Ingeniera en Biotecnología Molecular / La proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina II (CaMKII) es una molécula de señalización sináptica que se expresa abundantemente en el cerebro y que juega un rol crítico en la formación de memorias y la inducción de eventos de plasticidad sináptica. La activación y autofosforilación en el sitio T286 de CaMKII son requeridas para inducir potenciación a largo plazo (LTP), fenómeno de plasticidad sináptica considerado modelo celular que subyace el aprendizaje. Las sinapsis glutamatérgicas de la región CA1 del hipocampo expresan un tipo de LTP que es dependiente del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR). Luego de inducir LTP, CaMKII autofosforilada es enriquecida en la densidad postsináptica (PSD), en donde (i) gatilla una cascada de señalización que finaliza con el aumento a largo plazo de la corriente mediada por lo receptores de tipo AMPA (AMPARs) y (ii) forma un complejo con la subunidad GluN2B del NMDAR. Mutaciones que previenen la autofosforilación de CaMKII o que interrumpen la asociación del complejo GluN2B-CaMKII causan un déficit en la inducción de la LTP y severos defectos en el aprendizaje. Debido a que CaMKII adquiere una actividad independiente de Ca2+ mediante su autofosforilación o su unión a la subunidad GluN2B, es esperable que su actividad quinasa sea adecuadamente regulada. Esta regulación podría llevarse a cabo a través de cambios en la expresión de dos inhibidores endógenos y específicos de CaMKII: CaMK2N1 y CaMK2N2 (también denominados CaMKIINα y CaMKIINβ, respectivamente). Estudios han revelado que CaMK2N1 aumenta transitoriamente su expresión en el hipocampo y en la amígdala luego del condicionamiento al miedo en ratones, sugiriendo un rol en controlar la actividad de CaMKII desde estadios tempranos de la consolidación de la memoria. Adicionalmente, estudios recientes han mostrado que la aplicación transitoria de péptidos inhibitorios 2 derivados de CaMK2N a rebanadas agudas de hipocampo interrumpe la interacción basal entre CaMKII y GluN2B y causa una depresión sináptica tanto en sinapsis naïve como en sinapsis previamente potenciadas, lo cual revierte la saturación de la LTP. Sin embargo, hasta el momento no existe evidencia que la expresión de CaMK2N sea regulada luego de inducir LTP en el hipocampo, así como ocurre luego del aprendizaje. En este estudio, se investigó si la expresión a nivel de mRNA de CaMK2N1 y CaMK2N2 es regulada luego de la inducción de LTP por estimulación a alta frecuencia (HFS) en la región CA1 de rebanadas agudas de hipocampo de rata. Experimentos de PCR cuantitativo (del inglés Polymerase Chain Reaction) revelaron que Camk2n1 aumenta su expresión 60 minutos después de inducir LTP. En contraste, la expresión de Camk2n2 no cambió. Además, se encontró una correlación positiva entre la magnitud de la potenciación y el cambio en la expresión de Camk2n1. Estos resultados, en conjunto con los hallazgos anteriores, sugieren que el aumento en la expresión de Camk2n1 luego de la inducción de LTP podría ser parte de un mecanismo de regulación que facilite la subsecuente inducción de eventos de plasticidad sináptica, una vez que los niveles basales de expresión del inhibidor se reestablecen. / Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) is an abundant synaptic signaling molecule that plays a critical role in memory formation and induction of synaptic potentiation. CaMKII activation and autophosphorylation at T286 are required to induce long-term potentiation (LTP), a form of synaptic plasticity considered a cellular model underlying learning. CA1 hippocampal synapses expresses a type of LTP dependent on the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR). After LTP induction, autophosphorylated CaMKII becomes enriched at postsynaptic densities, where it (i) triggers a biochemical cascade that produces a long-lasting increase of AMPA receptor (AMPAR) mediated currents and (ii) binds to the NMDAR GluN2B subunits. Mutations that prevent CaMKII autophosphorylation or disrupt the CaMKII-GluN2B complex cause a deficit in LTP induction and severe learning defects. Since CaMKII can be autonomously active by autophosphorylation or NMDAR binding, and considering its role in LTP induction and memory formation, it is expected that the kinase activity should be tightly regulated. This regulation may involve changes in the expression of two endogenous CaMKII-specific inhibitors: CaMK2N1 and CaMK2N2 (also named CaMKIINα and CaMKIINβ, respectively). Studies have revealed that CaMK2N1 transiently increases its expression in the rodent hippocampus and amygdala after fear conditioning, suggesting a role in controlling CaMKII activity in early stages of memory consolidation. Additionally, previous studies showed that transient application of CaMK2N-derived peptides to acute hippocampal slices disrupts the basal interaction between CaMKII-GluN2B and causes long-lasting synaptic depression in both naïve synapses and in previously potentiated synapses in which it reverses LTP saturation. However, it is not clear if CaMK2N expression is regulated after induction of LTP, as same as after fear conditioning. Here, 4 we investigated whether CaMK2N1 and CaMK2N2 gene expression is regulated after the induction of LTP in CA1 region of acute rat hippocampal slices. Real-time PCR experiments revealed that CaMK2N1 mRNA expression was up-regulated 60 min after LTP induction. In contrast, CaMK2N2 mRNA expression did not change. Additionally, correlation analysis showed a positive correlation between the LTP magnitude and Camk2n1 expression increase. These results, overall with the previous findings, suggest that the up-regulation of CaMK2N1 after LTP induction could be part of a regulation mechanism that facilitates the induction of subsequent synaptic plasticity events once basal expression levels are re-established. / Abril del 2018

