Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les domaines PDZ reconnaissent des motifs C-terminaux (PBMs), à l'origine de nombreuses interactions qui sont souvent impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié divers aspects de la spécificité des interactions PDZ-PBM. Nous avons mis en évidence les faibles performances de deux prédicteurs d'interaction entre PDZs et PBMs, considérés sous leurs formes les plus courtes. Ensuite, nous avons développé des protocoles basés sur les méthodes BIAcore et HoldUp pour valider expérimentalement et à grande échelle des prédicteurs d'interaction PDZ-PBM et pour étudier l'influence du contexte de séquence (comme les séquences flanquantes ou les domaines voisins) des PDZs et des PBMs sur l’affinité et la spécificité de leurs interactions. Nous avons identifié des interactions potentielles impliquant les protéines humaines à PDZ MAGI1 et SCRIB soulignant leur implication dans les réseaux de signalisation des protéines G. Une revue de la littérature, combinée avec nos propres résultats, a révélé des mécanismes par lesquels le contexte de séquence influence les affinités et spécificités des interactions impliquant les PDZs. Nous avons discuté ces mécanismes dans une revue publiée. Les connaissances obtenues à partir de cette thèse pourront influencer positivement de futures études sur les interactions PDZ-PBM, en particulier, et sur les interactions domaine-motif linéaire en général. / PDZ domains recognize C-terminal PDZ-binding motifs (PBMs) thereby mediating protein interactions that are often involved in cell polarity regulation. In this thesis, we studied under various aspects the specificity of PDZ-PBM interactions. We identified weak performances of two published predictors for interactions between core PDZ domains and short PBMs. Next, we developed protocols based on BIAcore and HoldUp to experimentally validate on a large scale predicted PDZ-PBM interactions and to study the influence of sequence context (e.g. flanking regions or neighbouring domains) of PDZs and PBMs on their interaction affinity and specificity. We identified new potential interactions involving the human PDZ proteins MAGI1 and SCRIB underpinning their implication in G protein signalling pathways. A literature survey combined with our own findings reveal structural mechanisms, by which sequence context influences PDZ interaction affinities and specificities. We have discussed those in a published review. Insights gained from this thesis may positively impact future studies on PDZ-PBM interactions in particular and on domain-linear motif interactions in general.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La conductivité hydraulique racinaire (Lpr) traduit la capacité de transport d’eau de la racine. Lors de son trajet du sol vers le xylème, l’eau diffuse au sein de l’apoplasme ou au travers des cellules (voie de cellule-à-cellule). Au niveau de l’endoderme, la diffusion apoplasmique de l’eau est bloquée par le cadre de Caspari et des lamelles de subérine. La voie de cellule-à-cellule dépend principalement de l’activité des aquaporines régulées en partie par des interactions protéiques. Ce travail caractérise de nouveaux interactants de l’aquaporine racinaire PIP2;1 : le récepteur kinase RKL1 et 4 protéines de fonction inconnue appartenant à la sous-famille 1 des Casparian Strip membrane domain Protein Like (CASPL1) (CASPL1-B1/B2/D1/D2). RKL1 est exprimée dans l’endoderme, est capable d’interagir physiquement avec PIP2;1 et stimule in vitro le transport d’eau par l’aquaporine. Cependant, l’inactivation de RKL1 n’affecte pas la Lpr sans que cela ne puisse être expliqué par une redondance fonctionnelle avec son plus proche homologue, RLK902. Une étude bibliographique suggère que l’interaction entre RKL1 et PIP2;1 interviendrait dans une voie de signalisation en réponse à une attaque pathogène. Concernant les CASPL, D1 est exprimé dans tous les tissus, alors que B1, B2 et D2 semblent uniquement exprimés dans des territoires subérisés. Ce profil suggère une implication de B1, B2 et D2 dans une régulation des aquaporines et de la subérisation. Au niveau moléculaire, D2, malgré son interaction physique avec PIP2;1, ne module pas le transport d’eau par l’aquaporine. En revanche, B1 interagit préférentiellement avec PIP2;1 sous une forme phosphorylée et stimule le transport d’eau par l’aquaporine. Au niveau de la plante entière, l’inactivation d’un ou deux gènes CASPL n’affecte ni la Lpr., ni la subérisation. Par contre, l’inactivation de PIP2;1 et PIP2;2 révèle un effet inhibiteur de ces aquaporines sur la subérisation. Cette étude a permis de décrire de nouveaux mécanismes originaux de régulation des aquaporines. Elle pose également, la question de l’existence d’une relation entre les transports d’eau par la voie apoplasmique et par les aquaporines. / The root hydraulic conductivity (Lpr) reflects the water transport capacity of the root. During its transfer from the soil to the xylem, water can diffuse in the apoplasm or through the cells (cell-to-cell pathway). At the endodermis, the apoplastic diffusion of water is blocked by the Casparian Strip and suberin lamellae. The cell-to-cell pathway mainly relies on aquaporin activity which can be regulated by protein interactions. This study aims at characterizing new interactants of the root aquaporin PIP2;1: the receptor kinase RKL1 and 4 proteins of unknown function belonging to the Casparian Strip membrane domain Protein Like 1 sub-family (CASPL1-B1/B2/D1/D2). RKL1 is expressed in the endodermis, can physically interact with PIP2;1 and stimulates its water transport function in vitro. However a loss-of-function of RKL1 does not affect the Lpr., independently of a putative functional redundancy with its closest homolog RLK902. Concerning CASPL, D1 is expressed in every tissue of the root whereas B1, B2 and D2 appear to be specifically expressed in suberized tissues. This suggests a putative role of these isoforms in aquaporin regulation and suberisation. At the molecular level, D2 does not modulate PIP2;1 water transport activity despite a physical interaction between the two partners. By contrast, B1 interacts with PIP2;1 preferentially in its phosphorylated form and enhances the water transport activity of the aquaporin. At the plant level, disrupting one or two CASPL genes neither impact the Lpr nor affect the suberisation. However, the loss of function of both PIP2;1 and PIP2;2 reveals a negative effect of these aquaporins on suberisation. In conclusion, this study, uncovered novel regulation mechanisms of aquaporins. It also raises the question of the existence of a putative relationship between water transport by the apoplastic pathway and by aquaporins.

