Contrairement aux maladies génétiques mendéliennes, qui dépendent d’un seul gène causal, les traits quantitatifs complexes sont des caractéristiques mesurables d’organismes vivants, qui résultent de l’interaction entre plusieurs gènes et les facteurs environnementaux. La génomique fonctionnelle nous a permis d’identifier de nombreux locus génétiques liés aux caractères complexes, qui sont appelés «locus de traits quantitatifs» (QTL). Cependant, de telles études ne permettent pas une caractérisation précise de l'architecture génétique des traits complexes. Plus récemment, il est devenu possible d’identifier des locus génétiques associés aux niveaux d'expression de gènes, appelés«locus de traits quantitatifs d’expression» (eQTLs). Dans de tels cas, les variants génétiques peuvent affecter l'expression soit des gènes qui se situent dans leur voisinage (cis-eQTLs), soit de ceux qui résident plus loin (trans-eQTLs). Dans des cas particuliers, un même locus peut affecter l’expression de plusieurs gènes situés dans différents chromosomes, formant ce qu’on appelle des ‘trans-eQTLs hotspots’. Ceux-ci peuvent avoir d’importants intérêts biologiques, car ils sont généralement enrichis en gènes fonctionnellement apparentés qui peuvent influencer le même trait phénotypique. Dans cette thèse, en analysant l'expression des gènes dans des échantillons de cœurs obtenus à partir d'un panel de souches consanguines recombinantes de souris AxB / BxA, nous avons détecté un QTL lié en trans- à l'expression de 190 transcrits, dont la majorité est connue pour être sensible aux interférons de type I. Le même locus correspondait également à celui d'un cis-eQTL pour le gène Ypel5, ce qui suggère que ce dernier peut être un régulateur commun des gènes trans-eQTL. Donc, le but principale de cette thèse fut de valider biologiquement le rôle du gène cis-eQTL dans la régulation du ‘trans-eQTLs hotspots’. Les travaux présentés dans cette thèse ont montrés que la réduction de l'expression de Ypel5 dans des macrophages de souris a stimulée l'expression de plusieurs gènes qui appartiennent au ‘trans-eQTL hotspot’, et ce d’une manière dépendante d’IFNB1. Le knockdown de YPEL5 a également augmenté l’induction d’IFNB1 dans les cellules humaines HEK293T. Lorsque ces dernières ont été soumis à des stimuli qui activent les kinases TBK1 / IKBKE, nous avons détecté des interactions fonctionnelles de YPEL5 avec l'activité de ces kinases, ainsi que des interactions physiques avec IKBKE. Nos résultats préliminaires (présentés dans le chapitre3) suggèrent aussi l’implication de YPEL5 dans la régulation du cycle cellulaire et /ou de la sénescence. En conclusion, nous sommes parmi les premiers groupes à fournir des preuves biologiques montrant le rôle d'un gène cis-eQTL en tant que régulateur commun de gènes appartenant à un ‘hotspot de trans-eQTL’. La validation biologique des analyses génomiques a ainsi permis de découvrir Ypel5 comme un nouveau régulateur négatif de la réponse antivirale innée qui agit (au moins en partie) au niveau des kinases TBK1 / IKBKE. / Unlike Mendelian genetic diseases, which depend on a single causal gene, complex quantitative traits are measurable characteristics of living organisms, which result from the interaction between several genes and environmental factors. Functional genomics has allowed us to identify many genetic loci linked to complex traits, which are called "quantitative trait loci" (QTL). However, such studies do not allow an accurate characterization of the genetic architecture of complex traits. More recently, it has become possible to identify genetic loci associated with gene expression levels, called "expression quantitative trait locus" (eQTLs). In such cases, the genetic variants can affect the expression of genes that are either located in their vicinity (cis-eQTLs) or that reside further away (trans-eQTLs). In particular cases, the same locus can affect the expression of several genes located on different chromosomes, forming so-called ‘trans-eQTLs hotspots’. These may have important biological interests, as they are generally enriched in functionally related genes, which may influence the same phenotypic trait. In this thesis, by analyzing the expression of genes in hearts from a panel of AxB / BxA mouse recombinant inbred strains, we detected a QTL linked in trans- to the expression of 190 transcripts, the majority of which are known to be sensitive to type I interferon. The same locus also corresponded to that of a cis-eQTL for the Ypel5 gene, suggesting that it could be a common regulator of the trans-eQTL genes. Therefore, the main purpose of this thesis was to biologically validate the role of the cis-eQTL gene in the regulation of the ‘trans-eQTL hotspot’. The work presented in this thesis showed that the silencing of Ypel5 expression in mouse macrophages stimulated the expression of several genes that belong to the ‘trans-eQTL hotspot’ in an IFNB1-dependent manner. YPEL5 knockdown also increased IFNB1 induction in human HEK293T cells. When the latter were subjected to stimuli that activate the TBK1/IKBKE kinases, we detected functional interactions of YPEL5 with the activity of these kinases and physical interactions with IKBKE. Our preliminary results (presented in Chapter 3) suggest also the involvement of YPEL5 in the regulation of cell cycle progression and / or senescence. In conclusion, we are among the first groups to provide biological evidence showing the role of a cis-eQTL gene as a common regulator of genes belonging to a ‘trans-eQTL hotspot’. The biological validation of genomic analysis thus revealed Ypel5 as a new negative regulator of the innate antiviral response that acts (at least in part) at the level of the TBK1 / IKBKE kinases.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

