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Production, quantification et détection des coronavirusSavoie, Christopher 08 1900 (has links)
Les coronavirus tels que le SARS-CoV-2 représentent un danger pour la santé publique, mobilisant la science pour le développement d’outils. Considérant les risques du SARS-CoV-2, celui doit être manipulé en laboratoire de niveau de sécurité 3, limitant la recherche. Le coronavirus OC43 représente un modèle utile manipulable en niveau de sécurité 2, mais peu de méthodes standardisées existent pour celui-ci. La première partie de cette étude consiste au développement de modèle de culture cellulaire pour la production et la titration de OC43. Mes travaux démontrent l’utilité des lignées MRC-5 et HRT-18 ainsi que la sensibilité de la titration par Tissue Culture Infectious Dose 50 Immunoperoxidase Assay (TCID50-IPA). La seconde partie emploie une méthode de pointe en virologie qui n’a pas encore été démontrée pour les coronavirus, soit la virométrie en flux. Celle-ci permet la quantification absolue de particules virales, ce qui est un avantage aussi bien pour la recherche que pour une potentielle méthode diagnostique. J'ai ainsi développé une méthode de purification et de concentration du coronavirus OC43 pour permettre son étude en virométrie en flux avec un bruit de fond négligeable. Un marquage efficace de ~99% des particules virales a été démontré avec les marqueurs Syto 13 et Syto 62. De plus, le marquage par un anticorps contre la protéine S permet de d’évaluer la présence de virus. Finalement, les nouvelles méthodes développées ici permettront des études plus poussées sur les coronavirus. / Coronaviruses such as SARS-CoV-2 represent a danger for public health, mobilizing science for the development of new tools. Considering the risks of SARS-CoV-2, a biosecurity level 3 laboratory is required for their studies, which limits scientific research. The coronavirus OC43 represents a useful model that can be safely manipulated in biosecurity level 2 facilities but existing methods to study this virus are not well standardized or optimized. Therefore, I firstly developed a cell culture model for the production and titration of OC43. My data demonstrate the importance of the cell lines MRC-5 and HRT-18 and the sensitivity of the titration method called Tissue Culture Infectious Dose 50 Immunoperoxidase Assay (TCID50-IPA). Secondly, I explored a cutting-edge virometry method called flow virometry which allows the absolute quantification of intact viral particles, which is advantageous for many studies or as a potential diagnostic tool. I hence put together a protocol to purify and concentrate OC43 for this application with minimal background noise. Moreover, labeling the virus with Syto dyes (Syto 13, Syto 62) is very efficient with ~99% of viral particles marked. Furthermore, an antibody against the S protein of OC43 can mark the virus efficiently enough to evaluate the presence of viral particles. Finally, the optimization and development of these methods for coronavirus will enable further research.
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Role of the host protein DDX3X in HSV-1 nuclear egressRehan, Muhammad 12 1900 (has links)
HSV-1 and HSV-2, both double-stranded DNA viruses of the Alphaherpesvirinae subfamily, reportedly have sub-clinical prevalence in nearly 67% of the world population. During their intra-nuclear virus replication, four types of capsids (procapsids, A, B, and C capsids) are produced while only C-capsids contain mature DNA. Given their larger size (125 nm) than the nuclear pores (30-50 nm), they exit the nucleus by an unusual route called nuclear egress. On the other hand, our lab previously found that HSV-1 incorporates 49 distinct host proteins, including DDX3X, a DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box ATP-dependent RNA helicase that modulates gene expression of both DNA and RNA viruses. We also showed that DDX3X is redirected to the inner nuclear membrane late during the infection and interacts with pUL31, a component of the viral nuclear egress complex, to promote the nuclear exit of the viral capsids to the cytoplasm. However, the exact nature of such interactions remains elusive. On the other hand, our lab also reported that PCBP1 is specifically present on the C-capsids, and its depletion causes a reduction in viral titer. PCBP1 is known to bind with poly(c) RNA through K-homology (KH) domains and plays a role in mRNA stabilization, transcriptional control, RNA translation, antiviral immunity, and the modulation of viral propagation. Using confocal microscopy and co-immunoprecipitation studies, the present work reveals that DDX3X interacts with both components of the nuclear egress complex, i.e., pUL31 and pUL34, and that this interaction is independent of their phosphorylation by the pUS3 kinase that normally modulates their localization. Moreover, we also show that DDX3X interacts with PCBP1, which could explain the preferential selection of the C-capsids during the nuclear egress. This study is a step forward to map the complex multiple host protein interactions with viral partners and elucidate their possible role in the enigmatic selective escape of HSV-1 C-capsids. / HSV-1 et HSV-2, tous deux des virus à ADN double brin de la sous-famille des Alphaherpesvirinae, ont une prévalence subclinique chez près de 67 % de la population mondiale. Au cours de leur réplication virale intra-nucléaire, quatre types de capsides (procapsides, capsides A, B et C) sont produites tandis que seules les capsides C contiennent de l'ADN mature. Compte tenu de leur plus grande taille (125 nm) que les pores nucléaires (30 à 50 nm), ils quittent le noyau par une voie inhabituelle appelée sortie nucléaire. Notre laboratoire a précédemment découvert que le HSV-1 incorpore 49 protéines hôtes distinctes, dont DDX3X, une hélicase à ARN de type DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) dépendante de l'ATP qui module l'expression génique des virus à ADN et à ARN. DDX3X est redirigé vers la membrane nucléaire interne à la fin de l'infection et interagit avec pUL31, un composant du complexe de sortie nucléaire viral, pour favoriser la sortie nucléaire des capsides virales vers le cytoplasme. Cependant, la nature exacte de ces interactions reste incertaine. D'autre part, notre laboratoire a également signalé que PCBP1 est spécifiquement présent sur les capsides C et que sa déplétion entraîne une réduction du titre viral. PCBP1 est connu pour se lier à l'ARN poly (c) via les domaines d'homologie K (KH) et joue un rôle dans la stabilisation de l'ARNm, le contrôle transcriptionnel, la traduction de l'ARN, l'immunité antivirale et la modulation de la propagation virale. À l'aide de microscopie confocale et d'études de co-immunoprécipitation, le présent travail révèle que DDX3X interagit avec les deux composants du complexe de sortie nucléaire, à savoir pUL31 et pUL34, et que cette interaction est indépendante de leur phosphorylation par la kinase pUS3 qui module normalement leur localisation. De plus, nous montrons également que DDX3X interagit avec PCBP1, ce qui pourrait expliquer la sélection préférentielle des capsides C lors de la sortie nucléaire. Cette étude constitue un pas en avant dans la cartographie des interactions complexes entre protéines hôtes multiples et partenaires viraux et pour élucider leur rôle possible dans l’évasion sélective énigmatique des capsides C du HSV-1.
