Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 21 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1999. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Th.--Sci. nat.--Nancy--I.N.P.L., 1985.

La cellule eucaryote constitue un système complexe composé d'un grand nombre d'entités, dont trois ensembles particulièrement importants : l'ADN, l'ARN et les protéines. Ces entités vont interagir ensemble et former des complexes ribonucléoprotéiques possédant des activités biochimiques qui vont permettre à la cellule de se réguler et de s'adapter à son milieu. Ces complexes sont des acteurs dans les mécanismes d'expression génique et de régulation. Au cours du siècle dernier, l'étude de ces entités a fait l'objet d'un intérêt tellement important de la part des biologistes qu'elle a donné naissance à un domaine scientifique particulier : la biologie moléculaire. Plus récemment, bien que celle-ci se soit à ses débuts focalisée sur l'ADN et les protéines, les ARN, et leur sous-ensemble les petits ARN non-codants (pARNnc), sont apparus comme des acteurs clés de la régulation de mécanismes cellulaires fondamentaux. En outre, le développement de technologies dites de séquençage à haut débit a permis d'en étudier la diversité des classes. Ainsi, durant les 20 dernières années, des efforts importants ont été consacré à la découverte et à l'étude de nouvelles classes de pARNnc, leur biogenèse et leur fonction. Cependant, l'étude de ces pARNnc par le biais de protocoles de séquençage des pARNnc (pARN-seq) ainsi que les outils bioinformatiques ont été conçus pour concentrer les analyses sur les séquences considérées comme les plus importantes. De ce fait, il apparait généralement que les pARNnc de moins de 15 nucléotides (nt) et ceux issus des ARN ribosomiques ont été presque systématiquement écartés des analyses. Dans le cadre de ce doctorat, nous avons voulu remettre en question cette croyance en préservant l'ARN ribosomique (ARNr) dans nos échantillons, et en abaissant à 8 nt la fenêtre de taille minimale des ARN séquencés. Grâce à cette approche, nous avons justement découvert une nouvelle famille d'ARN exceptionnellement courts qui correspondent à l'extrémité 5' de l'ARNr 5.8S, que nous avons appelé dodécaARN (doARN), reflétant ainsi le nombre de nucléotides de base (12 nt) que contiennent leurs membres. À cet effet, nous avons développé une méthode de détection quantitative afin de confirmer nos données de pARN-Seq, et de valider l'existence de deux doARN (i.e. la séquence minimale de 12 nt doARN, et sa variante portant une cytosine additionnelle en 5', le C-doARN) chez la souris et l'homme. Cette méthode spécifique et sensible est basée sur une ligature assistée par un pont à ADN d'un adaptateur à l'extrémité 5' des doARN, suivie d'une rétro-transcription, et d'amplification quantitative par qPCR. Nous avons ainsi pu confirmer nos résultats de pARN-seq et déterminé que les deux doARN sont plus abondants que certains microARN. La caractérisation de ces ARN nous a conduit à établir que le doARN et le C-doARN sont principalement localisés dans le cytoplasme des cellules, et interagissent avec les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) A0, A1 et A2B1, mais pas Argonaute 2. Enfin, l'étude de la régulation de leur expression a permis d'identifier que le niveau du C-doARN était augmenté en cas de privation de sérum, tandis que le doARN était diminué dans les cellules et tissus cancéreux de la prostate humaine comparés à celles et ceux normaux. Plus intéressant encore, nous avons pu établir à l'aide de test de blessure que le CdoARN était capable de réduire la migration/prolifération cellulaire, alors que le do-ARN pourrait fonctionner comme un régulateur global de la traduction. Entre autres, nous avons établi que la présence d'un site de fixation pour le doARN au sein de la séquence 5'UTR d'un ARNm pourrait impacter la traduction de celui-ci. Bien que ces études nous aient permis d'affirmer la présence et la