Le réovirus de mammifères est un virus oncolytique à l’étude pour sa capacité à infecter et détruire préférentiellement les cellules cancéreuses. Les liens entre le potentiel oncolytique du réovirus et son induction des voies de signalisation de l’interféron méritent des éclaircissements. Encore à ce jour, les déterminants viraux et les composantes cellulaires impliqués dans la réponse interféron lors de l’infection par ce virus demeurent à être mieux caractérisés. Des virus mutants ont préalablement été générés à partir d’un virus fortement inducteur d’interféron (T3DK) dans le fond génétique d’un virus faiblement inducteur d’interféron (T3DS) afin d’étudier les effets de certains polymorphismes. Cependant, les mécanismes de ces déterminants viraux et comment leurs polymorphismes les modifient pour amplifier ou restreindre l’induction d’interféron sont encore incertains. Notre approche a permis de révéler que les protéines μ2 et λ1 du réovirus modulent les événements précoces menant à la reconnaissance virale et à la réponse interféron. Nous avons découvert que le phénotype d’induction d’interféron sous l’effet de μ2, λ1 ou μ2 et λ1 provenant de T3DK était corrélé entre les niveaux protéiques et transcriptionnels. De plus, la présence simultanée de μ2 et λ1 (de T3DK) avait un effet synergique provoquant des niveaux d’interféron plus qu’additifs par rapport à la présence de μ2 ou de λ1 seuls. D’autre part, la transfection d’ARN extrait tôt de cellules infectées (mais pas celle d’ARN extrait tardivement) provoque une induction d’interféron qui suit cette même tendance. Par conséquent, les résultats démontrent que plusieurs protéines du réovirus pourraient s’acquitter de rôles multiples qui convergent vers la modulation de la réponse interféron. Cela laisse paraître les rôles envisageables de μ2 et λ1 dans le désassemblage, la participation à l’exposition du génome viral et/ou dans la contribution au sein du complexe de transcription viral. L’analyse comparative de virus mutants conçus par génétique inverse et qui sont à même de contrôler la réponse interféron semble une piste intéressante pour mieux appréhender les implications des polymorphismes dont ils sont porteurs. Cette approche pourrait fournir une meilleure compréhension du réovirus et être utile dans la perspective d’optimisation du potentiel oncolytique du réovirus. / The mammalian reovirus is an oncolytic virus under study for its ability to preferentially infect and destroy cancer cells. The links between the oncolytic potential of reovirus and its induction of interferon signaling pathways require clarification. Still to this day, the viral determinants and cellular components involved in the interferon response upon infection with this virus remain to be better characterized. Mutant viruses were previously generated from a high interferon-inducing virus (T3DK) in the genetic background of a low interferon-inducing virus, (T3DS) to study the effect of certain polymorphisms. However, the mechanisms of these viral determinants and how their polymorphism modify them to amplify or limit interferon induction are still unclear. Our approach revealed that the μ2 and λ1 proteins modulate early events leading to viral recognition and interferon response. We found that the phenotype of interferon induction under the effect of μ2, λ1 or μ2 and λ1 from T3DK showed a correlation between protein and transcriptional levels. Furthermore, the simultaneous presence of μ2 and λ1 (from T3DK) had a synergistic effect causing more than additive interferon levels compared with the presence of μ2 or λ1 alone. On the other hand, transfection of RNA extracted from early-infected cells (but not RNA extracted from late-infected cells) caused interferon induction following this same trend. Therefore, the results demonstrate that several proteins from reovirus could have multiple roles that converge to modulate the interferon response. This suggests potential roles for μ2 and λ1 in disassembly, participation in viral genome exposure, and/or contribution within the viral transcription complex. The comparative analysis of mutant viruses engineered by reverse genetics, and which are able to modulate the interferon response, would be an interesting avenue to better understand the implications of the polymorphisms they carry. This approach could provide a better understanding of the reovirus and be useful in the perspective of optimizing the oncolytic potential of this virus.