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L’impact des immunosuppresseurs sur les réservoirs du VIH après transplantation rénaleModica, Alessandro 08 1900 (has links)
La thérapie antirétrovirale (TAR) n'éradique pas le VIH de l'organisme. Le VIH persiste grâce à la prolifération de lymphocytes T CD4+ infectés de manière latente. De plus, bien que la plupart des provirus persistent sous une forme latente, un petit nombre de cellules infectées produisent des protéines virales et des virions. Les immunosuppresseurs administrés aux personnes subissant une greffe de rein, pour prévenir le rejet d’organe, inhibent la prolifération des lymphocytes T et l'activation immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que les immunosuppresseurs pourraient réduire à la fois la taille du réservoir viral latent ainsi que les marqueurs associés à la production résiduelle de VIH. Sept participants vivant avec le VIH sous TAR efficace et ayant subi une transplantation rénale suivie de la prise d’un traitement immunosuppresseur ont été recrutés. Des échantillons sanguins longitudinaux ont été prélevés avant et après la greffe (6-7 échantillons/participant, sur 2 ans).
Les effets des immunosuppresseurs sur l'activation des lymphocytes T ainsi que les taux d’anticorps plasmatiques dirigés contre l'enveloppe du VIH (un reflet de la production virale résiduelle) ont été évalués par cytométrie en flux et ELISA, respectivement. L'ADN total du VIH et les transcrits d'ARN-gag-LTR associés aux cellules ont été quantifiés par qPCR et la fréquence des cellules p24+ par HIV-Flow. Pour confirmer les résultats obtenus in vivo, nous avons optimisé un protocole de culture cellulaire pour évaluer l'impact des immunosuppresseurs les plus fréquemment utilisés (MMF, tacrolimus, dasatinib) sur les cellules infectées dans un environnement contrôlé.
Suite à la transplantation et à l’initiation du traitement immunosuppresseur, nous avons observé une diminution significative des niveaux d'expression des marqueurs d’activation et de prolifération HLA-DR et Ki67 dans les lymphocytes T CD4+, accompagnée d'une augmentation de la fréquence des cellules mémoires centrales et d'une forte diminution de la fréquence des lymphocytes T régulateurs. Les niveaux d'anticorps ciblant l'enveloppe du VIH ont également diminué pendant le traitement immunosuppresseur. Il y avait une diminution modeste et transitoire des niveaux d'ADN et d'ARN du VIH un mois après la transplantation rénale. Les résultats de HIV-Flow n'ont montré aucun impact significatif des immunosuppresseurs sur le réservoir inductible, avec de grandes variations entre les participants. Le modèle de culture cellulaire in vitro a révélé que de faibles doses d'immunosuppresseurs induisent généralement une diminution des marqueurs du VIH, alors que des doses plus élevées conduisent à des variations dépendantes des donneurs. Ainsi, nos résultats montrent que les traitements immunosuppresseurs diminuent la prolifération et l'activation des lymphocytes T CD4+, ce qui est concomitant avec une diminution modeste et transitoire des taux d'ADN et d'ARN du VIH. Nos résultats indiquent que la combinaison des traitements immunosuppresseurs actuels sont toutefois insuffisants pour affecter profondément et durablement le réservoir du VIH et suggèrent que la taille du réservoir est étroitement régulée par des forces homéostatiques difficiles à contrer. / Antiretroviral therapy (ART) does not eradicate HIV from the body. HIV persists through
proliferation of latently infected CD4+T-cells. Moreover, although most proviruses persist in a
latent form, a small number of infected cells produce viral protein and virions.
Immunosuppressants given to people undergoing kidney transplants to prevent rejection inhibit
T-cell proliferation and immune activation. We hypothesized that immunosuppressants could
reduce both the size of the latent viral reservoir as well as markers associated with residual
production of HIV. Seven participants living with HIV on suppressive ART who underwent
kidney transplantation and initiated immunosuppressive therapy were enrolled. Longitudinal
blood samples were collected before and after the transplant (6-7 samples/participant, over
2years).
The effects of immunosuppressants on T-cell activation as well as plasma HIV-envelope
antibody responses (a surrogate of residual viral production) were assessed by flow cytometry
and ELISA, respectively. Total HIV-DNA and cell-associated LTR-gag-RNA transcripts were
quantified by qPCR and the frequency of p24+ cells by HIV-Flow in isolated CD4+T-cells. To
confirm the results saw in vivo, we optimized a cell culture protocol to assess the impact of
frequently given immunosuppressants (tacrolimus, MMF and dasatinib) on infected cells in a
controlled environment.
Following organ transplant and initiation of immunosuppressive treatment, we observed a
significant decrease in the expression levels of HLA-DR and Ki67 in CD4+T-cells, which was
accompanied by an increase in the frequency of central memory cells and a sharp decrease in the
frequency of regulatory T-cells. Antibody levels targeting HIV envelope also decreased during
immunosuppressive therapy. There was a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA
levels one month following kidney transplantation. HIV-Flow results showed no significant
impact of immunosuppressants on the inducible reservoir, with large variations between
participants. The in vitro cell culture model showed that low doses of immunosuppressants
generally induces a reduction in HIV markers, but higher doses lead to variations between
donors. Immunosuppressive therapy decreases the proliferation and activation of CD4+ T-cells
which is concomitant with a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels. Our results indicate that current immunosuppressive drugs are insufficient to profoundly
and durably affect the HIV reservoir and suggest that the size of the reservoir is tightly regulated
by homeostatic forces that are difficult to counteract.
