTAR is then loaded into the RISC complex and regulates the expression of several cellular genes involved in the negative regulation of NF-κB. miRTAR-mediated activation of NF-κB results in up regulation of viral genes and consequently enhances virus production. Taken together, our results demonstrate that HIV-1 uses RNAi pathway to optimize the intracellular environment for optimal replication.

Bien que le traitement antirétroviral (ART) supprime efficacement la multiplication du VIH-1 chez les patients infectés, l’ART ne guérit pas l'infection. En effet, si l'ART est arrêté, nous observons un rebond viral. Celui–ci est principalement dû à l'activation stochastique de cellules latentes qui contiennent le génome viral intégré mais ne produisent pas de virus et ne sont donc pas ciblées par l'ART ou le système immunitaire. Ces cellules latentes sont peu nombreuses (1-10 par million de cellules T-CD4+ quiescentes) mais elles apparaissent rapidement après la primo infection et constituent donc un obstacle majeur à l'éradication virale. La stratégie la plus prometteuse pour supprimer ces cellules, dite "Shock and Kill", est de les réactiver pour qu'elles soient ensuite ciblées par l'ART et/ou lysées par les cellules T cytotoxiques. Un certain nombre d’agents de sortie de latence (LRAs) ont été mis au point pour réactiver ces cellules. Ils ciblent les protéines cellulaires telles que les Histone-désacétylases (HDAC) ou la protéine kinase C. La plupart d'entre eux présentent donc des effets non spécifiques et parfois une toxicité. Tat est la protéine du VIH-1 qui permet la transcription virale et favorise la traduction des gènes viraux. Tat est la protéine clé pour la levée de latence et l'initiation de la production des protéines virales par la cellule latente. Sur la base des structures RMN de Tat disponibles, nous avons identifié par dynamique moléculaire les conformations les plus stables de Tat. Cela nous a permis d'identifier par criblage in silico des ligands potentiels de Tat. Dix molécules ont été sélectionnées. Une molécule appelée D10 se fixe spécifiquement à la protéine Tat et augmente son activité de transactivation d'environ 4 fois. De plus, D10 présente une activité LRA sur les lignées cellulaires latentes JLat-9.2 et OM-10.1. L’activité LRA de D10 sur ces lignées représente 50 à 70% de celle du SAHA (vorinostat), un inhibiteur des HDAC candidat LRA en cours d’essais cliniques (Phase 2). Sur les cellules latentes de patients VIH traités, D10 à 50 nM a une activité LRA très efficace, 80% supérieure à celle de la bryostatine-1 qui agit sur la PKC et est considéré comme le LRA le plus prometteur actuellement. Le mécanisme d’action de D10, à semble être la stabilisation du complexe de transcription Tat-TAR. Cet effet est observé à 30 nM D10. En utilisant une approche chémoinformatique nous avons sélectionné 11 analogues de D10, dit N1-N11. Certains de ces analogues (N5, N8) montrent un effet plus fort que D10 sur l’augmentation de la transactivation de Tat ainsi que pour l’effet LRA sur les lignées cellulaires latentes. Ce résultat nous a permis d'ébaucher une relation structure chimique / activité LRA de ces molécules. Nous avons donc identifié de nouveaux agents de sortie de latence du VIH-1 ciblant Tat, plus spécifiques que les LRAs ciblant les protéines cellulaires. Ce sont les premiers activateurs de Tat identifiés. / Despite its efficiency to prevent viral multiplication, antiretroviral therapy (ART) is unable to cure patients with HIV-1. Indeed if ART is stopped, a viral rebound is observed. This increase in blood viral load is due to the activation of HIV-1 reservoirs, among which latently-infected memory CD4+ T cells. These cells are rare (1 per million of quiescent T cells) and appear very quickly following infection. To purge this long-lived reservoir the "Shock and Kill" approach was developed. This strategy relies on the use of latency reversing agents (LRAs) to induce reservoir activation. All LRAs developed until now target cellular proteins such as Histone deacetylases or protein kinase C. These LRAs are not specific for viral transcription and displayed modest effects ex vivo. Here we present a new LRA family that binds to and activates HIV-1 Tat which is the key regulator for viral transcription and latency reversal. These compounds are not cytotoxic and specifically activate Tat transcriptional activity. They were less efficient than available LRAs on HIV-1 latent cell lines. Nevertheless, when tested on latent T-cells from HIV-1 patients, the lead compound D10 was ~ 80% more efficient than bryostatin-1, one of the best LRA available to date. This effect was observed at 50 nM, which corresponds to the D10 concentration required for this compound to stabilize the Tat-TAR transcription complex. These molecules are the first Tat activators available.

