Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La epitranscriptomica es considerada una nueva rama de las ciencias biológicas que tiene como finalidad comprender la regulación de la expresión génica mediada por modificaciones químicas en el ARN. La N6-metiladenosina o m6A, es la modificación interna más abundante descrita en los ARNm. Los miembros de la familia de proteínas YTH han sido descritos como los principales encargados de reconocer la m6A presente en los ARNm y de ejecutar su función. Así, estas proteínas son conocidas como “lectoras” de m6A. En la familia de proteínas YTH existen 5 proteínas de las cuales 4 son citoplasmáticas, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) y una nuclear (YTHDC1). Mientras las proteínas citoplásmicas han sido asociadas con la regulación de la estabilidad, traducción o degradación de los ARNm que poseen m6A, el quinto miembro es nuclear y está involucrada con los procesos de corte y empalme alternativo y la exportación nuclear de ARNm metilados. Debido a que en los últimos años se ha descrito la presencia de m6A en ARNm virales, como es el caso de VIH-1, es que ha surgido el estudio de la epitranscriptómica viral, campo donde es necesario investigar las funciones de las proteínas involucradas. En este contexto, existen datos controversiales en donde se ha reportado que YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3 promueven la expresión génica de VIH-1 mediante el aumento de ARNm viral en las células infectadas e inhiben las etapas tempranas de la infección al inducir la degradación del genoma viral. Sin embargo, aún se desconoce si YTHDC1 o YTHDC2 regulan alguna etapa de la replicación de VIH-1. En este trabajo se planteó determinar la localización y proximidad entre las proteínas lectoras de m6A y el ARNm de VIH-1 a través de hibridación in situ acoplada al ensayo xiii de ligación proximal (ISH-PLA), de las cuales se obtuvo como resultado que YTHDC1 e YTHDF1 interactúan con el ARNm de VIH-1 en la periferia nuclear y región citoplasmática, respectivamente. Mientras que en el caso de YTHDF2 e YTHDF3, las interacciones observadas, no nos permitieron determinar la localización exacta de estas, mediante ISH-PLA. Una vez determinado esto, se escogió la proteína YTHDC1 como objeto de estudio. Se determinó el efecto de la sobreexpresión de esta lectora de m6A en la expresión génica viral analizando los niveles de la poliproteína Gag mediante Western blot y del ARN genómico mediante RT-qPCR. Aunque no se obtuvo consistencia en los resultados obtenidos, estos sugieren que YTHDC1 posiblemente promueve la exportación nuclear del ARN genómico de VIH-1. / The epitranscriptome is consider a new Branch of biology sciences that aims to understand the regulation of gene expression by chemical modifications on the RNA. The N6-methyladenosine or m6A, it is the most abundant inter modification described on the mRNA. The members of YTH proteins family have been described as the main responsible for recognizing m6A present on the mRNA and execute its function. So, these proteins are known as “readers” of m6A. In the YTH protein family exist 5 proteins of which 4 are cytoplasmic, (YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 e YTHDC2) and one nuclear (YTHDC1). Meanwhile cytoplasmic proteins have been associated with the stability regulation, translation or degradation of mRNA that m6A possesses, the fifth member is nuclear and is involved in the alternative splicing and the methylated mRNA nuclear export. xiv Because the presence of m6A on viral mRNA has been described in recent years, as in the case of HIV-1, the study of viral epitranscriptome has arisen, a field where it is necessary to investigate the functions of proteins involved. In this context, there are controversial data in where it has been reported that YTHDF1, YTHDF2 and YTHDF3 promote HIV-1 genetic expression by increasing viral mRNA in the infected cells and inhibit the early stage of infection by inducing the degradation of viral genome. However, it is still unknow if YTHDC1 or YTHDC2 regulate any stage of HIV-1 replication. In this work planned to determine the location and proximity among m6A reading proteins and HIV-1 mRNA by in situ hybridization coupled to the proximal ligation assay (ISH-PLA), from which YTHDC1 was obtained as a result and YTHDF1 interact with HIV-1 mRNA in the nuclear periphery and cytoplasmic region, respectively. While in the case of YTHDF2 and YTHDF3, the observed interactions did not allow us to determine the exact location of these, through ISH-PLA. Once it was determined, the YTHDC1 protein was chosen as the object of study. The effect of overexpression of this m6A reader in viral genetic expression was determined by analyzing the Gag polyprotein and genomic RNA by Western blot and RT-qPCR. Although no consistency was obtained in the results obtained, these suggest that YTHDC1 possibility promote the nuclear export of HIV-1 genomic RNA.