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / The transcription process is initiated by the Core Promoter Elements (CPE), leading the formation of the Pre-Initiation Complex (PIC) which reclutes the transcription proteins (General Transcription Factors, GTFs) and RNA Polymerase II (RNA Pol II) that bind to the CPE. These GTFs are: TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF and TFIIH in the case of promoter recognized by the RNA Pol II that synthesizes the mRNA molecule using DNA sequence as template. Among the CPE are the TATA box, the TFIIB-recognition Element (BRE), the Initiator (Inr), the Motif Ten Element (MTE), Downstream Promoter Element (DPE) and the Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006) Data collected during the laboratory experimental work suggest that the DNA sequence named Homol D is a universal CPE in S. pombe and that the genes containing this element are transcribed by the RNA Pol II, which is also the target of a new factor or protein complex that determined the initiation site of transcription. We aim to determine which GTFs are required for Homol D box dependent gene transcription, through in vitro transcription assays, inmunodepletion and Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA). Here we show the analysis of the following specific antibodies for GTFs of interest (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and the subunit of Srb4 mediator). xii Protein extract of S. pombe were used as GTFs source, while ribosomal K5 gene (that possess the Homol D box) were used as DNA template. To carry out transcription was used a purified RNA Pol II. The in vitro transcription and inmunodepletion experiments allowed us to observe that transcription does not occur when each transcription factor studied is depleted by using a specific antibody for each GTF. When using a promoter with an inverted Homol D as DNA template the same results were observed. When a rescue of the transcription reaction is performed by supplementing the depleted GTF after the inmunodepletion, the reaction occurred for both the normal and the inverted Homol D box. Therefore the studied GTFs, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH and TFIIF are necessary for initiation of the transcription process in the K5 promoter which contains Homol D box. For the EMSA assays it was initially obtained a purified protein fraction with Homol D union and antibodies against each GTF to make an inmunodepletion of each GTFs and afterwards the reaction was incubated with P32γATP labeled probe. This assays allowed us to observe that the studied transcription factors are not the ones that recognize directly the Homol D box sequence. According with the work performed in this work, the GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and Srb4 are necessary for the formation of PIC but not for the recognition of the Homol D box in the K5 promoter, suggesting the existence of another factor/s o protein complex that recognizes the sequence of Homol D box. / El proceso de la transcripción es iniciado por los Elementos del Núcleo del Promotor (Core Promoter Element, CPE), que dirigen la formación del Complejo de Preiniciación (Pre-Initiation Complex, PIC), el cual está compuesto por los Factores de Transcripción Generales (General Transcription Factors, GTFs) y la RNA Polimerasa II (RNA Pol II). TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH corresponden a los GTFs que participan en la transcripción dirigida por promotores reconocidos por la RNA Pol II que sintetiza la molécula de mRNA a partir de una secuencia de DNA. Entre los CPE se encuentran la caja TATA, el elemento de reconocimiento de TFIIB (BRE), el Iniciador (Inr), el Motif Ten Element (MTE), el Downstream Promoter Element (DPE) y el Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006). Antecedentes recopilados durante el trabajo experimental de laboratorio sugieren que la secuencia de DNA denominada Homol D es un CPE universal en S. pombe y que los genes que poseen este elemento son transcritos por la RNA Pol II, la que además es blanco de un nuevo factor o complejo proteico que determina el sitio de inicio de la transcripción. Como objetivo de esta tesis se determinaron los requerimientos de GTFs necesarios para la transcripción de genes con promotores que poseen la caja Homol D, a través de ensayos de transcripción in vitro, inmunodepleción y geles de retardo (EMSA), en los cuales se utilizaron anticuerpos específicos para los distintos GTFs estudiados (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y una subunidad del mediador Srb4). xiv Como fuente de GTFs se utilizaron extractos de proteínas del organismo S. pombe y como DNA molde fue utilizado el promotor del gen ribosomal K5 que posee la caja Homol D. Para llevar a cabo la transcripción se utilizó una RNA Pol II purificada. Los experimentos de transcripción in vitro e inmunodepleción, permitieron observar que la transcripción no ocurre al retirar cualquiera de los factores de transcripción por acción del anticuerpo específico para dicho GTFs. Además los ensayos usando como DNA molde un promotor con la caja Homol D invertida, permitieron observar los mismos resultados, es decir que la transcripción no ocurre al faltar alguno de los GTFs analizados en esta tesis. Al realizar un rescate de la reacción de transcripción, es decir, luego de hacer la inmunodepleción se suplementa el GTFs eliminado, se observó que la reacción ocurría, tanto para la caja Homol D normal como para la invertida, por lo tanto la presencia de todos los GTFs estudiados, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH y TFIIF son necesarios para que se inicie el proceso de transcripción en el promotor K5 que posee la caja Homol D. Para los ensayos EMSA se utilizó extracto de proteínas totales que contenía la proteína con unión a Homol D y anticuerpos contra cada GTF, para realizar una inmunodepleción de ellos y luego se incubó con una sonda de DNA que contenía la caja Homol D marcada con P32γATP. Estos ensayos permitieron observar que los factores de transcripción estudiados no son los que reconocen de manera directa la secuencia de la caja Homol D, ya que a pesar de que ellos son retirados de la reacción se observa la aparición del complejo proteína/Homol D, reflejado como una banda en el film fotográfico. xv De acuerdo al trabajo realizado en este seminario de título, los GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y Srb4 son necesarios para la formación del PIC pero no para el reconocimiento de la caja Homol D en el promotor K5, sugiriendo que existiría otro factor o complejo proteico que reconoce la secuencia de la caja Homol D.