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Proteomics of mature extracellular Human coronavirus OC43Joharinia, Negar 08 1900 (has links)
Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) is a beta-coronavirus from the coronaviridae family. In contrast to SARS-CoV-2, HCoV-OC43 causes upper respiratory tract disease. However, because of their close phylogenic proximity but distinct pathologies, HCoV-OC43 is a very interesting surrogate to study and compare beta coronaviruses. As all viruses, the latter hijack cell machinery proteins to complete their life cycle. Cellular proteins, particularly those incorporated into virions are of particular interest since they often play a vital role in the virus life cycle. Our goal is to employ the proteomic pipeline we developed for HSV-1 to characterize the host proteins associated with highly purified extracellular HCoV-OC43 particles and finally expand it to SARS-CoV-2. To this end, high purity in sufficient yields is crucial as mass spectrometers pick up contaminants. The proteins present in cell culture medium serum, as well as the proteins carried by the exosomes produced by the cells or by the exosomes present in the cell culture media serum, are of particular concern. We utilized a series of methods to eliminate cell culture serum protein contaminations, enrich the viral particles, and separate exosomes from viral particles. For example, we have obtained an efficient separation of concentrated HCoV-OC43 virions from exosomes using density gradient fractionation. Mass spectrometry results on the purified fractions validated the enrichment of viral particles in the virus fraction and the lack of viral proteins in the mock samples. Most interestingly, we detected 69 host proteins unique to the virus fraction (compared to the mock), mostly regulating the RNA metabolism pathway followed by metabolite interconversion, protein modifying enzymes, and protein-binding activity modulator pathways. Since we also purified extracellular exosomes in the process, we probed whether the virus alters their protein content. Mass spectrometry revealed 51 unique proteins exclusively found in exosomes produced by HCoV-OC43 infected cells. These included translational proteins, metabolite interconversion enzymes, and scaffold proteins. Our preliminary RNA interference studies showed that knocking down 14 of these host proteins altered HCoV-OC43 titers. Studying host-virus protein interactions allows us to gain a deeper understanding of how viruses take advantage of host cells, and how we can develop novel viral therapeutics. / Le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43) est un bêta-coronavirus de la famille des
coronaviridae. Contrairement au SRAS-CoV2, le HCoV-OC43 provoque une maladie des voies
respiratoires supérieures. Cependant, en raison de leur proximité phylogénique étroite mais leur
pathologie distincte, HCoV-OC43 est un substitut fort intéressant pour étudier et comparer les
bêta-coronavirus. Comme tous les virus, ces derniers détournent les protéines de la machinerie
cellulaire pour compléter leur cycle de vie. Les protéines cellulaires, en particulier celles
incorporées dans les virions, sont particulièrement intéressantes puisqu'elles jouent souvent un
rôle vital dans le cycle de vie du virus. Notre objectif est d'utiliser le pipeline protéomique que
nous avons développé pour le HSV-1 afin de caractériser les protéines hôtes associées à des
particules virales extracellulaires de HCoV-OC43 hautement purifiées et d'étendre cette approche
au SRAS-CoV2. À cette fin, une pureté élevée avec des rendements suffisants est cruciale car les
spectromètres de masse détectent les contaminants. Les protéines présentes dans le sérum du
milieu de culture cellulaire, ainsi que les protéines portées par les exosomes produits par les
cellules ou par les exosomes présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, sont
particulièrement concernées. Nous avons utilisé une série de méthodes pour éliminer les
contaminations par les protéines sériques des cultures cellulaires, enrichir les particules virales et
séparer les exosomes des virus. Nous avons ainsi obtenu une excellente séparation des virions
HCoV-OC43 concentrés des exosomes en utilisant le fractionnement par gradient de densité. Les
résultats de spectrométrie de masse sur les fractions purifiées ont validé l'enrichissement en
particules virales dans la fraction virale et l'absence de protéines virales dans les échantillons
contrôles. Plus intéressant encore, nous avons détecté 69 protéines hôtes uniques à la fraction
virale (par rapport aux cellules non-infectées). Ces protéines sont principalement associées à la
voie du métabolisme de l'ARN suivie de l'interconversion des métabolites, des enzymes modifiant
les protéines et des voies modulatrices de l'activité de liaison aux protéines. Puisque nous avons
séparés les exosomes des virus, nous en avons profiter pour évaluer si le virus altère leur contenu
protéines. La spectrométrie de masse a de facto identifié 51 protéines uniques aux exosomes
produits par les cellules infectées par HCoV-OC43. Celles-ci régulent des voies des protéines
traductionnelles, des enzymes d'interconversion des métabolites et des voies des protéines
d'échafaudage. Nos études préliminaires sur l’interférence ARN ont montré que l’inactivation de
14 de ces protéines hôtes modifiait le titre de HCoV-OC43. L'étude des interactions hôte-protéine
virale nous permet de mieux comprendre comment les virus tirent parti des cellules hôtes et
comment nous pouvons développer de nouvelles thérapies virales.
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Étude du rôle des micro-ARN cellulaires au cours de l’infection par le VIH-1Bellini, Nicolas 12 1900 (has links)
Avec plus de 39 millions de personnes infectées à travers le monde, le virus de l’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) est un problème majeur de santé publique. Bien que la thérapie antirétrovirale contrôle la réplication virale, améliore la santé et prolongent la vie des personnes vivant avec le VIH-1, elle ne permet pas d’éradiquer complètement le virus. En effet, celui-ci établit des phases de latence en intégrant son génome dans l’ADN cellulaire des cellules cibles, entrainant la formation de ce que l’on appelle le réservoir latent du virus. Ce réservoir se situe principalement dans les lymphocytes T CD4+, bien qu’on le retrouve également dans les cellules myéloïdes, et il constitue le principal obstacle à l’éradication du virus. Il est donc impératif de mieux comprendre les facteurs de l’hôte qui régissent non seulement la susceptibilité de ces cellules à l’infection et qui contribuent également à la persistance du VIH-1. Nous postulons que les micro-ARN (miARN), des petits ARN produits par la cellule et qui régulent l’expression génique, jouent un rôle au cours de l’infection par le VIH-1.