Le virus de l'hépatite C (VHC) infecte plus de 170 millions de personnes dans le monde. À l'heure actuelle, les thérapies utilisées contre ce virus sont insatisfaisantes. La protéine de la capside (C) du VHC est impliquée dans l'assemblage viral et l'encapsidation du génome. Les domaines chargés positivement de la moitié NH2-terminale de la protéine C (C 1-82) sont suspectés être responsables de l'interaction avec l'ARN viral génomique. Dans cette étude, différents mutants (ponctuels et de délétion) de la C 1-82 ont été générés et exprimés dans E. coli afin d'identifier une (des) région(s) de la protéine essentielle(s) pour l'assemblage viral. Or, tous les mutants produits dans cette étude ne sont affectés ni dans la reconnaissance de l'ARN ni dans la formation de pseudo-nucléocapsides virales (PNV). Ces résultats suggèrent que c'est la charge globale de la protéine qui est importante pour l'interaction avec l'ARN et non une région précise dans la portion NH2-terminale.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) ont été détectés plusieurs fois dans les petits fruits, tandis que le HuNoV, le VHA et le virus de l'hépatite E (VHE) ont été associés à des épisodes de contamination des huîtres et des moules dans les dernières années. Ces virus sont principalement transmis par la voie féco-orale, mais le VHE peut également être transmis par voie zoonotique. Le HuNoV et le VHA peuvent contaminer les aliments via l'eau, notamment lors de l'irrigation avec de l'eau contaminée ou en cas de déversement dans les zones de production. De plus, le VHE peut être transmis aux aliments par les fèces d'animaux contaminés. Cependant, les connaissances sur la contamination des aliments cultivés au Québec par ces virus sont limitées. Le but de ce projet était d'évaluer la contamination des canneberges par le HuNoV et le VHA ainsi que celle des huîtres par le HuNoV, le VHA et le VHE, entre deux zones de production. Pour ce faire, 234 échantillons de canneberges ont été récoltés chez 44 producteurs québécois et 260 huîtres ont été prélevées près de la côte, et 260 huîtres au large de la côte des Îles-de-la-Madeleine, chaque échantillon étant représenté par 10 huîtres. L'ARN viral a été détecté et quantifié par détection moléculaire, en respectant la méthodologie de la méthode ISO 15216-1 : 2017. Parmi les 234 échantillons de canneberges testés, seulement trois étaient positifs au HuNoV GI (1,28 %). Aucun des 52 échantillons d'huîtres n'a été considéré comme positif pour le HuNoV, le VHA ou le VHE. Ces résultats suggèrent que le risque de contamination par des canneberges et des huîtres cultivées au Québec est faible et que la contamination des huîtres près de la côte n'est pas significativement différente de celle des huîtres au large de la côte. / Human norovirus (HuNoV), hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) have been the cause of many global epidemics, such as those caused by HuNoV and HAV in berries or even HuNoV, HAV and HEV in shellfish in recent years. These viruses are primarily transmitted through the fecal-oral route, although HEV can also be transmitted through zoonotic routes. HuNoV and HAV can contaminate food through water, especially during irrigation with contaminated water when spilled in production areas. In addition, HEV can be transmitted to food through contaminated water but also when in contact with contaminated animal feces. However, limited information is available on the contamination of food grown in Quebec by these foodborne viruses. The objective of this project was to evaluate the levels of HuNoV and HAV contamination in cranberries, as well as levels of HuNoV, HAV and HEV contamination in oysters, between two production areas. For this purpose, 234 cranberry samples were collected from 44 Quebec producers. As for molluscs, 260 oysters were obtained near the coast and 260 oysters were collected offshore of Magdalen Islands, each sample consisting of 10 oysters. The presence of viral RNA was detected and quantified using molecular detection methods in accordance with ISO 15216-1:2017. Among the 234 cranberry samples tested, only three were positive for HuNoV GI (1.28%). None of the 52 oyster samples were found to be positive for HuNoV, HAV or HEV. These findings suggest that the risk of contamination of cranberries and oysters cultivated in Quebec is low, and that there is no significant difference in contamination between oysters near the coast and those offshore in this project.

Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) sont souvent associés à des maladies d'origine alimentaire incriminants des aliments minimalement transformés. Comme les méthodes de culture virale demeurent limitées pour une utilisation de routine, il est nécessaire de concentrer les virions présents à la surface des aliments avant leur détection. Le but ultime de cette étape est de séparer les virus de la matrice alimentaire, de les concentrer et d'éliminer les inhibiteurs pouvant affecter la détection. L'organisation internationale de normalisation (ISO) a publié des procédures de détection des virus dans les aliments. Cependant, elles varient grandement en fonction des aliments étudiés, tout en étant longues et laborieuses. Elles nécessitent aussi du personnel qualifié et comportent plusieurs étapes risquant de réduire la récupération virale, cela rendant leur utilisation difficile comme analyse de routine. C'est pourquoi le développement d'étapes de concentration, de purification et d'extraction du matériel génétique rapides et sensibles, limitant les étapes manuelles s'avère nécessaire. Le premier objectif de ce projet était de développer une nouvelle approche de concentration des virus en vue d'une meilleure surveillance dans les aliments. L'approche développée se base sur l'ultrafiltration pour une récupération des particules virales à la suite de leur élution de la surface d'aliments. La méthode optimisée a, par la suite, été comparée à la méthode de référence ISO 15 216-1 :2017 en utilisant des fraises, framboises et mûres fraîches et congelées ainsi que de la laitue et des oignons verts frais. Les résultats ont montré une réduction importante du temps d'expérimentation face à la méthode de référence, tout en conservant une détection à des faibles concentrations de VHA et des HuNoVs. Sauf pour la framboise, la méthode d'ultrafiltration était généralement équivalente à la méthode de référence, quel que soit le virus testé. Le deuxième objectif avait pour but de comparer une nouvelle méthode d'extraction automatisée optimisée pour les HuNoVs GI et GII puis le VHA à une méthode du commerce semi-automatisée applicable sur plusieurs matrices alimentaires à risque. Pour les framboises fraîches, les huîtres et la laitue romaine, les deux plateformes d'extraction ont été jugées équivalentes. Tandis que la méthode automatisée a permis une meilleure récupération pour les framboises congelées et une inhibition moindre pour les échantillons de mûres congelées. Le troisième objectif avait finalement pour but d'évaluer la persistance d'ARN de VHA provenant de virions inactivés à la chaleur. L'ARN était dilué à différentes concentrations puis ajouté à des solutions (eau et tampon phosphate salin) ou déposé sur des surfaces (acier inoxydable, polychlorure de vinyle et bleuets). La persistance de l'ARN était mesurée à différentes températures d'entreposage (-80 °C, -20 °C, 4 °C et 23 °C) sur une période de 90 Jours. En solution, sur le polychlorure de vinyle et sur les bleuets, l'ARN a été détecté dans la plupart des conditions jusqu'à 90 jours d'entreposage. Les résultats suggèrent cependant une dégradation plus rapide de l'ARN viral sur l'acier inoxydable. En conclusion, les résultats de cette thèse permettent de proposer une application de ces protocoles de concentration et d'extraction dans un contexte de routine, tout en mettant en lumière les enjeux liés à la persistance de l'ARN viral dans l'analyse des résultats de détection de virus dans les aliments. / Human norovirus (HuNoV) and hepatitis A virus (HAV) are often associated with foodborne illnesses involving minimally processed foods. As viral culture methods remain limited for routine use, it is necessary to concentrate virions present on foods before their detection. The goal of this step is to separate the viruses from the food matrix, to concentrate them and to eliminate inhibitors that may affect detection. The International Organization for Standardization (ISO) has published procedures for detecting viruses in food. However, they vary considerably depending on the foods to study, while being long and laborious. They also require trained personnel and involve several steps that may reduce viral recovery, making them difficult to use in routine analysis. This is why the development of rapid and sensitive concentration, purification, and extraction steps for genetic material, limiting manual steps, is necessary. The first objective of this project was to develop a new approach of virus concentration based on ultrafiltration of the eluted viral particles from the surface of food. The optimized method was subsequently compared to the reference method ISO 15 216-1:2017 using fresh and frozen strawberries, raspberries, and blackberries as well as fresh lettuce and green onions. The results showed a reduction in experimental time compared to the reference method, while maintaining detection at low concentrations of HAV and HuNoVs. Except for raspberry, the ultrafiltration method was generally equivalent to the reference method, regardless of the virus tested. The second objective was to compare a new automated extraction method optimized for VHA, HuNoVs GI and GII to a commercial semi-automated method applicable to several high-risk food matrices. For fresh raspberries, oysters, and romaine lettuce, the two extraction platforms were considered equivalent. While the automated method provided better recovery for frozen raspberries and less inhibition for frozen blackberry samples. The third objective was to evaluate the persistence of HAV RNA from heat-inactivated virions. RNA was diluted in water to different concentrations and then added to solutions (water and phosphate buffer saline) or laid on surfaces (stainless steel, polyvinyl chloride, and blueberries). RNA presence was measured at different storage temperatures (-80°C, - 20°C, 4°C and 23°C) over a period of 90 days. In solution, on polyvinyl chloride and on blueberries, RNA was detected under most conditions for up to 90 days of storage. The results, however, showed a faster degradation of viral RNA on stainless steel. In conclusion, these concentration and extraction methods could be suitable for routine analysis of viruses throughout the food production and surveillance chain. The findings of this study also highlight the challenges associated with the persistence of viral RNA when interpreting results from virus detection in food.