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La biomasa lignocelulósica es una materia prima renovable prometedora para la producción de combustibles y productos químicos que está disponible a gran escala. Además, la disminución de las reservas de petróleo, junto con el aumento de las emisiones de gases de efecto invernadero, ha dado lugar a la producción y utilización de biocombustibles. En los últimos años, diversos estudios se han centrado en la investigación de diferentes tecnologías para la producción de bioetanol de segunda generación y productos químicos, siendo los bioprocesos basados en hidrólisis enzimática los que se muestran como la opción prometedora. Una etapa crítica del proceso es la conversión de los residuos lignocelulósicos a azúcares fermentables. La bioconversión de la celulosa es catalizada por un grupo de enzimas denominadas celulasas. En trabajos previos se identificó y clonó el gen codificante para una endoglucanasa desde Trametes versicolor (TvEG). El cDNA codificante para la proteína madura fue completamente secuenciado y clonado en el vector pPIC9K, y se expresó como una enzima extracelular activa en la levadura Pichia pastoris KM71. En el presente estudio, como principal objetivo, se purificó y caracterizó TvEG, y se evaluó su potencial hidrolítico en sustratos celulósicos. La cromatografía de intercambio iónico utilizando un FPLC permitió la purificación y concentración de esta enzima desde el sobrenadante del cultivo. Tras análisis mediante SDS-PAGE, se encontró un tamaño molecular mayor a los 42,3 kDa esperados. La hidrólisis catalizada por TvEG en carboximetilcelulosa (CMC) fue máxima a pH 5,6 y 55ºC. La enzima fue estable en un rango de pH de 3 a 9, y hasta los 55ºC; temperatura sobre la cual la estabilidad disminuyó rápidamente después de la incubación durante 15 min. TvEG tuvo la capacidad de liberar azúcares reductores desde papel filtro, Avicel, xilano y paja xiii de trigo. No obstante, las tasas de liberación en comparación a lo obtenido desde CMC fueron bajas, a excepción de lo obtenido desde Avicel (0,0461%) considerando la alta cristalinidad del sustrato. En conclusión, TvEG es una endoglucanasa mesófila. Esta enzima ha demostrado una alta capacidad para liberar azúcares reductores a partir de celulosa cristalina, por lo que podría tener potenciales aplicaciones en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. / Lignocellulosic biomass is a promising renewable feedstock for production of fuels and chemicals that is available at large scale. In addition, the declined oil reserves together with the increased greenhouse gas emissions, has led to the production and use of biofuels. In the last years, several studies have focused on the research of different technologies for the production of second generation bioethanol and chemicals, being enzymatic hydrolysis bioprocesses shown as the promising option. A critical stage in the process is the conversion of lignocellulosic residues into fermentable sugars. The bioconversion of cellulose is catalyzed by a group of enzymes called cellulases. At previous works the gene coding for an endoglucanase (TvEG) from Trametes versicolor was identified and cloned. The cDNA encoding for the mature protein was completely sequenced and cloned into the pPIC9K vector, and expressed as an active extracellular enzyme in the yeast Pichia pastoris KM71 (Salinas et al, 2011). In the present study, as main objective, TvEG was purified and characterized, and its hydrolytic potential in cellulosic substrates was evaluated. Ion exchange chromatography using FPLC allowed the enzyme purification and concentration from the culture supernatant. After SDS-PAGE analysis, a molecular size higher than the 42,3 kDa expected was found. The hydrolysis catalyzed by TvEG in carboxymethyl cellulose (CMC) was maximal at pH 5,6 and 55°C. The enzyme was stable in a pH range of 3 to 9, and up to 55ºC; above which stability decreased rapidly after incubation for 15 minutes. TvEG had the ability to release reducing sugars from filter paper, Avicel and wheat straw. However, the release rates compared to that obtained from CMC were lower, except for Avicel (0,0461%) considering the substrate high crystallinity. xv In conclusion, TvEG is a mesophilic endoglucanase. This enzyme had been shown a high capacity to release reducing sugars from crystalline cellulose, so could have potential applications in the hydrolysis of lignocellulosic biomass

Los carotenoides son compuestos isoprenoides que en plantas participan durante la fotosíntesis como pigmentos accesorios, protegen contra el daño foto-oxidativo y son precursores del ácido abscísico. En mamíferos los carotenoides son la principal fuente para la síntesis de vitamina A, además de actuar como antioxidantes. Debido a esta vital importancia para plantas y humanos es que se ha enfocado el estudio en la ruta metabólica con el fin de aumentar la cantidad de carotenoides en los alimentos de consumo humano. Se ha descrito que, en la ruta de biosíntesis de carotenoides, la primera enzima de la ruta llamada fitoeno sintasa (PSY) es un punto clave y altamente regulado. En Daucus carota, nuestro modelo de estudio, se han descrito dos genes que codifican a PSY, DcPsy1 y DcPsy2. Estos genes se expresan diferencialmente en hojas y raíz durante el desarrollo de la planta, y además se ha determinado que la región promotora del gen DcPsy2 presenta elementos en cis regulados por luz, fitohormonas y estrés abiótico. Se ha evidenciado la funcionalidad de estos dos genes in vivo al sobreexpresarlos en Nicotiana tabacum, donde promueven un aumento de carotenoides. Sin embargo, no se ha determinado si en la propia D. carota, ambos genes realmente participan en la biosíntesis de carotenoides en hojas y/o raíz, ya que podrían estar cumpliendo una función órgano específica, como sucede en otras plantas. En este seminario de título, se transformaron explantes de D. carota con vectores que permiten la sobreexpresión del gen DcPsy1 y DcPsy2, con el fin de obtener plantas transgénicas que serán utilizadas en futuros análisis de expresión y acumulación de carotenoides. Se obtuvieron exitosamente 11 líneas transgénicas de plantas de D. carota transformadas con el vector que permite la sobreexpresión del gen DcPsy1 y 7 líneas transgénicas de plantas transformadas con el vector para la sobreexpresión del gen DcPsy2. Además, por medio de la expresión en hojas de tabaco de una proteína de fusión entre el producto del gen DcPsy1 y la proteína fluorescente YFP (PSY1:YFP), se determinó que la localización subcelular de la proteína PSY1 es en plastidio. De este modo se comprobó su correcta localización subcelular, lo que aporta un antecedente importante sobre su funcionalidad, dado que los carotenoides se producen en los plastidios de células vegetales. / Carotenoids are isoprenoid compounds that fulfill important functions in plants. They act as accessory pigments during photosynthesis, protect cells against photooxidative damage and are precursors of abscisic acid. In mammals, carotenoids are the main source for the synthesis of vitamin A and have very powerful antioxidant properties. Due to these characteristics, since several years the studies have focused on modifying the metabolic pathway in order to increase the amount of carotenoids in food for human consumption. It has been described that, phytoene synthase (PSY), the first enzyme in the pathway, is a key point of carotenoid synthesis regulation. In Daucus carota, our plant model, two genes coding for PSY have been described, DcPsy1 and DcPsy2. These genes are differentially