Dans un premier temps, nous nous sommes concentrés sur le rôle des miARN dans l’entrée virale. À l’aide d’un séquençage de nouvelle génération des miARN dans les macrophages, nous avons déterminé que le miARN-103, ainsi que son paralogue le miARN-107, ciblent l’ARNm du corécepteur CCR5 utilisé par le VIH-1. Nous montrons que l’induction de l’expression des miARN-103/107 est régulée par le facteur de transcription p53 et rend les macrophages réfractaires à l’entrée du VIH-1. Nous observons que le niveau d’expression des miARN-103/107 est enrichi dans les macrophages résidant dans les tissus intestinaux de donneurs sains et les macrophages alvéolaires des personnes sous thérapie antirétrovirale, ce qui contribue vraisemblablement à leur résistance à l’infection par le VIH-1.
Étant donné que les lymphocytes T CD4+ constituent le principal réservoir du VIH-1, nous avons ensuite étendu l’étude du miARN-103 dans ces cellules. Récemment, il a été montré que la latence virale serait la conséquence de l’infection de lymphocytes T CD4+ dans une fenêtre très étroite suite à leur activation. Ces cellules qui
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transitionnent vers un phénotype mémoire posséderaient des propriétés uniques, comme une augmentation temporaire de l’expression du corécepteur viral CCR5, ainsi qu’une capacité réduite de transcrire l’ADN proviral intégré. Nos résultats montrent que le miARN-103, qui cible également le CCR5 dans les lymphocytes T CD4+, participe à la modulation du CCR5 selon l’état d’activation de la cellule et contribue indirectement à l’établissement de la latence virale dans ces cellules. De plus, nos résultats montrent que les lymphocytes T CD4+ issus d’individus qui contrôlent l’infection par le VIH-1 expriment des niveaux réduits d’ARNm de CCR5 (lorsque comparés à ceux d’individus non-contrôleurs). Cet état étant associé à une tendance à la hausse du miARN-103, suggère que le miARN-103 pourrait participer au contrôle de l’expression de CCR5 in vivo.
Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un séquençage de nouvelle génération de l’ARN des lymphocytes T CD4+ infectés. À la suite de cette analyse, nous avons déterminé que le miARN-26a participe à la régulation de CD59, une protéine cellulaire incorporée dans les virions jouant un rôle clé dans l’activation du complément en inhibant la formation du complexe d’attaque membranaire. Au cours de l’infection, ce miARN est diminué dans les cellules productivement infectées. Cette diminution est associée à une augmentation de CD59 dans les cellules infectées et à la surface des virions produits par ces cellules, favorisant leur échappement à la lyse médiée par le complément. Nous montrons que l’introduction d’un analogue du miARN-26a dans les cellules rend les virions produits par ces dites cellules plus sensibles à la lyse médiée par le complément.
En conclusion, les observations et analyses réalisées dans le cadre de cette thèse nous aident à mieux comprendre le rôle des miARN dans l’infection et la persistance du VIH-1. Ces résultats aident à notre compréhension des facteurs de l’hôte qui régissent la susceptibilité de ces cellules à l’infection ainsi que la persistance virale, et pourraient aider au développement de stratégies thérapeutiques. / With more than 39 million people infected in the world, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a major public health problem. Although antiretroviral therapy controls viral replication, improves the health, and prolongs the lives of people living with HIV-1, it does not completely eradicate the virus. Indeed, the virus has established latency phases by integrating its genome into the cellular DNA of target cells, leading to the formation of what is called the latent reservoir of the virus. This reservoir is located mainly in CD4+ T cells, although it is also found in myeloid cells, and it has become the main obstacle to eradication of the virus. It is therefore imperative to better understand the host factors that not only govern the susceptibility of these cells to infection but also contribute to HIV-1 persistence. We postulate that microRNAs (miRNAs), which are small RNAs produced by the cell involved in regulation of gene expression, have a role during HIV-1 infection.
First, we focused on the role of miRNAs in viral entry. Using next generation miRNA sequencing in macrophages, we determined that miRNA-103, as well as its paralogue miRNA-107, target the mRNA of CCR5, the HIV-1 coreceptor. We show that the induction of miRNA-103/107 expression is regulated by the transcription factor p53 and makes macrophages more resistant to HIV-1 entry. We observe that the expression level of miRNAs-103/107 is enriched in resident macrophages in intestinal tissues of healthy donors and alveolar macrophages of people on antiretroviral therapy, which likely contributes to their resistance to infection by HIV-1.
Given that CD4+ T cells constitute the main reservoir of HIV-1, we then extended the study of miRNA-103 in these cells. Recently, it has been shown that viral latency is the consequence of the infection of CD4+ T cells within a very narrow window following their activation. These transitioning to memory T cells are thought to possess unique properties, such as a temporary increase in the expression of the viral coreceptor CCR5, as well as a reduced capacity to transcribe integrated proviral DNA. Our results show that miRNA-103, which also targets CCR5 in CD4+ T cells, participates in the modulation of CCR5 depending on the activation state of the cell
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and indirectly contributes to the establishment of viral latency in these cells. Furthermore, our results show that CD4+ T cells from individuals who control HIV-1 infection express reduced levels of CCR5 mRNA (when compared to those from non- controller individuals), this being associated to a upward trend in miRNA-103 expression, suggesting that miRNA-103 may participate in the control of CCR5 expression in vivo.
Secondly, we carried out next generation RNA sequencing of HIV-1 infected CD4+ T cells. Their resulting analyses determined that miRNA-26a participates in the regulation of CD59, a cellular protein that is incorporated into virions and has a key role in complement activation by inhibiting the formation of the membrane attack complex. During infection, this miRNA is decreased in productively infected cells. This decrease is associated with an increase in CD59 in infected cells, as well as on the surface of virions produced by these cells, favoring their escape from complement- mediated lysis. We show that introduction of miRNA-26a mimics in cells makes the virions produced by these cells more sensitive to complement-mediated lysis.