Le virus de la grippe A est un virus à ARN négatif appartenant à la famille des Orthomyxoviriadea dont la réplication se produit dans le noyau des cellules infectées. L'organisation du génome est segmentée en huit segments d'ARNv de polarité négative, codant pour un minimum de 16 protéines virales différentes. Ces ARN viraux (ARNv) sont en complexe avec de nombreuses copies de nucléoprotéines et liés par leurs extrémités 5' et 3' au complexe hétérotrimérique de l'ARN-polymérase ARN-dépendante composé des sous unités PA, PB1 et PB2. Cet assemblage macromoléculaire (ARNv / polymérase / NP) nommée Ribonucléoprotéine (RNP) constitue une entité génomique indépendante. Dans le contexte de la RNP, l'ARN-polymérase assure à la fois la transcription et la réplication du génome ARNv. En assurant ces deux fonctions, l'ARN-polymérase joue un rôle majeur dans la réplication virale et constitue une cible antivirale privilégiée. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse se concentrent sur les éléments structuraux participants à l'assemblage de l'ARN polymérase et son interaction avec les avec les ARNv. Pour atteindre ces objectifs, notre laboratoire, en collaboration avec d'autres groupes, a mis en place un système d'expression en polyprotéines permettant d'exprimer la polymérase. Plus encore, cette méthode a aussi permis de reconstituer des complexes entre l'ARN-polymérase et des partenaires cellulaires, notamment RanBP5 qui appartient à la famille des importines-β. / Influenza A virus is a negative-strand RNA virus belonging to the Orthomyxoviriadea family whose replication occurs in the nucleus of infected cells. The genome organisation of influenza virus is segmented in eight vRNA segments of negative polarity coding for at least 16 different viral proteins. Each vRNA is bound to multiple copies of nucleoprotein (NP) and to the heterotrimeric RNA-dependent RNA-polymerase complex (PA, PB1 and PB2) through its 5' and 3' extremities. This macromolecular assembly (vRNA/polymerase/NP) forms the ribonucleoprotein (RNP) particle, which acts as a separate genomic entity within the virion. The RNP complex is at the core of viral replication and in the context of RNPs, the polymerase performs both transcription and replication of the vRNA genome. As such, the polymerase constitutes a major antiviral drug target. The research work presented within this thesis focuses on the underlying determinants of the RNA polymerase assembly process and its interaction with its vRNA genome. To fulfill these goals, our lab, in collaboration with other groups, has set up a novel polyprotein expression system to express the polymerase but also to reconstitute polymerase and cellular partner complexes, notably RanBP5, which belongs to the importin-β family.