expressed in leaves and root during plant development. Also, DcPsy2, and not DcPsy1, responds to ABA which correlates with the presence of cis elements that are regulated by light, phytohormones and abiotic stress that are present in the DcPsy2 promoter. The functionality of these two genes has been evidenced in vivo by heterologous expression in Nicotiana tabacum, where they promote an increase of carotenoids. However, it has not been determined in D. carota itself, if both genes actually participate in the biosynthesis of carotenoids in leaves and/or root, since they could be fulfilling different functions in the plant in a specific organ way, as has been reported for other plants. In this work, explants of D. carota were transformed with vectors for DcPsy1 and DcPsy2 overexpression, to obtain transgenic plants that will be used in future functional analysis. We successfully obtained 11 transgenic lines of D. carota plants transformed with the vector for DcPsy1 overexpression and 7 transgenic lines of plants transformed to overexpress DcPsy2 gene. In addition, we generated a construct for DcPsy1 subcellular localization. A fusion protein between the product of the DcPsy1 gene and the fluorescent protein YFP (PSY1:YFP), let us to conclude that DcPSY1 protein has a plastidial localization. This result provides arguments about its functionality because carotenogenic enzymes are located in plant plastids were carotenoids are produced.

Ingeniería en Biotecnología Molecular / Actualmente, el uso de enzimas corresponde a un área de la biotecnología de gran crecimiento y desarrollo, la cual ha buscado dar solución a problemas de tipo industriales, biomédicos y domésticos; representando una solución específica, sustentable y ecológicamente amigable. En el ámbito de la innovación, como parte de una mejora tecnológica se ha buscado obtener enzimas estables y que puedan ser utilizadas en condiciones extremas de pH, temperatura, salinidad etc. Los microorganismos provenientes de ambientes extremos representan una buena fuente de este tipo de enzimas, ya que generalmente estos microorganismos precisan de este tipo de enzimas para la sobrevida en las condiciones hostiles de su hábitat. Un ambiente extremo que ha sido poco explorado en este sentido es el Desierto de Atacama. Conocido por ser el desierto más antiguo y árido del planeta, presenta condiciones ambientales que hacen que sea considerado como un ambiente extremo único en el mundo. Pese a estas condiciones adversas, diversos microorganismos han podido ser aislados desde este ambiente tan particular. Entre ellos esta Streptomyces leeuwenhoekii C34 que presenta varios grados de tolerancia a condiciones extremas. En este trabajo se realizó la búsqueda bioinformática de enzimas de interés comercial en el genoma de S. leeuwenhoekii C34. Teniendo en cuenta el gran potencial biotecnológico y diversidad de aplicaciones de las enzimas lipasas, se seleccionó el gen sle_62990 que codifica para una lipasa putativa GDSL- SGNH. Con el fin de estudiar este gen se generó la cepa LIP de S. leeuwenhoekkii C34 que sobre expresa el gen sle_62990. Con esta cepa se pudo comprobar que el gen sle_62990 codifica para una lipasa extracelular funcional y que presenta actividad contra p-nitrofenil palmitato. También se intentó la expresión heteróloga de la enzima en el medio intracelular de E. coli. Sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados, ya que se encontró en cuerpos de inclusión. / Currently, the use of enzymes corresponds to a growing area in the biotechnology field which has sought to solve industrial, biomedical, and domestic problems. These represent a specific, sustainable and ecologically friendly solution. Stable enzymes that can be used under extreme conditions such as high pH, temperature and salinity are of particular interest for biotechnological improvement. Microorganisms from extreme environments require these types of enzymes in order to survive under the harsh conditions of their habitat. Therefore, they represent a good source of interesting enzymes. An extreme environment that has been little explored is the Atacama Desert. The Atacama Desert is known as the oldest and driest desert on Earth. It presents extreme a environmental conditions. Despite these harsh conditions, various microorganisms have been isolated from this particular environment. Among them Streptomyces leeuwenhoekii C34, that shows several degrees of tolerance to extreme conditions. In this work, possible commercial enzymes were searched in the genome of S. leeuwenhoekii C34. Considering the great biotechnological potential and the diversity of applications of the lipases enzymes the gene sle_62990 that encoded for a putative lipase was selected. In order to study this gene, the LIP strain of S. leeuwenhoekii C34 that over-expressed the sle_62990 was generated. The over-expression allowed to confirm that the sle_62990 gene encodes for a functional extracellular lipase and it has activity against p-nitrophenyl palmitate. Attempts to heterologously express this gene in E. coli were unsuccessful.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La epitranscriptomica es considerada una nueva rama de las ciencias biológicas que tiene como finalidad comprender la regulación de la expresión génica mediada por modificaciones químicas en el ARN. La N6-metiladenosina o m6A, es la modificación interna más abundante descrita en los ARNm. Los miembros de la familia de proteínas YTH han sido descritos como los principales encargados de reconocer la m6A presente en los ARNm y de ejecutar su función. Así, estas proteínas son conocidas como “lectoras” de m6A. En la familia de proteínas YTH existen 5 proteínas de las cuales 4 son citoplasmáticas, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) y una nuclear (YTHDC1). Mientras las proteínas citoplásmicas han sido asociadas con la regulación de la estabilidad, traducción o degradación de los ARNm que poseen m6A, el quinto miembro es nuclear y está involucrada con los procesos de corte y empalme alternativo y la exportación nuclear de ARNm metilados. Debido a que en los últimos años se ha descrito la presencia de m6A en ARNm virales, como es el caso de VIH-1, es que ha surgido el estudio de la epitranscriptómica viral, campo donde es necesario investigar las funciones de las proteínas involucradas. En este contexto, existen datos controversiales en donde se ha reportado que YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3 promueven la expresión génica de VIH-1 mediante el aumento de ARNm viral en las células infectadas e inhiben las etapas tempranas de la infección al inducir la degradación del genoma viral. Sin embargo, aún se desconoce si YTHDC1 o YTHDC2 regulan alguna