In conclusion, the observations and analyses developed in this thesis will help us better understand the role of miRNAs in HIV-1 infection and persistence. These results help in the understanding of host factors that govern the susceptibility of these cells to infection as well as viral persistence and could help in the development of therapeutic strategies.
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Étude des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la réponse à l’interféron lors de l’infection par des variants du réovirus de mammifèresDesprés, Guillaume David 12 1900 (has links)
Le réovirus de mammifères est un virus oncolytique à l’étude pour sa capacité à infecter et
détruire préférentiellement les cellules cancéreuses. Les liens entre le potentiel oncolytique du
réovirus et son induction des voies de signalisation de l’interféron méritent des éclaircissements.
Encore à ce jour, les déterminants viraux et les composantes cellulaires impliqués dans la réponse
interféron lors de l’infection par ce virus demeurent à être mieux caractérisés. Des virus mutants
ont préalablement été générés à partir d’un virus fortement inducteur d’interféron (T3DK) dans le
fond génétique d’un virus faiblement inducteur d’interféron (T3DS) afin d’étudier les effets de
certains polymorphismes. Cependant, les mécanismes de ces déterminants viraux et comment leurs
polymorphismes les modifient pour amplifier ou restreindre l’induction d’interféron sont encore
incertains. Notre approche a permis de révéler que les protéines μ2 et λ1 du réovirus modulent les
événements précoces menant à la reconnaissance virale et à la réponse interféron. Nous avons
découvert que le phénotype d’induction d’interféron sous l’effet de μ2, λ1 ou μ2 et λ1 provenant
de T3DK était corrélé entre les niveaux protéiques et transcriptionnels. De plus, la présence
simultanée de μ2 et λ1 (de T3DK) avait un effet synergique provoquant des niveaux d’interféron
plus qu’additifs par rapport à la présence de μ2 ou de λ1 seuls. D’autre part, la transfection d’ARN
extrait tôt de cellules infectées (mais pas celle d’ARN extrait tardivement) provoque une induction
d’interféron qui suit cette même tendance. Par conséquent, les résultats démontrent que plusieurs
protéines du réovirus pourraient s’acquitter de rôles multiples qui convergent vers la modulation
de la réponse interféron. Cela laisse paraître les rôles envisageables de μ2 et λ1 dans le
désassemblage, la participation à l’exposition du génome viral et/ou dans la contribution au sein
du complexe de transcription viral.
L’analyse comparative de virus mutants conçus par génétique inverse et qui sont à même
de contrôler la réponse interféron semble une piste intéressante pour mieux appréhender les
implications des polymorphismes dont ils sont porteurs. Cette approche pourrait fournir une
meilleure compréhension du réovirus et être utile dans la perspective d’optimisation du potentiel
oncolytique du réovirus. / The mammalian reovirus is an oncolytic virus under study for its ability to preferentially
infect and destroy cancer cells. The links between the oncolytic potential of reovirus and its
induction of interferon signaling pathways require clarification. Still to this day, the viral
determinants and cellular components involved in the interferon response upon infection with this
virus remain to be better characterized. Mutant viruses were previously generated from a high
interferon-inducing virus (T3DK) in the genetic background of a low interferon-inducing virus,
(T3DS) to study the effect of certain polymorphisms. However, the mechanisms of these viral
determinants and how their polymorphism modify them to amplify or limit interferon induction
are still unclear. Our approach revealed that the μ2 and λ1 proteins modulate early events leading
to viral recognition and interferon response. We found that the phenotype of interferon induction
under the effect of μ2, λ1 or μ2 and λ1 from T3DK showed a correlation between protein and
transcriptional levels. Furthermore, the simultaneous presence of μ2 and λ1 (from T3DK) had a
synergistic effect causing more than additive interferon levels compared with the presence of μ2
or λ1 alone. On the other hand, transfection of RNA extracted from early-infected cells (but not
RNA extracted from late-infected cells) caused interferon induction following this same trend.
Therefore, the results demonstrate that several proteins from reovirus could have multiple roles
that converge to modulate the interferon response. This suggests potential roles for μ2 and λ1 in
disassembly, participation in viral genome exposure, and/or contribution within the viral
transcription complex.
The comparative analysis of mutant viruses engineered by reverse genetics, and which are
able to modulate the interferon response, would be an interesting avenue to better understand the
implications of the polymorphisms they carry. This approach could provide a better understanding
of the reovirus and be useful in the perspective of optimizing the oncolytic potential of this virus.
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Validation des partenaires de la glycoprotéine M du virus de l’herpès simplex de type 1Hawkins, Josiane 07 1900 (has links)
La glycoprotéine M (gM) du virus de l’herpès simplex de type 1 (VHS-1) est une protéine transmembranaire conservée parmi les Herpesviridae. C’est une protéine essentielle pour certains virus herpétiques. Cependant, gM est non essentielle quoiqu’importante pour les Alphaherpesvirinae tels que VHS-1 et VHS-2. En effet, lorsque gM est inhibée lors d’une infection au VHS-1, les titres viraux diminuent d’environ 10 fois. Lors de l’infection, gM migre tout d’abord vers les membranes nucléaires et ensuite vers le réseau trans Golgi (TGN). Il est connu que le transport de gM vers le noyau est dépendant de l’infection, puisque dans des cellules transfectées, gM s'accumule au TGN. Sachant que les interacteurs viraux connus de gM ne sont pas directement impliqués dans cette migration, une étude d’identification de nouveaux partenaires a été conduite. Cent soixante et onze protéines cellulaires potentiellement partenaires de gM ont précédemment été identifiées par BioID. Parmi celles-ci, 27 protéines ont été choisies pour validation étant donné leur implication au niveau du transport vésiculaire ou leur localisation aux membranes nucléaires. Mes travaux démontrent que l'Integral membrane protein 2B (ITM2B), une des protéines choisies pour validation, interagit et colocalise avec gM lors de l’infection. Par ailleurs, elle régule la production virale et la migration de gM vers le TGN lors d’infection. Étonnamment, cette protéine semble aussi être importante pour l’encapsidation du génome viral lors de l’infection. Finalement, nous avons montré que la production de capsides de type C, processus requérant ITM2B, serait impliqué dans la sortie nucléaire de gM. Ainsi, dans ce mémoire, nous établissons de nouvelles fonctions pour une protéine cellulaire, ITM2B, n’ayant pas d’implication auparavant décrites avec le VHS-1, durant la propagation de ce dernier. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein M (gM) is a transmembrane protein conserved among the Herpesviridae. It is an essential protein for certain herpesviruses. However, gM is nonessential although important for HSV-1 and HSV-2. Indeed, when gM is inhibited during an HSV-1 infection, the viral titers decrease by tenfold. Upon infection, gM migrates first to nuclear membranes and then to the trans-Golgi network (TGN). It is known that the transport of gM to the nucleus is dependent on the infection since, in transfected cells, gM accumulates at the TGN. Knowing that the investigated gM viral interactors are not directly involved in this migration, a recent study identified by BioID 171 cellular proteins potentially partners of gM. Among these, 27 proteins were chosen for validation for their involvement in vesicular transport or localization at the nuclear membranes. Integral membrane protein 2B (ITM2B), one of the proteins chosen for validation, seems to be important for viral production as well as the migration of gM to the TGN during infection. Moreover, we showed that ITM2B interacts and colocalizes with gM upon infection. This protein also seems to be important for encapsidation of the viral genome. Finally, we showed that the production of C-type capsids, a process requiring ITM2B, would be involved in the nuclear exit of gM. In this memoir, we establish new functions for a cellular protein, ITM2B, having no involvement previously described with HSV-1, during the propagation of the latter.