Le réovirus de mammifères est un virus oncolytique à l’étude pour sa capacité à infecter et détruire préférentiellement les cellules cancéreuses. Les liens entre le potentiel oncolytique du réovirus et son induction des voies de signalisation de l’interféron méritent des éclaircissements. Encore à ce jour, les déterminants viraux et les composantes cellulaires impliqués dans la réponse interféron lors de l’infection par ce virus demeurent à être mieux caractérisés. Des virus mutants ont préalablement été générés à partir d’un virus fortement inducteur d’interféron (T3DK) dans le fond génétique d’un virus faiblement inducteur d’interféron (T3DS) afin d’étudier les effets de certains polymorphismes. Cependant, les mécanismes de ces déterminants viraux et comment leurs polymorphismes les modifient pour amplifier ou restreindre l’induction d’interféron sont encore incertains. Notre approche a permis de révéler que les protéines μ2 et λ1 du réovirus modulent les événements précoces menant à la reconnaissance virale et à la réponse interféron. Nous avons découvert que le phénotype d’induction d’interféron sous l’effet de μ2, λ1 ou μ2 et λ1 provenant de T3DK était corrélé entre les niveaux protéiques et transcriptionnels. De plus, la présence simultanée de μ2 et λ1 (de T3DK) avait un effet synergique provoquant des niveaux d’interféron plus qu’additifs par rapport à la présence de μ2 ou de λ1 seuls. D’autre part, la transfection d’ARN extrait tôt de cellules infectées (mais pas celle d’ARN extrait tardivement) provoque une induction d’interféron qui suit cette même tendance. Par conséquent, les résultats démontrent que plusieurs protéines du réovirus pourraient s’acquitter de rôles multiples qui convergent vers la modulation de la réponse interféron. Cela laisse paraître les rôles envisageables de μ2 et λ1 dans le désassemblage, la participation à l’exposition du génome viral et/ou dans la contribution au sein du complexe de transcription viral. L’analyse comparative de virus mutants conçus par génétique inverse et qui sont à même de contrôler la réponse interféron semble une piste intéressante pour mieux appréhender les implications des polymorphismes dont ils sont porteurs. Cette approche pourrait fournir une meilleure compréhension du réovirus et être utile dans la perspective d’optimisation du potentiel oncolytique du réovirus. / The mammalian reovirus is an oncolytic virus under study for its ability to preferentially infect and destroy cancer cells. The links between the oncolytic potential of reovirus and its induction of interferon signaling pathways require clarification. Still to this day, the viral determinants and cellular components involved in the interferon response upon infection with this virus remain to be better characterized. Mutant viruses were previously generated from a high interferon-inducing virus (T3DK) in the genetic background of a low interferon-inducing virus, (T3DS) to study the effect of certain polymorphisms. However, the mechanisms of these viral determinants and how their polymorphism modify them to amplify or limit interferon induction are still unclear. Our approach revealed that the μ2 and λ1 proteins modulate early events leading to viral recognition and interferon response. We found that the phenotype of interferon induction under the effect of μ2, λ1 or μ2 and λ1 from T3DK showed a correlation between protein and transcriptional levels. Furthermore, the simultaneous presence of μ2 and λ1 (from T3DK) had a synergistic effect causing more than additive interferon levels compared with the presence of μ2 or λ1 alone. On the other hand, transfection of RNA extracted from early-infected cells (but not RNA extracted from late-infected cells) caused interferon induction following this same trend. Therefore, the results demonstrate that several proteins from reovirus could have multiple roles that converge to modulate the interferon response. This suggests potential roles for μ2 and λ1 in disassembly, participation in viral genome exposure, and/or contribution within the viral transcription complex. The comparative analysis of mutant viruses engineered by reverse genetics, and which are able to modulate the interferon response, would be an interesting avenue to better understand the implications of the polymorphisms they carry. This approach could provide a better understanding of the reovirus and be useful in the perspective of optimizing the oncolytic potential of this virus.

Du fait de leur présence à la surface de la particule virale, les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 du virus HCV jouent un rôle essentiel dans sa morphogenèse ainsi que lors de son entrée dans la cellule hôte. Jusqu’à récemment, les travaux de recherche sur les glycoprotéines d’enveloppe du virus HCV se sont essentiellement focalisés sur E2 car elle est la protéine d’attachement du virus. De plus, elle est la cible majeure des anticorps neutralisants et il a été longtemps postulé qu’elle était la protéine de fusion du virus. Cependant, les récentes publications de la structure de E2 ne mettent pas en évidence la présence d’un peptide de fusion et sa structure ne correspond pas aux critères attendus pour une protéine de fusion, suggérant que la glycoprotéine E1 seule ou en association avec E2 pourrait être responsable de l’étape de fusion. La structure de la région N-terminale de E1 (acides aminés 192 à 270) a récemment été résolue et a mis en évidence la présence d’une épingle à cheveux formée par 2 feuillets beta (β1 et β2) suivie par un segment de 16 acides aminés qui forme une hélice alpha (α1) flanquant 3 