etapa de la replicación de VIH-1. En este trabajo se planteó determinar la localización y proximidad entre las proteínas lectoras de m6A y el ARNm de VIH-1 a través de hibridación in situ acoplada al ensayo xiii de ligación proximal (ISH-PLA), de las cuales se obtuvo como resultado que YTHDC1 e YTHDF1 interactúan con el ARNm de VIH-1 en la periferia nuclear y región citoplasmática, respectivamente. Mientras que en el caso de YTHDF2 e YTHDF3, las interacciones observadas, no nos permitieron determinar la localización exacta de estas, mediante ISH-PLA. Una vez determinado esto, se escogió la proteína YTHDC1 como objeto de estudio. Se determinó el efecto de la sobreexpresión de esta lectora de m6A en la expresión génica viral analizando los niveles de la poliproteína Gag mediante Western blot y del ARN genómico mediante RT-qPCR. Aunque no se obtuvo consistencia en los resultados obtenidos, estos sugieren que YTHDC1 posiblemente promueve la exportación nuclear del ARN genómico de VIH-1. / The epitranscriptome is consider a new Branch of biology sciences that aims to understand the regulation of gene expression by chemical modifications on the RNA. The N6-methyladenosine or m6A, it is the most abundant inter modification described on the mRNA. The members of YTH proteins family have been described as the main responsible for recognizing m6A present on the mRNA and execute its function. So, these proteins are known as “readers” of m6A. In the YTH protein family exist 5 proteins of which 4 are cytoplasmic, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) and one nuclear (YTHDC1). Meanwhile cytoplasmic proteins have been associated with the stability regulation, translation or degradation of mRNA that m6A possesses, the fifth member is nuclear and is involved in the alternative splicing and the methylated mRNA nuclear export. xiv Because the presence of m6A on viral mRNA has been described in recent years, as in the case of HIV-1, the study of viral epitranscriptome has arisen, a field where it is necessary to investigate the functions of proteins involved. In this context, there are controversial data in where it has been reported that YTHDF1, YTHDF2 and YTHDF3 promote HIV-1 genetic expression by increasing viral mRNA in the infected cells and inhibit the early stage of infection by inducing the degradation of viral genome. However, it is still unknow if YTHDC1 or YTHDC2 regulate any stage of HIV-1 replication. In this work planned to determine the location and proximity among m6A reading proteins and HIV-1 mRNA by in situ hybridization coupled to the proximal ligation assay (ISH-PLA), from which YTHDC1 was obtained as a result and YTHDF1 interact with HIV-1 mRNA in the nuclear periphery and cytoplasmic region, respectively. While in the case of YTHDF2 and YTHDF3, the observed interactions did not allow us to determine the exact location of these, through ISH-PLA. Once it was determined, the YTHDC1 protein was chosen as the object of study. The effect of overexpression of this m6A reader in viral genetic expression was determined by analyzing the Gag polyprotein and genomic RNA by Western blot and RT-qPCR. Although no consistency was obtained in the results obtained, these suggest that YTHDC1 possibility promote the nuclear export of HIV-1 genomic RNA.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / El cerezo (Prunus avium) y el durazno (Prunus persica) corresponden a cultivos de exportación de alta rentabilidad para Chile. Dentro de los diversos factores comerciales asociados al fruto, se encuentran parámetros fisiológicos como el tamaño del fruto, sólidos solubles y tiempo de maduración, algunos de los cuales se conocen como índices de maduración. Estos, son regulados en diversas especies por reguladores del crecimiento de plantas, entre los cuáles se encuentra citoquinina, una fitohormona involucrada en los procesos de división y diferenciación celular. Con el objetivo de estudiar los factores moleculares de cereza y durazno involucrados en la respuesta a citoquinina, en este trabajo se realizaron análisis cuyo objetivo es determinar si en frutos de cereza y durazno los “Top 25 de genes inducidos por citoquinina”, que son fuertemente inducidos por citoquinina en la planta modelo Arabidopsis, mantienen este patrón de expresión frente al tratamiento exógeno de citoquinina. Mediante BLAST bidireccionales, se identificaron 12 y 13 posibles ortólogos de este conjunto de genes en el genoma de Prunus avium y Prunus persica respectivamente, donde 11 de ellos se comparten entre ambas especies. De estos 11 posibles genes ortólogos analizados en la plataforma INTERPROSCAN, todos presentaron los dominios proteicos característicos de las proteínas codificadas por estos genes de Arabidopsis. Además, análisis a nivel genómico de estos posibles ortólogos mostraron que, algunos de estos genes conservan su estructura genómica, mientras que otros divergen entre las especies. Dentro del mismo análisis, se observó que todos los 11 genes presentan elementos en cis de respuesta a citoquinina a lo largo de sus loci. Adicionalmente, algunos presentanelementos en cis de respuesta a giberelina y ácido abscísico, sugiriendo que podrían estar regulados por más de una fitohormona. De estos 11 genes, la localización genética de cinco de ellos se encuentra dentro de algún QTL previamente descrito y localizado en el mapa TxE, mientras que tres de ellos están dentro de un QTL de Ripening, sugiriendo que estos genes podrían estar relacionados con este proceso. Los niveles de transcrito de siete de estos posibles ortólogos fueron medidos mediante RT-qPCR, mostrando que la expresión es inducida por la aplicación exógena de citoquinina en cereza y durazno, y lo hacen en una manera especie específica. Los resultados sugieren que estos genes estarían bajo los mecanismos moleculares por los cuáles la fitohormona citoquinina ejerce su regulación. / In Chile, Sweet cherry (Prunus avium) and Peach (Prunus persica) are high yield export crops. Among the diverse commercial factors associated with these fruits, physiological parameters such as fruit size, soluble solids and the ripening time, some of which are known as indicators for the ripening. These have been described to be regulated in various species by plant growth regulators such as cytokinin. With the aim of studying the molecular factors associated with cytokinin response of sweet cherry and peach, the present study focused on performing analyses to identify if the “Top 25 cytokinin induced genes”, which are strongly modulated by the phytohormones cytokinin in the model plant Arabidopsis thaliana, are conserved in sweet cherry and peach fruits. Using a bidirectional BLAST, 12 and 13, putative orthologous of this