L'autophagie est une voie majeure de dégradation et de recyclage des constituants cytoplasmiques. C'est également un mécanisme de l'immunité innée et adaptative. Au cours de l'infection par le VIH-1, l'autophagie est déclenchée dans les lymphocytes T CD4 non infectés après contact avec les glycoprotéines d'enveloppe virale (Env). Cette autophagie participe alors à l'induction de l'apoptose dans ces cellules, mécanisme connu pour être responsable de la disparition des lymphocytes T CD4 au cours de l'infection, et donc de l'évolution vers la phase SIDA. Nos travaux ont permis de montrer que l'activité fusogénique de gp41 est responsable de l'induction d'autophagie et de la mort des lymphocytes T CD4 non infectés après leur contact avec Env. De façon tout à fait surprenante, il apparaît que l'autophagie est bloquée dans les lymphocytes T CD4 productivement infectés par le VIH-1 (souches X4 ou R5). Par contre, les macrophages, autre population cellulaire ciblée par ce virus, ne présentent aucun signe d'autophagie en réponse à la fixation de Env (souches X4 ou R5), alors qu'elle est induite dans les macrophages infectés par ces mêmes virus. Enfin, les derniers résultats nous ont permis de mettre en évidence une phase d'autophagie plus précoce, intervenant dans les deux heures suivant le contact avec Env. L'étude des acteurs impliqués dans l'induction de cette première phase a montré qu'elle était indépendante de la fusion membranaire induite par gp41, ainsi que de la liaison de Env aux récepteurs CD4 et CXCR4. Cette première phase d'autophagie est également présente dans les premières étapes d'infection des lymphocytes T CD4 par du virus libre, et est nécessaire à la réplication du VIH-1. Le VIH-1 adopte donc une stratégie d'exploitation du mécanisme autophagique afin d'optimiser sa réplication, mais également la propagation de l'infection. / Autophagy is a major catabolic pathway involved in the degradation and recycling of cytoplasmic components. It is also a mechanism of adaptive and innate immunity. During HIV-1 infection, autophagy is induced in uninfected CD4 T lymphocytes after contact with cells expressing HIV-1 envelope glycoproteins (Env, gp120/gp41). This process is a pre-requisite to their apoptosis. Thus, autophagy is implicated in the depletion of CD4 T lymphocytes during HIV-1 infection, mechanism leading to AIDS. The results obtained during my PhD have shown that the fusogenic function of gp41 is responsible for the induction of autophagy in the uninfected CD4 T lymphocytes. Surprisingly, this process is blocked in productively HIV-1-infected CD4 T lymphocytes (X4 or R5 strains). In contrast, uninfected macrophages, a preserved cell population during HIV-1 infection, do not undergo X4 or R5 Env-mediated autophagy. However, autophagosomes are present in infected macrophages. Our last results demonstrated that an early autophagic phase is triggered in target CD4 T cells 2h after the contact with Env-expressing cells. Neither the fusogenic function of gp41, nor gp120 binding to CD4 and CXCR4 is implicated in the induction of this early autophagic phase. Interestingly, this process seems necessary to establish an efficient HIV-1 replication. Our results suggest that HIV-1 adopts a strategy to use the autophagic pathway to its own profit and pointes this process as a key for the HIV-1-associated physiopathology.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue une limite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent à l'immunogénicité et d'en tirer partie pour développer des approches originales permettant d'améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j'ai principalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J'ai montré que l'oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d'induire la réponse immunitaire en absence d'adjuvant. J'ai identifié le déterminant minimal responsable de l'effet et montré qu'il confère la propriété adjuvante à d'autres antigènes. J'ai ensuite montré que la présentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sont dotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d'expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Ces travaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l'immunogénicité de protéines susceptibles d'être intégrées dans des préparations vaccinales.