feuillets beta antiparallèles (β3, β4 et β5). En plus de la caractérisation de ces structures secondaires de E1, une région qui se situe au milieu de la protéine (approximativement entre les résidus 274 et 292) a été proposée avoir un rôle actif au cours du processus de fusion et elle pourrait correspondre à un peptide de fusion.Nous nous sommes basés sur ces travaux récents pour investiguer le rôle fonctionnel de la glycoprotéine E1 par une approche de mutagenèse dirigée des résidus conservés dans la région N-terminale et dans la région du potentiel peptide de fusion, dans le contexte d’un clone infectieux du HCV. Comme attendu, nos résultats indiquent que ces mutations introduites dans E1 n’ont aucun effet sur la réplication virale. Cependant, vingt-et-un parmi les vingt-huit mutants produits conduisent à une atténuation ou une perte de l’infectiosité virale. D’une manière très intéressante, deux mutants atténués, le T213A et le I262A, se sont montrés moins dépendants au co-récepteur claudine-1. D’autre part, nous avons montré que ces mutants utilisent un autre récepteur de la famille des claudines (claudine-6) pour l’entrée virale, indiquant ainsi un changement de dépendance à son co-récepteur claudine-1. A l’opposé, deux autres mutants, le L286A et le E303A, se sont révélés avoir une plus grande dépendance au co-récepteur claudin-1 pour l’entrée dans les cellules d’hépatome. Au cours de ce travail, nous avons également identifié une mutation intéressante à proximité du potentiel peptide de fusion. Cette mutation, G311A, conduit à la sécrétion de particules virales entières mais non infectieuses, suggérant un défaut d’entrée cellulaire pour ce virus. De façon très surprenante, nous avons également identifié une mutation (D263A) qui conduit à la sécrétion de particules virales dépourvues d’ARN génomique. Une caractérisation plus poussée de ce mutant a de plus révélé une modification dans la co-localisation subcellulaire entre l'ARN viral et la glycoprotéine E1, mettant en évidence pour la première fois un dialogue croisé entre E1 et l'ARN génomique du HCV lors de la morphogenèse du virus.En conclusion, nos observations permettent d’identifier précisément les régions spécifiques de la protéine E1 qui jouent un rôle dans l’assemblage et l’entrée du virus dans la cellule, mettant en évidence le rôle majeur de la glycoprotéine E1 au niveau des différentes étapes du cycle infectieux du HCV. / Being part of the viral particle, HCV envelope glycoproteins E1 and E2 play an essential role in virion morphogenesis as well as in HCV entry into liver cells. These glycoproteins form a non-covalent heterodimer, and until recently, research on HCV envelope glycoproteins has been mainly focused on E2. Indeed, this glycoprotein is the receptor-binding protein, it is also the major target of neutralizing antibodies and it was postulated to be the fusion protein. However, the recent publications of the structure of E2 do not show the presence of a fusion peptide and its structure does not fit with what one would expect for a fusion protein, suggesting that E1 alone or in association with E2 might be responsible for the fusion step. Concerning E1, only the crystal structure of the two-fifth N-terminal region, comprising amino acids 192 to 270, has been reported. This partial structure reveals a complex network of covalently linked, intertwined homodimers. The overall fold of the N-terminal E1 monomer consists of a beta-hairpin (β1 and β2) followed by a segment composed of a 16 amino-acid long alpha-helix (α1) flanking a three-strand antiparallel beta-sheet (β3, β4 and β5). In addition to the characterization of secondary structures within E1, a region located in the middle of the polypeptide (approximately between aa 274 and 292) has been suggested to play an active role during the fusion process and might potentially act as a fusion peptide. We took advantage of these recently published data to further investigate the functional role of HCV glycoprotein E1 by using a site-directed mutagenesis approach targeting conserved amino acids in the N-terminal region as well as in the region postulated to contain the fusion peptide in the context of an infectious clone. As expected, our results indicate that these mutations have no effect on virus replication. However, twenty-one out of twenty-eight mutations led to attenuation or inactivation of infectivity. Interestingly, two attenuated mutants, T213A and I262A, were less dependent on tight junction protein claudin-1, a co-receptor for HCV. Instead, these mutant viruses relied on another claudin (claudin-6) for cellular entry, indicating a shift in receptor dependence. In contrast, two other mutants, L286 and E303, were more dependent on claudin-1 for cellular entry into hepatoma cells cells. We also identified an interesting mutation downstream of the putative fusion peptide, G311A, which leads to the release of non-infectious particles having a defect in cellular entry. Finally, an unexpected phenotype was also observed for D263A mutant, which was no longer infectious but led to the secretion of viral particles devoid of genomic RNA. Further characterization of the D263A mutant revealed a change in subcellular co-localization between HCV RNA and E1, highlighting for the first time a crosstalk between HCV glycoprotein E1 and the genomic RNA during HCV morphogenesis.In conclusion, our observations allowed for the identification of specific regions in the E1 glycoprotein that play a role in virion assembly and entry, highlighting the major role played by this protein at different steps of the HCV infectious cycle.