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Étude du rôle de la conformation des glycoprotéines de l'enveloppe du VIH-1 dans la réponse cytotoxique cellulaire dépendante des anticorpsPrévost, Jérémie 06 1900 (has links)
En l'absence d'un vaccin efficace et avec des thérapies antirétrovirales incapables d'éradiquer le virus, le VIH-1 reste un problème de santé publique mondial. Des immunothérapies à base d'anticorps sont à l'étude pour éliminer les réservoirs cellulaires, qui représentent un obstacle incontournable à la guérison du VIH-1. Les glycoprotéines d'enveloppe du VIH-1 (Env) représentent le seul antigène du virus exposé à la surface des cellules infectées et constituent donc la principale cible des anticorps. L’Env non-liée adopte sa conformation « fermée », reconnue préférentiellement par les anticorps neutralisants. L'interaction avec CD4 fait passer Env dans sa conformation « ouverte », exposant des épitopes conservés reconnus par les anticorps non-neutralisants (nnAbs) présents dans le sérum d’individus infectés par le VIH-1 (sérums VIH+). Les nnAbs peuvent éliminer les cellules infectées par la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Cependant, les protéines accessoires Nef et Vpu diminuent l’expression de surface de CD4 et BST-2 afin d’évader à la reconnaissance et l'élimination des cellules infectées par les nnAbs. Dans cette thèse, nous caractérisons en détail la contribution d’Env, Nef et Vpu pour échapper aux réponses humorales et explorons de nouvelles stratégies pour sensibiliser les cellules infectées à l’ADCC.
Pour quantifier plus adéquatement la réponse ADCC, nous avons identifié des biais dans les tests largement utilisés, notamment pour évaluer les corrélats de protection vaccinale. Il s'agit de l'incapacité à faire la distinction entre l'élimination des cellules infectées et des cellules non-infectées, et l'utilisation de constructions virales comportant un gène rapporteur empêchant l’expression de Nef. En utilisant un nouveau marquage intracellulaire, nous avons confirmé l’effet protecteur de Nef et Vpu contre l’ADCC.
Ensuite, nous avons étudié les déterminants d’Env et Vpu modulant la susceptibilité des cellules infectées à l’ADCC médiée par les nnAbs. Certaines caractéristiques structurelles d'Env modulent ses transitions conformationnelles, incluant le domaine d'association du trimère, le site de clivage de la furine et la cavité Phe43. L’altération de ces composantes augmente la sensibilité des cellules infectées à l'ADCC par les sérums VIH+. Outre l’inhibition de CD4 et BST-2, Vpu cible également NTB-A et PVR, des ligands de récepteurs activateurs des cellules NK. Cependant, la polyfonctionnalité de Vpu est compromise par l’augmentation de BST-2 par les interférons de type I (IFN-I), sensibilisant ainsi les cellules infectées aux réponses NK. En utilisant un modèle de souris humanisée, nous validons l'importance de Vpu pour échapper à la pression immunitaire des nnAbs in vivo.
Enfin, nous avons exploré de nouvelles stratégies pour sensibiliser les cellules infectées à l'ADCC en modulant la conformation d’Env avec des mimétiques moléculaires de CD4 (CD4mc). Nous avons identifié des résidus bordant la cavité Phe43 modulant la sensibilité au CD4mc. L’accumulation d’Env induite par les IFN-I augmente la capacité du CD4mc à sensibiliser les cellules infectées à l'ADCC par les sérums VIH+.