Thèse de doctorat : Chimie organique : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliogr.

1) "Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de VIH-1 análogos del péptido C34 de gp41 con D aminoácido"En el proceso de fusión del virus del VIH-1 a la célula diana intervienen las proteínas de la cubierta viral gp120 y gp41. La gp120 al interaccionar con el receptor CD4 y co-receptores sufre un cambio conformacional que enseguida causa cambios en la estructura de gp41. Esta proteína sufre una reorganización que conduce al acercamiento entre la región N-terminal y la región C-terminal de gp41 aproximando las membranas celular y viral entre si. El péptido C34 tiene buenas propiedades como inhibidor de la fusión viral y forma complejos estables con el péptido N36 derivado de la región N-terminal de gp41. En este capítulo se discute el efecto de cambiar la quiralidad del péptido C34 total o parcialmente, para aumentar la estabilidad de este péptido frente a proteasas. Mientras los péptidos derivados de C34 con todo-D aminoácidos fueron incapaces de inhibir la fusión del VIH-1. Los péptidos heteroquirales, especialmente el péptido M3C34, son capaces de formar complejos estables con N36 e inhibir la fusión.2) "Identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-D y el fragmento N-terminal del dominio de B de la proteína A de Staphyloccus aureus"La proteína A es un factor patogénico encontrado en la superficie del Staphylococcus aureus. Esta proteína es capaz de unirse al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas G. El dominio B, un trímero de hélices antiparalelas, es uno de los cinco dominios responsables de este reconocimiento. Péptidos derivados de la región N-terminal de este dominio no tienen una estructura estable en disolución. Sin embargo, la presencia de la de péptidos correspondientes a la región C-terminal del dominio forman complejos que aumentan el contenido helicoidal del sistema. En este capitulo se diseñó una quimioteca OBOC (del ingles "one bead one compound") de 4096 péptidos con aminoácidos D derivados de la secuencia de la hélice C-terminal el domino B, con el objetivo de identificar péptidos todo-D capaces de interactuar con el fragmento N-terminal del domino B y de formar complejos no covalentes heteroquirales. 3) "Síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina G de nuevos análogos del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus"Los fragmentos correspondientes a la hélice C-terminal y región N-terminal del domino B de la proteína A de Staphylococcus. aureus forman complejos que aumentan la helicidad del sistema. En nuestro grupo se identificaron dos péptidos derivados de la hélice C-terminal del dominio B que forman complejos con el fragmento N-terminal con mutaciones en los residuos Ser 44 y Leu 47. En esta parte se describe la caracterización estructural y evaluación de la actividad de los complejos no covalentes formados entre estos péptidos y el fragmento N-terminal del dominio B y los dominios enteros. Después de comprobar que el fragmento N-terminal interaccionaba con los análogos no naturales de la hélice C-terminal se sintetizaron los dos dominios análogos con las modificaciones encontradas en la región C-terminal (Ser44Phe Leu47Lys y Ser44Phe Leu47Val). El análisis de estructura por dicroísmo circular reveló que los análogos mostraban estructura helicoidal y eran térmicamente estables. Por resonancia de plasmon superficial se encontró que los análogos se unían a inmunoglobulina de conejo y al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas humano con una afinidad similar, aunque con cambios en las cinéticas de asociación y disociación. La información estructural de cada residuo se analizó por medio de resonancia magnética nuclear. Este estudio mostró que los dominios análogos conservan tres regiones helicoidales y de acuerdo a los experimentos de intercambio H/D se pliegan de forma similar al dominio natural. / This thesis is divided in three parts. The first part is about the design, synthesis and characterization of new peptide inhibitors of the HIV-1 fusion derived of the C-terminal region of gp41. In the second part was described the design and synthesis of a library of all-D peptide derived of the C-terminal region of B domain of protein A of Staphylococcus aureus to identify all-D peptides which could interact with the N-terminal fragment of B domain to get heteroquiral non covalent complexes. The third part is about the synthesis, structural characterization and activity evaluation of two new analogues en B domain of protein A of Staphylococcus aureus with mutations in Ser44 and Leu47.