fonctionnalité d'ARN inférieurs à 15 nt, leurs mécanismes d'action, ainsi que leur biogenèse restent néanmoins à être élucidés. Notamment, je porterai une grande attention dans la discussion aux perspectives de recherche concernant l'hypothèse selon laquelle une méthylation spécifique de l'uracile 14 de l'ARNr 5.8S puisse être liée à la génération des doARN / The eukaryotic cell is a complex system composed of many entities, including three particularly important sets: DNA, RNA, and proteins. These entities interact together to form ribonucleoprotein complexes with biochemical activities that allow the cell to regulate and adapt to its environment. These complexes are actors in the mechanisms of gene expression and regulation. During the last century, the study of these entities has been the subject of such great interest by biologists that it has given rise to a particular scientific field: molecular biology. More recently, although molecular biology initially focused on DNA and proteins, RNAs, and their small non-coding RNAs (sRNA) subset, have emerged as key players in the regulation of fundamental cellular mechanisms. In addition, the development of so-called high-throughput sequencing technologies has made it possible to study the diversity of their classes. Thus, during the last 20 years, significant efforts have been devoted to the discovery and study of new classes of ncRNAs, their biogenesis and their function. However, the study of these sRNA through sRNA sequencing protocols (sRNA-seq) as well as bioinformatics pipelines have been designed to focus analyses on the sequences considered most important. As a result, it generally appears that sRNA of less than 15 nucleotides (nt) and those derived from ribosomal RNA were almost systematically excluded from the analyses. In this Ph.D. work, we wanted to challenge this belief by preserving the ribosomal RNA (rRNA) in our samples, and by lowering the minimum size window of sequenced RNA to 8 nt. Thanks to this approach, we discovered a new family of exceptionally short RNA that correspond to the 5' end of the 5.8S rRNA, which we called dodecaRNA (doRNA), reflecting the number of core nucleotides (12 nt) shared by its members. For this purpose, we developed a quantitative detection method to confirm our sRNASeq data, and to validate the existence of two doRNAs (i.e., the minimum 12 nt doRNA sequence, and its variant carrying an additional 5' cytosine, C-doRNA). This specific and sensitive method is based on DNA-bridge-assisted ligation of an adaptor at the 5' end of the doRNAs, followed by retrotranscription, and quantitative amplification by qPCR. We were thus able to confirm our sRNA-seq results and determined that both doRNAs may be more abundant than microRNAs. The characterization of these RNAs led us to establish that doRNA and C-doRNA are mainly localized in the cytoplasm of cells and interact with heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) A0, A1 and A2B1, but not Argonaute 2. Finally, the study of the regulation of their expression identified that the level of C-doRNA was increased during serum deprivation, while doRNA was decreased in human prostate cancer cells and tissues compared to normal cells and tissues. More interestingly, we were able to establish through cell culture wound testing that C-doRNA was able to reduce cell migration/proliferation, while do-RNA could function as a global regulator of translation. Among other things, we established that the presence of a binding site for doRNA within the 5'UTR sequence of an mRNA could impact its translation. Although these studies have allowed us to affirm the presence and functionality of RNA below 15 nt, their mechanisms of action, as well as their biogenesis remain to be elucidated. In particular, I will pay close attention in the discussion to the research prospects concerning the hypothesis that a specific methylation of uracil 14 of 5.8S rRNA can be linked to the generation of our doRNA