Globalement, cette thèse dévoile une caractérisation approfondie des déterminants viraux et cellulaires modulant la susceptibilité des cellules infectées par le VIH-1 aux réponses humorales. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est nécessaire pour développer des nouvelles stratégies capables d’éradiquer les réservoirs viraux. / In the absence of an effective vaccine and with antiretroviral therapies unable to eradicate the virus, HIV-1 remains a global public health problem. Antibody-based immunotherapies are currently being investigated to eliminate cellular reservoirs, which represent a major obstacle towards an HIV-1 cure. HIV-1 envelope glycoproteins (Env) represent the only virus-specific antigen exposed at the surface of infected cells and therefore is the main target for antibodies. In its unliganded form, Env samples a ‘closed’ conformation, preferentially recognized by neutralizing antibodies. Interaction with CD4 drives Env into its ‘open’ conformation, exposing conserved epitopes recognized by non-neutralizing antibodies (nnAbs) present in sera from HIV-1 infected individuals (HIV+ sera). NnAbs can eliminate infected cells by antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). However, HIV-1 encodes for the accessory proteins Nef and Vpu which decrease cell surface levels of CD4 and BST-2, thus avoiding recognition and elimination of infected cells by nnAbs. In this thesis, we characterize in detail the contribution of Env, Nef, and Vpu to evade humoral responses and explore new strategies for sensitizing infected cells to ADCC. In an effort to develop a more adequate quantification of ADCC responses, we identified major biases in widely used assays, including the ones used to assess correlates of vaccine protection. These include the inability to distinguish between the elimination of infected and uninfected cells and the use of viral constructs coding for a reporter gene that prevents Nef expression. Using a novel intracellular staining, we confirmed the protective effect of Nef and Vpu against ADCC responses. Next, we studied the different Env and Vpu determinants modulating the susceptibility of infected cells to nnAbs-mediated ADCC responses. Certain Env structural features modulate its conformational transitions, including the trimer association domain, the furin cleavage site and the Phe43 cavity. Alterations of these components increase the susceptibility of HIV-1-infected cells to ADCC mediated by HIV+ sera. In addition to inhibiting CD4 and BST-2, Vpu also targets NTB-A and PVR, which act as ligands for NK cell activating receptors. However, we found that the polyfunctionality of Vpu can be compromised by the upregulation of BST-2 by type I interferons (IFN-I), thereby sensitizing infected cells to NK cell responses. Using a humanized mouse model, we validate the importance of Vpu to escape the immune pressure of nnAbs in vivo. Finally, we explored new strategies to bypass the protective effect of Vpu and Nef and sensitize HIV-1-infected cells to ADCC by modulating Env conformation using small CD4-mimetic compounds (CD4mc). We identified a network of residue lining the Phe43 cavity that modulates Env sensitivity to CD4mc. The enhanced surface expression of Env by type I IFNs boosts the ability of CD4mc to sensitize HIV-1-infected cells to ADCC by HIV+ sera. Overall, this thesis sheds light on a thorough characterization of viral and cellular determinants modulating the susceptibility of HIV-1-infected cells to humoral responses. A better understanding of these mechanisms is needed to develop new strategies able to eradicate viral reservoirs.
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Impact du petit inhibiteur temsavir sur la conformation des glycoprotéines d’enveloppe du VIH-1Boutin, Marianne 05 1900 (has links)
Un obstacle important dans l’éradication du virus de l’immunodéfience humaine (VIH-1) est
l’établissement de réservoirs viraux où le virus reste à l’état latent ainsi que l’absence de vaccin
efficace. Bien que les molécules antivirales actuelles permettent d’augmenter l’espérance de vie
des personnes vivant avec le VIH-1 (PLWH) ainsi que de diminuer la réplication virale chez cellesci,
elles ne contribuent pas à l’élimination de ces réservoirs. La hausse de résistance envers ces
molécules inhibitrices nécessite le développement constant de nouvelles molécules. L’une d’entre
elles, temsavir (BMS-626529), est un nouvel inhibiteur d’attachement approuvé par la FDA depuis
2020. Sa cible, la glycoprotéine d’enveloppe (Env), est le seul antigène viral présent à la surface
des cellules infectées et des virions, représentant donc la cible idéale des anticorps. L’Env mature
se trouve sous forme d’hétérodimère (gp120 et gp41) suite au clivage de son précurseur gp160.
Temsavir lie sous la boucle β20-β21 de la gp120 et prévient donc, par compétition, l’interaction
entre l’Env et le récepteur CD4 de l’hôte. En plus de son rôle en tant qu’inhibiteur d’attachement,
temsavir permet de stabiliser le trimère dans sa conformation dite «fermée». Un ancien analogue
de temsavir, BMS-806, a montré réduire l’addition de glycans ainsi que de diminuer le clivage du
précurseur gp160. Nos études démontrent que temsavir possède également un impact sur ces
mécanismes impliqués dans la maturation et la flexibilité de l’Env de plusieurs souches du VIH-1.
De ce fait, nous avons investigué l’effet de cette altération sur la conformation des différentes Env.
Nos observations montrent que l’effet de temsavir sur le clivage protéolytique est associé à une
diminution de la reconnaissance de l’Env par des anticorps ciblant différentes régions de celle-ci.
Cette modification de la reconnaissance de l’Env est également associée à l’efficacité de la réponse
cytotoxique cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) à éliminer les cellules infectées. Les
résultats présentés dans ce mémoire, notamment l’effet de temsavir sur la conformation de l’Env,
devrait être considéré lors du développement d’immunothérapies ciblant le réservoir viral. / An important obstacle in the eradication of the human immunodeficiency virus (HIV-1) is the
establishment of viral reservoirs where the virus remains in a latent state and the absence of a potent
vaccine. Although current antiretroviral molecules increase the life expectancy of people living
with HIV-1 (PLWH) as well as reduce viral replication, they do not contribute to the elimination
of these reservoirs. Also, the increase in drugs resistances towards these inhibitory molecules
requires the constant development of new molecules. One of them, temsavir (BMS-626529), is a
new attachment inhibitor approved by the FDA since 2020. Its target, the envelope glycoprotein
(Env), is the only viral antigen present at the surface of infected cells and virions and thus, is also
the main target of antibodies. This mature Env consists of three gp120-gp41 heterodimers after the
proteolytic cleavage of its gp160 precursor. Temsavir binds under the β20-β21 loop of gp120 and
prevents the interaction between Env and the host CD4 receptor. In addition to its role as an
attachment inhibitor, temsavir stabilizes the trimer in its "closed" conformation. A previous analog
of temsavir, BMS-806, has been shown to affect the addition of glycans as well as the cleavage of
the gp160 precursor. Our studies demonstrate that temsavir also has an impact on these mechanisms
involved in the maturation and flexibility of Env of several strains of HIV-1. Therefore, we
investigated the effect of this alteration on the conformation of different Env. Our observations
showed that the effect of temsavir on proteolytic cleavage is associated with a decrease in Env
recognition by antibodies targeting different regions of Env. This modification in Env recognition
also appears to be associated with the efficacy of antibody to mediate potent antibody-dependent
cellular cytotoxicity (ADCC) against infected-cells. The results presented in this master thesis,
should be considered when developing immunotherapies aimed at targeting the viral reservoir in
Fostemsavir-treated individuals.