Los individuos expuestos al VIH-1 y no infectados y los pacientes infectados no progresores de larga duración son situaciones modelo para estudiar factores del huésped implicados en conferir resistencia a la infección / progresión y su conocimiento puede ser esencial para desarrollar nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. El diseño del estudio fue un análisis de la frecuencia de nuevos factores inmunogenéticos, que potencialmente podrían estar implicados en la resistencia/pogresión de la infección, no descritos previamente en 4 grupos de individuos muy bien definidos: 1) pacientes VIH+ con progresión lenta de la infección, 2) pacientes con progresión normal de la infección, 3) individuos con exposición a la infección por el VIH, que permanecen seronegativos y 4) controles sanos.El primer factor inmunogenético analizado fueron los polimorfismos en el receptor alfa de la IL-4. La IL-4 in vitro disminuye la expresión de CCR5 y aumenta la expresión de CXCR4 y además potencia la diferenciación de los linfocitos Th hacia una respuesta tipo 2, por lo que las diferentes variantes podrían influir en la resistencia a la infección o progresión hacia sida. Los polimorfismos analizados fueron I50V en el exón 5 (extracelular) y 6 polimorfismos localizados en el exón 12 (intracelular). Los principales resultados obtenidos fueron: 1) la variante homozigota V50 se asoció con la progresión lenta de la infección por el VIH y 2) la presencia de haplotipos infrecuentes en el exón 12 se asoció a una mayor susceptibilidad a la infección por el VIH tras una exposición parenteral. El segundo trabajo parte de que la activación de linfocitos CD4 vía CD28 modula la expresión de los principales co-receptores del VIH-1, CCR5 y CXCR4. Por ello, se analizó la presencia de posibles posibles polimorfismos en la región 5'UTR del gen de CD28. Los resultados obtenidos fueron: 1) la presencia de un polimorfismo que consiste en la inserción de 5 nucleótidos y 2) que esta variante se encuentra con más frecuencia en los pacientes infectados con respecto a aquellos pacientes repetidamente expuestos al VIH por vía sexual, que permanecen seronegativos. Estos datos sugieren que esta variante favorecería la infección por el VIH a través de las mucosas. El tercer y último trabajo analiza el polimorfismo en la región no traducida del gen SDF-1 (SDF1-3'A), ligando natural del CXCR4. Esta mutación en su forma homozigota se ha relacionado con progresión lenta hacia el desarrollo de SIDA, aunque otros trabajos no confirman estos resultados e incluso lo contradicen. Las consecuencias biológicas de esta mutación no se conocían por lo que consideramos como objetivos de trabajo, correlacionar los niveles de SDF-1 con la presencia o no de la mutación SDF1-3'A, analizar el genotipo, los niveles de SDF-1 y la expresión de CXCR4 en los diferentes grupos de estudio. Las principales conclusiones fueron: 1) la mutación SDF1 3'A-3'A no se asoció a progresión lenta de la infección, 2) la presencia homozigota de la mutación SDF1-3'A, se asoció a concentraciones bajas de SDF-1, 3) la infección por el VIH se acompañó de una elevación de los niveles de SDF-1 y un descenso en la expresión de CXCR4. Este patrón se mantuvo en los pacientes LTNP, mientras que en los pacientes con progresión normal de la infección y especialmente en aquellos con una fase muy avanzada de la enfermedad y 4) en nuestro estudio la mutación SDF1-3'A no se asoció a resistencia al VIH-1.