La cellule eucaryote constitue un système complexe composé d'un grand nombre d'entités, dont trois ensembles particulièrement importants : l'ADN, l'ARN et les protéines. Ces entités vont interagir ensemble et former des complexes ribonucléoprotéiques possédant des activités biochimiques qui vont permettre à la cellule de se réguler et de s'adapter à son milieu. Ces complexes sont des acteurs dans les mécanismes d'expression génique et de régulation. Au cours du siècle dernier, l'étude de ces entités a fait l'objet d'un intérêt tellement important de la part des biologistes qu'elle a donné naissance à un domaine scientifique particulier : la biologie moléculaire. Plus récemment, bien que celle-ci se soit à ses débuts focalisée sur l'ADN et les protéines, les ARN, et leur sous-ensemble les petits ARN non-codants (pARNnc), sont apparus comme des acteurs clés de la régulation de mécanismes cellulaires fondamentaux. En outre, le développement de technologies dites de séquençage à haut débit a permis d'en étudier la diversité des classes. Ainsi, durant les 20 dernières années, des efforts importants ont été consacré à la découverte et à l'étude de nouvelles classes de pARNnc, leur biogenèse et leur fonction. Cependant, l'étude de ces pARNnc par le biais de protocoles de séquençage des pARNnc (pARN-seq) ainsi que les outils bioinformatiques ont été conçus pour concentrer les analyses sur les séquences considérées comme les plus importantes. De ce fait, il apparait généralement que les pARNnc de moins de 15 nucléotides (nt) et ceux issus des ARN ribosomiques ont été presque systématiquement écartés des analyses. Dans le cadre de ce doctorat, nous avons voulu remettre en question cette croyance en préservant l'ARN ribosomique (ARNr) dans nos échantillons, et en abaissant à 8 nt la fenêtre de taille minimale des ARN séquencés. Grâce à cette approche, nous avons justement découvert une nouvelle famille d'ARN exceptionnellement courts qui correspondent à l'extrémité 5' de l'ARNr 5.8S, que nous avons appelé dodécaARN (doARN), reflétant ainsi le nombre de nucléotides de base (12 nt) que contiennent leurs membres. À cet effet, nous avons développé une méthode de détection quantitative afin de confirmer nos données de pARN-Seq, et de valider l'existence de deux doARN (i.e. la séquence minimale de 12 nt doARN, et sa variante portant une cytosine additionnelle en 5', le C-doARN) chez la souris et l'homme. Cette méthode spécifique et sensible est basée sur une ligature assistée par un pont à ADN d'un adaptateur à l'extrémité 5' des doARN, suivie d'une rétro-transcription, et d'amplification quantitative par qPCR. Nous avons ainsi pu confirmer nos résultats de pARN-seq et déterminé que les deux doARN sont plus abondants que certains microARN. La caractérisation de ces ARN nous a conduit à établir que le doARN et le C-doARN sont principalement localisés dans le cytoplasme des cellules, et interagissent avec les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) A0, A1 et A2B1, mais pas Argonaute 2. Enfin, l'étude de la régulation de leur expression a permis d'identifier que le niveau du C-doARN était augmenté en cas de privation de sérum, tandis que le doARN était diminué dans les cellules et tissus cancéreux de la prostate humaine comparés à celles et ceux normaux. Plus intéressant encore, nous avons pu établir à l'aide de test de blessure que le CdoARN était capable de réduire la migration/prolifération cellulaire, alors que le do-ARN pourrait fonctionner comme un régulateur global de la traduction. Entre autres, nous avons établi que la présence d'un site de fixation pour le doARN au sein de la séquence 5'UTR d'un ARNm pourrait impacter la traduction de celui-ci. Bien que ces études nous aient permis d'affirmer la présence et la fonctionnalité d'ARN inférieurs à 15 nt, leurs mécanismes d'action, ainsi que leur biogenèse restent néanmoins à être élucidés. Notamment, je porterai une grande attention dans la discussion aux perspectives de