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Rôle de l'IL-32 dans l'inflammation chronique, la sénescence et le dysfonctionnement cellulaire lié aux maladies cardiovasculaires chez les personnes vivant avec le VIH-1Bunet, Rémi 12 1900 (has links)
L’épidémie causée par le virus du VIH-1 touche actuellement 38,4 millions de personnes dans le monde dont environ 63000 au Canada. Depuis 1996 et la mise en pratique de la thérapie antirétrovirale combinée, l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH a augmenté significativement jusqu’à s’approcher de celle de la population générale. Actuellement, 10% des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) dans le monde ont plus de 50 ans et ce chiffre augmente à 50% pour les États-Unis et le Canada. Cette population vieillissante avec le VIH est exposée à un risque plus élevé de développer des comorbidités associées à l’infection chronique. Le développement de meilleures méthodes de gestion des comorbidités est nécessaire afin d’améliorer la qualité de vie des personnes vieillissant avec le VIH. Cela passe notamment par une meilleure connaissance des processus inflammatoires impliqués, la recherche de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques.
Nous nous sommes intéressés à l’interleukine-32, une cytokine pro-inflammatoire exprimée en de multiples isoformes et dont l’expression est augmentée dans le sang des PVVIH. Nous avons remarqué que les isoformes d’IL-32β et γ diminuaient l’expression du CD96 à la surface des cellules TCD8+. Nous avons déterminé que la perte de son expression était associée avec une diminution de l’expression de CD28 et CD27 et une augmentation de l’expression de CD57. Les cellules TCD8+ exprimant peu de CD96 avaient une diminution de leur capacité de prolifération et les cellules TCD8+ spécifiques au VIH exprimant peu de CD96 répondaient moins efficacement aux peptides du VIH. Nos résultats indiquent que le CD96 est un marqueur des cellules compétentes contre le VIH et que la perte de son expression peut être utilisée comme un marqueur de la dysfonction et de la sénescence des cellules TCD8+.
Nous avons ensuite étudié le rôle de l’IL-32 dans le développement des maladies cardiovasculaires via son impact sur les cellules endothéliales de l’artère coronaire. Nous avons pu montrer que les isoformes de l’IL-32 β et γ ont un impact partiel sur la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules endothéliales. Cependant, ces isoformes d’IL-32 augmentent l’expression des molécules d’adhérence et la production des chimiokines par les cellules endothéliales. Nous avons déterminé que ces isoformes induisent la dysfonction cellulaire et contribuent au recrutement des monocytes et à leur transmigration. Nous avons également déterminé que l’expression des isoformes d’IL-32 corrèle avec la rigidité artérielle de la carotide autant chez les personnes vivant avec le VIH que dans la population générale. Ces résultats suggèrent qu’IL-32 pourrait constituer une cible thérapeutique pour atténuer l’inflammation chronique, la sénescence cellulaire et la dysfonction cellulaire associés au développement des maladies cardiovasculaires.
Enfin nous nous sommes intéressés à l’utilisation des acides gras à chaine courte dans la réduction de l’inflammation des cellules endothéliales. Nous avons découvert que plusieurs acides gras à chaine courte ont le potentiel de diminuer les signes de dysfonction des cellules endothéliales comme l’expression de leurs molécules d’adhérence et leur sécrétion de cytokines et de chimiokines après stimulation par les isoformes d’IL-32β et γ. / As of 2023, the HIV-1 epidemic is affecting 38,4 million people worldwide and 63000 in Canada. Since 1996, introduction of the combined antiretroviral therapy led to a very impressive increase in the lifespan of PLWH, which approaches the general population. Currently, 10% of PLWH are over the age of 50 years worldwide and this number is increased to 50% in the US and Canada. This aging population of PLWH is exposed to an increased prevalence of comorbidities associated with the chronic infection on top of the normal age-associated co-morbidities. Thus, improving the management of comorbidities is mandatory to improve quality of life of PLWH. This can be achieved by a better understanding of the inflammatory process involved along with the discovery of new biomarkers of disease progression and identifying new therapeutic targets.
To this end, we got interested in interleukine-32 (IL-32), a pro-inflammatory cytokine expressed in multiple isoforms and upregulated in the blood of PLWH and is associated with disease progression in PLWH. We discovered that IL-32β and γ decreases the expression of CD96, a transmembrane glycoprotein receptor, at the surface of CD8 T cells. We determined that the loss of CD96 expression was associated with a senescence phenotype translated by the reduction in the expression of CD27 and CD28 and an upregulation in the expression of CD57. CD8+ T cells expressing low CD96 had their proliferative capabilities altered and responded poorly to HIV-1 antigen recall. Our results suggest that CD96 is a biomarker for competent CD8+ T cells in the context of HIV-1 infection and that its decreased expression by IL-32-mediated mechanisms may lead to CD8+ T cell dysfunction and senescence. These mechanisms are likely to contribute to the persistent inflammation and its associated comorbidities in the aging population of PLWH.
We then investigated the role of IL-32 in the development of cardiovascular diseases by looking at its impact on coronary artery endothelial cells (CAEC). We observed that IL-32β and γ have a partial impact on CAEC cytokine production. However, theses isoforms increased the expression of adhesion molecules and production of chemokines involved in leukocyte recruitment by the CAEC. In this context, we determined that IL-32β and γ induce the dysfunction of CAEC and lead to monocyte recruitment. We also observed that IL-32 isoforms expression correlates with carotid artery stiffness in both PLWH and in the general population. These results suggest that IL-32 could be considered as a therapeutic target to attenuate inflammation, cellular senescence, and dysfunction of endothelial cells, which are processes linked to the development of cardiovascular diseases.
Finally, we got interested in the use of short chains fatty acids (SCFA), a group of gut metabolites that we previously shown to be decreased in PLWH with cardiovascular disease, to reduce the impact of IL-32 isoforms on endothelial cells. We discovered that several SCFA have the potential to diminish the impact of IL-32 on markers of CAEC dysfunction, such on the expression of their adhesion molecule and chemokine secretion after stimulation by IL-32β and γ.
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