set of genes were identified in the Prunus avium and Prunus persica genomes, respectively, 11 of which are conserved between both species. Of these 11 putative orthologous genes analyzed in the INTERPROSCAN platform, they all presented the protein domains characteristic of the proteins encoded by Arabidopsis genes. Additionally, analysis of these putative orthologous at the genomic level revealed that, some of these genes are conserved in the genomic structure, while others diverge between the species. Within the same analysis, these 11 genes have cis-regulatory elements to cytokinin throughout their loci. Additionally, some have gibberellin and abscisic acid responsive cis-regulatory elements, suggesting that they could be regulated by more than one phytohormone. Of these 11 genes, five of them are located in a QTL previously described and positioned on the TxE map, while three of them are in a Ripening QTL, suggesting that these genes could be related to the ripening process. The transcript levels of seven of these putative orthologous were measured by RT-qPCR, showing that the expression is induced by exogenous application of cytokinin in sweet cherry and peach, and they do so in a species-specific manner. The results suggest that these genes are candidate genes possibly responsible for the underlying molecular mechanisms by which the phytohormone cytokinin exerts its regulation. / Los recursos materiales y el financiamiento fueron proporcionados por el Laboratorio de Genética Molecular Vegetal del Instituto de Nutrición y Tecnología en Alimentos (INTA) bajo el Proyecto FONDECYT #1171016 y bajo el Proyecto ENLACE, VID Universidad de Chile ENL006/2016.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es capaz de sintetizar astaxantina, un carotenoide utilizado en la industria acuícola. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. El ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) es un componente de las membranas celulares de los hongos y el producto final de la ruta de esteroles. Ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. Se ha visto que la regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles está relacionada, ya que la deleción del gen CYP61 que participa en la síntesis de ergosterol (mutante CBS-6938cyp61-), resultó en un fenotipo que sobreproduce carotenoides. Estas observaciones podrían ser explicadas por un efecto negativo del ergosterol sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides y esteroles, especialmente a nivel de la transcripción de genes de la ruta del mevalonato como el gen HMGR. Es así como en este seminario de título se planteó poner a prueba dicha hipótesis construyendo otros mutantes de la biosíntesis de ergosterol (mutantes de los genes ERG3 y ERG4) para evaluar si estos mantienen el mismo fenotipo que la mutante CBS-6938cyp61- (ausencia de ergosterol y sobreproducción de carotenoides). Mediante análisis bioinformático se identificaron los genes ERG3 y ERG4 de X. dendrorhous y se construyeron los plásmidos para la deleción de ambos genes en la cepa CBS-6938, obteniendo las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. Se evaluó el fenotipo de las mutantes con respecto a la cepa CBS-6938 mediante análisis xiii de carotenoides y esteroles totales, obrservando un aumento en los niveles de esteroles, aunque no se afectó el nivel de carotenoides totales. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGS, el cual posiblemente es regulado por vía SREBP en X. dendrorhous, donde solo observó un aumento en el nivel de transcrito de este gen en la mutante del gen ERG4. Además, las cepas mutantes presentaron una disminución en el crecimiento en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol y el antifúngico Anfotericina B. Los resultados indican que la via SREBP no se encuentra activa en las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. En conclusión, no es la ausencia de ergosterol lo que estaría activando la via SREBP, sino más bien la acumulación de esteroles específicos como sería el caso la cepa CBS-6938cyp61-. / The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid used in the aquaculture industry. This pigment is synthesized from metabolites of the mevalonate pathway, which are also necessary for the synthesis of sterols. Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) is a component of fungal cell membranes and the final product of the sterol pathway. Both routes have been reported to be regulated by the SREBP pathway, which in mammals regulates cholesterol levels in cells. In fungi the SREBP pathway is conserved, as in the yeast Schizosaccharomyces pombe where the transcription factor Sre1N regulates the synthesis of sterols and the response to hypoxia. It has been found that the regulation of the biosynthetic pathways of carotenoids and sterols is related, since the deletion of the CYP61 gene involved in the synthesis of ergosterol (mutant CBS-6938cyp61-), resulted in a phenotype that overproduces carotenoids. These observations could be explained by a negative effect of ergosterol on the regulation of the biosynthesis of carotenoids and sterols, especially at the level of the transcription of genes of the mevalonate route such as the HMGR gene. Thus, in this work it was proposed to test this hypothesis by the mutation other mutants of ergosterol biosynthesis (mutants of the ERG3 and ERG4 genes) to evaluate whether they maintain the same phenotype as the mutant CBS-6938cyp61- (absence of ergosterol and overproduction of carotenoids). By bioinformatic analysis, the ERG3 and ERG4 genes of X. dendrorhous were identified and the plasmids were constructed for the deletion of both genes in strain CBS-6938, obtaining the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. The phenotype of the mutants was evaluated with respect to the aforementioned strain CBS-6938 by analysis xv of carotenoids production and total sterols, were an increase in sterol levels was observed although no change was observed in total carotenoids. . An expression analysis was also performed by RT-qPCR of the HMGS gene, which is suggested to be regulated via SREBP in X. dendrorhous. In this case, the mutants presented only increase in the transcript level in the mutant of ERG4. In addition, a decrease in the growth of the mutant strains was observed in the presence of the azoles clotrimazole and ketoconazole and the antifungal agent Amphotericin B. The results indicate that the SREBP pathway is not active in the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. In conclusion, it is not the absence of ergosterol that would be activating the SREBP pathway, but rather the accumulation of specific sterols as would be the case with the strain CBS-6938cyp61-.

Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las células madre mesenquimales (MSC) son un grupo heterogéneo de células multipotentes que han adquirido gran importancia en el último tiempo debido a su potencial aplicación en el desarrollo de terapias celulares. La principal limitante para estos tratamientos ha resultado ser la dificultad para el aislamiento de un número suficiente de células para los procedimientos propuestos. Recientemente, se ha identificado una población de estas células en el fluido menstrual, lo que permitiría superar esta dificultad. Las células madre aisladas desde fluido menstrual (MenSC) son una población de MSC cuyo aislamiento poco invasivo y regularidad de obtención las ubican en una posición ideal para el desarrollo de terapias celulares. Entre las características más destacadas de este tipo celular se encuentran una alta tasa proliferativa, una alta estabilidad cariotípica y buenas propiedades pro-angiogénicas y migratorias. Sin embargo, aún se desconocen gran parte de las propiedades y funciones de las MenSC, especialmente las relacionadas al nicho en donde se encuentran. Con respecto a este nicho, es posible hipotetisar que uno de los procesos en el cual las MenSC podrían tener un rol regulatorio correspondería a la implantación embrionaria, que a su vez está regulada por los cambios hormonales del ciclo menstrual que generan un endometrio receptivo, capaz de interactuar con el embrión y permitir la implantación. Por lo tanto, se investigaron los efectos de los cambios hormonales del ciclo menstrual sobre las MenSC aisladas de pacientes sanas, con el fin de evaluar cambios fenotípicos, especialmente los referidos (directa o indirectamente) al proceso de la implantación embrionaria. Para esto se cultivaron MenSC en condiciones que imitan el contexto hormonal que ocurre durante el ciclo menstrual, es decir, las concentraciones de Estrógeno y Progesterona tanto de la ovulación como del periodo de máxima 2 receptividad uterina, conocido como “ventana de implantación”. Los primeros genes analizados fueron aquellos que han sido reportados repetidamente como importantes para la ventana de implantación, tal es el caso del factor inhibidor de leucemia (LIF), Factor de Crecimiento Vascular Endotelial A (VEGFa), Factor de Crecimiento Transformante beta 1 (TGF-β), y Homeobox A-10 (HOXA-10). De los cuatro marcadores investigados solo LIF presentó diferencias significativas respecto al control al tratar a las MenSC con las concentraciones de Progesterona y Estradiol que imitan la ovulación y la ventana de implantación. Las segundas características evaluadas, fueron las propiedades pro-migratorias y pro-angiogénicas de las MenSC en respuesta a las hormonas del ciclo menstrual. Las MenSC estimuladas con las diferentes concentraciones de hormonas no presentaron diferencias significativas en su capacidad migratoria independientemente del tratamiento realizado. Por el contrario, tanto la capacidad de las MenSC de inducir la generación túbulos en células endoteliales de cordón umbilical, como la expresión de los marcadores pro-angiogénicos Endoglina (CD105) y Factor de Crecimiento de Fibroblastos 2 (FGF-2) presentaron diferencias significativas respecto al control al tratar a las MenSC con las concentraciones de Progesterona y Estradiol que se suceden desde la ovulación hasta la ventana de receptividad del ciclo menstrual. Estos resultados apoyan la posibilidad de que las MenSC podrían estar participando en procesos relevantes para la implantación del embrión como son los procesos de angiogenesis. Este conocimiento podría ser importante para entender de mejor manera el rol de las MenSC en la regulación del proceso fisiológico de la implantación, como su participación en los procesos fisiopatológicos relacionados con ella, abriendo la puerta a potenciales usos como marcadores de enfermedades relacionadas a la implantación o a la generación de terapias celulares basadas en sus propiedades. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous group of multipotent cells that have acquired great importance in recent years due to their potential application in the development of cellular therapies. The main limitation for these treatments has been the difficulty in isolating enough cells for the proposed procedures. Recently, a population of these cells has been identified in the menstrual fluid, which would allow to overcome this difficulty. Stem cells isolated from menstrual fluid (MenSC) are a population of MSCs whose minimally invasive isolation and regularity of collection place them in an ideal position for the development of cellular therapies. Among the most outstanding features of this cell type are a high proliferative rate, high karyotype stability and good proangiogenic and migratory properties. However, much of the properties and functions of the MenSC, especially those related to the niche in which they are found, are still unknown. Regarding this niche, it is possible to hypothesize that one of the processes in which the MenSC could have a regulatory role would correspond to the embryonic implantation, which in turn is regulated by the hormonal changes of the menstrual cycle that generate a receptive endometrium, capable of interacting with the embryo and allowing implantation. Hence, the effects of the hormonal changes of the menstrual cycle on the MenSC isolated from healthy patients were investigated to evaluate for phenotypic changes, especially those referred (directly or indirectly) to the process of embryo implantation. For this, MenSC were cultured in conditions that mimic the hormonal context that occurs during the menstrual cycle, i.e. the estrogen and progesterone concentrations of both the ovulation and the period of maximum uterine receptivity, known as the "implantation window". The first genes analyzed were those that have been repeatedly reported as important for the implantation window, such as Leukemia 4 Inhibitory Factor (LIF), Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGFa), Transforming Growth Factor beta 1 (TGF -β) and