recherche concernant l'hypothèse selon laquelle une méthylation spécifique de l'uracile 14 de l'ARNr 5.8S puisse être liée à la génération des doARN / The eukaryotic cell is a complex system composed of many entities, including three particularly important sets: DNA, RNA, and proteins. These entities interact together to form ribonucleoprotein complexes with biochemical activities that allow the cell to regulate and adapt to its environment. These complexes are actors in the mechanisms of gene expression and regulation. During the last century, the study of these entities has been the subject of such great interest by biologists that it has given rise to a particular scientific field: molecular biology. More recently, although molecular biology initially focused on DNA and proteins, RNAs, and their small non-coding RNAs (sRNA) subset, have emerged as key players in the regulation of fundamental cellular mechanisms. In addition, the development of so-called high-throughput sequencing technologies has made it possible to study the diversity of their classes. Thus, during the last 20 years, significant efforts have been devoted to the discovery and study of new classes of ncRNAs, their biogenesis and their function. However, the study of these sRNA through sRNA sequencing protocols (sRNA-seq) as well as bioinformatics pipelines have been designed to focus analyses on the sequences considered most important. As a result, it generally appears that sRNA of less than 15 nucleotides (nt) and those derived from ribosomal RNA were almost systematically excluded from the analyses. In this Ph.D. work, we wanted to challenge this belief by preserving the ribosomal RNA (rRNA) in our samples, and by lowering the minimum size window of sequenced RNA to 8 nt. Thanks to this approach, we discovered a new family of exceptionally short RNA that correspond to the 5' end of the 5.8S rRNA, which we called dodecaRNA (doRNA), reflecting the number of core nucleotides (12 nt) shared by its members. For this purpose, we developed a quantitative detection method to confirm our sRNASeq data, and to validate the existence of two doRNAs (i.e., the minimum 12 nt doRNA sequence, and its variant carrying an additional 5' cytosine, C-doRNA). This specific and sensitive method is based on DNA-bridge-assisted ligation of an adaptor at the 5' end of the doRNAs, followed by retrotranscription, and quantitative amplification by qPCR. We were thus able to confirm our sRNA-seq results and determined that both doRNAs may be more abundant than microRNAs. The characterization of these RNAs led us to establish that doRNA and C-doRNA are mainly localized in the cytoplasm of cells and interact with heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) A0, A1 and A2B1, but not Argonaute 2. Finally, the study of the regulation of their expression identified that the level of C-doRNA was increased during serum deprivation, while doRNA was decreased in human prostate cancer cells and tissues compared to normal cells and tissues. More interestingly, we were able to establish through cell culture wound testing that C-doRNA was able to reduce cell migration/proliferation, while do-RNA could function as a global regulator of translation. Among other things, we established that the presence of a binding site for doRNA within the 5'UTR sequence of an mRNA could impact its translation. Although these studies have allowed us to affirm the presence and functionality of RNA below 15 nt, their mechanisms of action, as well as their biogenesis remain to be elucidated. In particular, I will pay close attention in the discussion to the research prospects concerning the hypothesis that a specific methylation of uracil 14 of 5.8S rRNA can be linked to the generation of our doRNA

Texte remanié de: thèse--Sc. phys.--Aix-Marseille II, 1973. N°: 46. / C.N.R.S. A.O. 7567. Extrait de "Molecular and general genetics" T. 121, 1973, pp. 151-162 . Conservé sous la cote: [4° THS. Pièce. 663].

Chez l'humain, il y a présence de quatre petits ARN Y; soit les ARN hYl, hY3, hY4 et hY5. La longueur de ces ARN varie entre 84 (hY5) à 112 (hY1) nucléotides. Ces ARN forment une longue structure tige boucle pouvant être liée par une protéine nommée Ro60. Les ribonucléoprotéines Ro (Ro RNP) résultent de la liaison de Ro60 ainsi que celle de la protéine La aux ARN hY. Ces Ro RNP sont la cible d'auto-anticorps chez des patients atteints de pathologies du tissu conjonctif, comme le lupus érythémateux systémique. Les connaissances sur le rôle de ces petits ARN non-codants sont limitées. Cela rend leur étude d'autant plus importante. Par contre, quelques évidences suggèrent leur implication dans la réplication chromosomale. Récemment, environ mille pseudogènes Y ont été découverts dans le génome humain; leur présence suggère un mécanisme de rétrotransposition. L'étude des séquences adjacentes aux pseudogènes a permis d'identifier une signature de la machinerie des Long Interspersed Nuclear Elements 1 (LINE-1), suggérant un nouvel élément mobile similaire à Alu. De plus, la majorité des pseudogènes Y présentaient des mutations précises aux sites de liaison de plusieurs protéines, dont Ro60. Cela nous a amenés à explorer les différents aspects du mécanisme de rétroposition présumé des ARN hY. Pour ce faire, nous avons adapté un essai de rétrotransposition Ll dans les cellules HeLa. Notre principale hypothèse était de vérifier si l'absence de protéines liées à l'ARN Y pouvait influencer la rétrotransposition de l'ARN en question. La méthode de détection par dénombrement de colonies s'est avérée peu profitable puisqu'elle manquait de sensibilité. Les niveaux très faibles et le taux élevé de variation entre les différents essais ne permettaient pas d'émettre des conclusions claires et précises. Par la suite, nous avons développé une seconde méthode de détection basée sur la PCR quantitative en temps réel. Il s'agit d'une nouvelle application pour l'étude des événements de rétrotransposition. Celle-ci nous a permis de démentir notre hypothèse : la perte de liaison de certaines protéines ne favoriserait pas la prise en charge de l'ARN hY par la machinerie Ll .

El alcoholismo está determinado por factores genéticos y medioambientales. El factor genético principal corresponde a los genes que codifican las enzimas que metabolizan el alcohol. El metabolismo hepático del etanol contempla la oxidación del etanol a acetaldehído mediante la deshidrogenasa alcohólica y la posterior oxidación del acetaldehído a acetato, llevada a cabo fundamentalmente por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Un 30-40 % de la población oriental presenta una mutación que genera una ALDH2 sin actividad; al beber alcohol, estos individuos sufren un aumento en el nivel de acetaldehído sanguíneo, lo que trae como consecuencia efectos disfóricos que generan aversión por el alcohol. El fármaco disulfiram, utilizado para el tratamiento del alcoholismo, imita este fenotipo asiático ya que inactiva covalentemente a la ALDH2. Sin embargo, su eficacia farmacológica está contrarrestada por la variabilidad individual, la toxicidad, el requerimiento de ingesta diaria y por la necesidad de que el paciente se comprometa a medicarse. El desarrollo de fármacos alternativos más específicos y de mayor duración es concebible en base a disminuir la cantidad de la enzima ALDH2 disminuyendo la expresión de su gen. Ello se puede efectuar con moléculas capaces de degradar el mRNA de la ALDH2 como las ribozimas, moléculas de RNA que reconocen su blanco por enlaces de Watson y Crick y lo cortan en una secuencia específica. En este trabajo de tesis se determinó si la ribozima de horquilla RzCG20 ―capaz de disminuir la actividad de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo― es capaz de producir el mismo efecto in vivo al entregar, en un vector adenoviral, un gen que codifica dicha ribozima a ratas UChB dependientes de alcohol, de manera que al consumirlo sufran un aumento del acetaldehído sanguíneo cuyos efectos aversivos disminuyan el consumo voluntario de alcohol. Se produjeron y purificaron vectores adenovirales que codifican la ribozima RzCG20, la ribozima control RzCG20c diseñada para unirse a su blanco sin degradarlo, o un RNA no funcional control. Se transdujeron células de hepatoma de rata en cultivo con las