Homeobox A-10 (HOXA-10). Of the four markers investigated, only LIF showed significant differences compared to the control when treating the MenSC with the concentrations of Progesterone and Estradiol that mimic the ovulation and the implantation window. The following characteristics evaluated were the pro-migratory and pro-angiogenic properties of MenSC in response to menstrual cycle hormones. MenSC stimulated with the different concentrations of hormones did not present significant differences in their migratory capacity regardless of the treatment performed. In contrast, both the ability of MenSC to induce tubule generation in umbilical cord endothelial cells (HUVEC) and the expression of the pro-angiogenic markers Endoglin (CD105) and Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) showed significant differences in respect of the control when treating the MenSC with the concentrations of Progesterone and Estradiol that transpire since the ovulation to the window of receptivity of the menstrual cycle. These results support the possibility that the MenSC could be involved in processes relevant to the implantation of the embryo such as the process of angiogenesis. This knowledge could be important to better understand the role of the MenSC in the regulation of the physiological process of implantation, as well as its participation in the pathophysiological processes related to it, opening the door to potential uses as markers of diseases related to implantation or the generation of cellular therapies based on their properties.

Ingeniería en Biotecnología Molecular / El sistema nacional de investigación posee financiamiento a través de fondos concursables principalmente individuales como los proyectos FONDECYT y proyectos colaborativos (entre distintas instituciones de educación superior que requieren de trabajo multi e interdisciplinario)como lo son los Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia. En Chile existen tres programas de Centros de Excelencia: Programa de Financiamiento Basal, FONDAP e Institutos Milenio, los cuales deben cumplir con ciertos estándares tales como la producción científica de excelencia, formación de redes internacionales, formación de capital humano avanzado, difusión del conocimiento generado al medio, entre otros. Estos centros poseen una duración limitada, dada la inexistencia de una política nacional de centros de investigación que de sustentabilidad a este tipo de proyectos. El objetivo de este seminario de título es evaluar qué factores afectan a la sustentabilidad de los Centros de Excelencia a través de una metodología de carácter mixto. Para ello se revisaron en una primera instancia fuentes primarias para obtener información del estado del arte de estos centros. Luego se elaboraron indicadores de los objetivos que estas instituciones deben cumplir, los cuales fueron utilizados en las entrevistas realizadas a 17 directores de Centros de Excelencia nacionales. Además se llevó a cabo un análisis cuantitativo en relación al presupuesto en ciencia, tecnología, innovación y emprendimiento, además del número de proyectos FONDECYT concursados y adjudicados entre los años 2009-2016. Al evaluar qué factores afectan la sustentabilidad de los Centros de Excelencia se encontró que elementos externos del sistema nacional de investigación, tal como la disgregación entre los distintos fondos de financiamiento, la competitividad al momento de postular a proyectos de investigación individual y deficiencias en el diseño de la 2 política pública de inserción del capital humano avanzado, afectan en una escala más particular a la sustentabilidad de los Centros de Excelencia, a través de elementos como la disgregación entre las agencias que coordinan los programas, la competitividad entre los grupos de investigadores insertos en distintas instituciones de educación superior y una falta de política pública de sustentabilidad más allá del financiamiento estatal. / The national research system has funding through mainly individual funds, such as FONDECYT projects, to collaborative projects between different institutions of higher education that require multidisciplinary and multidisciplinary work, such as the scientific and technological centers of excellence. In Chile, there are three centers of excellence programs: Basal Financing Program, FONDAP and Institutes Millennium, which must meet certain standards such as scientific production of excellence, international networking, advanced human capital formation and dissemination of knowledge generated at, among others. These centers have a limited duration, without there being a national policy of research centers that sustainability to this type of projects. The objective of this seminar is to assess what factors affect the sustainability of centers of excellence and the methodology used is mixed. For this purpose, primary sources were reviewed in order to obtain information on the state of the art of these centers, and then to elaborate indicators of the objectives that these institutions must meet, which were used in interviews with 17 directors of national excellence centers. In addition, a quantitative analysis was carried out in relation to the budget for science, technology, innovation and entrepreneurship, as well as the number of FONDECYT projects awarded and awarded between 2009-2016. In assessing which factors affect the sustainability of centers of excellence, it was found that external elements of the national research system, such as the disaggregation between different financing funds, competitiveness when applying for individual research projects and design gaps of the public policy of insertion of advanced human capital, affect on a more particular scale the sustainability of the centers of excellence, through elements such as the disintegration between the agencies that coordinate the 4 programs, the competitiveness among the groups of researchers inserted in different institutions of higher education and a lack of public policy of sustainability beyond state funding. / Enero 2018