preparaciones adenovirales obtenidas para asegurar que eran biológicamente activas, es decir, que eran capaces de disminuir la actividad de la ALDH2. En experimentos in vivo, los vectores adenovirales se inyectaron en la vena de la cola de ratas que voluntariamente beben gran cantidad de alcohol (ratas UChB), determinándose que una sola administración del vector adenoviral codificante de la ribozima RzCG20 a ratas UChB (n=5) disminuye en ~50 % el consumo de alcohol durante 34 días de un periodo de acceso restringido a etanol (1 h al día). Igual efecto se obtuvo con el adenovirus codificante de la ribozima control RzCG20c; el adenovirus control y el vehículo no disminuyeron el consumo. A los 39 días postinyección, las ratas que recibieron los vectores adenovirales codificantes de las ribozimas evidenciaron una reducción de ~24 % en la actividad de la ALDH2 hepática (medición espectrofotométrica) y un aumento en el acetaldehído sanguíneo dos veces mayor que los animales controles (según cromatografía de gases) luego de una administración intraperitoneal de alcohol (1 g/kg). En conclusión, se demostró actividad biológica específica in vivo de la ribozima RzCG20 y la ribozima control RzCG20c para silenciar el mRNA de la ALDH2: ambas ribozimas lograron una disminución parcial de la actividad de la ALDH2 sin afectar la actividad de otras ALDHs. Las posibles diferencias mecanísticas entre las ribozimas no se manifestaron en sus efectos bioquímicos sugiriendo que la sola unión de la ribozima control RzCG20c a los 17 nucleótidos reconocidos en el mRNA de la ALDH2 es suficiente para reducir, por bloqueo del mRNA, la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial en un grado que permite disminuir el consumo de alcohol. En suma, el desarrollo de una terapia génica para el alcoholismo disminuyendo la expresión del mRNA de la ALDH2 mediante ribozimas de horquilla es promisorio.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La epitranscriptomica es considerada una nueva rama de las ciencias biológicas que tiene como finalidad comprender la regulación de la expresión génica mediada por modificaciones químicas en el ARN. La N6-metiladenosina o m6A, es la modificación interna más abundante descrita en los ARNm. Los miembros de la familia de proteínas YTH han sido descritos como los principales encargados de reconocer la m6A presente en los ARNm y de ejecutar su función. Así, estas proteínas son conocidas como “lectoras” de m6A. En la familia de proteínas YTH existen 5 proteínas de las cuales 4 son citoplasmáticas, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) y una nuclear (YTHDC1). Mientras las proteínas citoplásmicas han sido asociadas con la regulación de la estabilidad, traducción o degradación de los ARNm que poseen m6A, el quinto miembro es nuclear y está involucrada con los procesos de corte y empalme alternativo y la exportación nuclear de ARNm metilados. Debido a que en los últimos años se ha descrito la presencia de m6A en ARNm virales, como es el caso de VIH-1, es que ha surgido el estudio de la epitranscriptómica viral, campo donde es necesario investigar las funciones de las proteínas involucradas. En este contexto, existen datos controversiales en donde se ha reportado que YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3 promueven la expresión génica de VIH-1 mediante el aumento de ARNm viral en las células infectadas e inhiben las etapas tempranas de la infección al inducir la degradación del genoma viral. Sin embargo, aún se desconoce si YTHDC1 o YTHDC2 regulan alguna etapa de la replicación de VIH-1. En este trabajo se planteó determinar la localización y proximidad entre las proteínas lectoras de m6A y el ARNm de VIH-1 a través de hibridación in situ acoplada al ensayo xiii de ligación proximal (ISH-PLA), de las cuales se obtuvo como resultado que YTHDC1 e YTHDF1 interactúan con el ARNm de VIH-1 en la periferia nuclear y región citoplasmática, respectivamente. Mientras que en el caso de YTHDF2 e YTHDF3, las interacciones observadas, no nos permitieron determinar la localización exacta de estas, mediante ISH-PLA. Una vez determinado esto, se escogió la proteína YTHDC1 como objeto de estudio. Se determinó el efecto de la sobreexpresión de esta lectora de m6A en la expresión génica viral analizando los niveles de la poliproteína Gag mediante Western blot y del ARN genómico mediante RT-qPCR. Aunque no se obtuvo consistencia en los resultados obtenidos, estos sugieren que YTHDC1 posiblemente promueve la exportación nuclear del ARN genómico de VIH-1. / The epitranscriptome is consider a new Branch of biology sciences that aims to understand the regulation of gene expression by chemical modifications on the RNA. The N6-methyladenosine or m6A, it is the most abundant inter modification described on the mRNA. The members of YTH proteins family have been described as the main responsible for recognizing m6A present on the mRNA and execute its function. So, these proteins are known as “readers” of m6A. In the YTH protein family exist 5 proteins of which 4 are cytoplasmic, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) and one nuclear (YTHDC1). Meanwhile cytoplasmic proteins have been associated with the stability regulation, translation or degradation of mRNA that m6A possesses, the fifth member is nuclear and is involved in the alternative splicing and the methylated mRNA nuclear export. xiv Because the presence of m6A on viral mRNA has been described in recent years, as in the case of HIV-1, the study of viral epitranscriptome has arisen, a field where it is necessary to investigate the functions of proteins involved. In this context, there are controversial data in where it has been reported that YTHDF1, YTHDF2 and YTHDF3 promote HIV-1 genetic expression by increasing viral mRNA in the infected cells and inhibit the early stage of infection by inducing the degradation of viral genome. However, it is still unknow if YTHDC1 or YTHDC2 regulate any stage of HIV-1 replication. In this work planned to determine the location and proximity among m6A reading proteins and HIV-1 mRNA by in situ hybridization coupled to the proximal ligation assay (ISH-PLA), from which YTHDC1 was obtained as a result and YTHDF1 interact with HIV-1 mRNA in the nuclear periphery and cytoplasmic region, respectively. While in the case of YTHDF2 and YTHDF3, the observed interactions did not allow us to determine the exact location of these, through ISH-PLA. Once it was determined, the YTHDC1 protein was chosen as the object of study. The effect of overexpression of this m6A reader in viral genetic expression was determined by analyzing the Gag polyprotein and genomic RNA by Western blot and RT-qPCR. Although no consistency was obtained in the results obtained, these suggest that YTHDC1 possibility promote the nuclear export of HIV-1 genomic RNA.

Les mécanismes qui entrent en jeu dans la maturation de l'ARN ribosomique (ARNr) restent toujours obscurs. Dbp4 est une ARN hélicase putative qui fait partie du groupe des hélicases « DEAD-box ». Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Dbp4 aurait un rôle à jouer dans la maturation du pré-ARNr 35S. Les ARN hélicases ont généralement une activité ATPasique dépendante de la présence d'ARN. De plus, la plupart des hélicases possèdent des domaines supplémentaires en N-et en C-terminal qui pourraient être nécessaires pour l'activité et/ou pour conférer la spécificité pour un substrat. Nous désirons déterminer les caractéristiques biochimiques de Dbp4. Cette enzyme est pourvue d'un très long domaine C-terminal qui contient un motif de liaison protéique « coiled-coil ». La présence de ce motif suggère que Dbp4 pourrait nécessiter l'assistance de protéine(s) cofacteur(s) pour avoir une activité ATPasique et/ou hélicasique. Des tests d'interaction dans le système double hybride de levure ont permis d'identifier une interaction entre Dbp4 et les protéines Bfr2, Esf1 et Enp2. Les conditions optimales pour l'activité ATPasique sont une incubation à 37 °C dans un tampon HEPES à pH 7.5 avec 10 µg d'ARN total de levure. Dbp4 possède une activité ATPasique qui augmente de quatre à cinq fois en présence d'ARN. La protéine Dbp4 recombinante sans la section C-terminale a été produite et des tests d'activité ATPasique ont été effectués. Selon nos observations, la section C-terminale de Dbp4 joue un rôle important pour l'activité ATPasique. Finalement, la production d'anticorps anti-Dbp4 chez le lapin nous a donné deux anticorps, A et B, capables de détecter Dbp4. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hélicase, ATPase, ARNr, DEAD-box, Dbp4, Saccharomyces cerevisiae, Double hybride et coloration au vert de malachite.