Les domaines PDZ reconnaissent des motifs C-terminaux (PBMs), à l'origine de nombreuses interactions qui sont souvent impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié divers aspects de la spécificité des interactions PDZ-PBM. Nous avons mis en évidence les faibles performances de deux prédicteurs d'interaction entre PDZs et PBMs, considérés sous leurs formes les plus courtes. Ensuite, nous avons développé des protocoles basés sur les méthodes BIAcore et HoldUp pour valider expérimentalement et à grande échelle des prédicteurs d'interaction PDZ-PBM et pour étudier l'influence du contexte de séquence (comme les séquences flanquantes ou les domaines voisins) des PDZs et des PBMs sur l'affinité et la spécificité de leurs interactions. Nous avons identifié des interactions potentielles impliquant les protéines humaines à PDZ MAGI1 et SCRIB soulignant leur implication dans les réseaux de signalisation des protéines G. Une revue de la littérature, combinée avec nos propres résultats, a révélé des mécanismes par lesquels le contexte de séquence influence les affinités et spécificités des interactions impliquant les PDZs. Nous avons discuté ces mécanismes dans une revue publiée. Les connaissances obtenues à partir de cette thèse pourront influencer positivement de futures études sur les interactions PDZ-PBM, en particulier, et sur les interactions domaine-motif linéaire en général.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC. / Heredirary motor and sensory neuropathy with agenesis of the corpus callosum (HMSN/ACC) is a severe neurodegenerative disease associated with developmental anomalies in the central nervous system and mental retardation. Although rare worldwide, this autosomal-recessive disorder is frequent in the French-Canadian population of Quebec because of a founder effect. Different mutations in the gene coding for the potassiumchloride co-transporter 3 (KCC3) have been associated with the disease; however, little is known about the mechanisms leading to the inactivation of the co-transporter. We sequenced 26 exons of the KCC3 gene in individuals recruited worldwide and suspected to be affected by the disease. We identified three new mutations. The functional study of these mutations gave confirmation of a systematic loss-of-function of the mutant co-transporters. As the loss of function occurs mainly via the elimination of C-terminal peptide fragments, we focused on the identification of C-terminal interacting partners. Using different biochemical approaches, such as yeast two-hydbrid, pull-down, and immunostaining, we established that KCC3 interacts with the brain-type creatine kinase CK-B and that this interaction is disrupted by the HMSN/ACC truncation mutations. In addition, a specific creatine kinase inhibitor inactivates KCC3 and shows for the first time the functional link between KCC3 and its C-terminal partners. In addition, we found that anomalies in KCC3 transit—as seen in cultured cells, in Xenopus oocytes, and in human brain samples—is a major pathogenic mechanism that also leads to the disease manifestations.

L’identification de molécules organiques capables de moduler des interactions protéine-protéine (PPIs) est longtemps restée un domaine peu exploité par la recherche pharmaceutique privée comme académique. Cependant, le développement de méthodologies innovantes pour l’étude des PPIs et la validation récente de ce type d’inhibiteurs dans des essais précliniques, démontrent que les PPIs constituent une nouvelle source de cibles importantes. Les composés capables de moduler ces interactions représentent une nouvelle classe d’outils prometteurs, tant en recherche fondamentale qu’en thérapeutique. Elles peuvent aider à différencier les multiples fonctions portées par une même protéine, à replacer la protéine dans une cascade de réactions, ainsi qu’à disséquer et reconstituer des réseaux de signalisations protéiques. Ces molécules permettront également de faire émerger de nouvelles familles d’agents pharmacologiques actifs dans diverses pathologies.Mon travail de thèse s'est projeté dans l'avenir de la recherche biomédicale, en ciblant les interactions protéine-protéine. J’ai pu durant mon doctorat mettre en œuvre plusieurs méthodologies pour étudier et caractériser des interactions protéiques afin de développer des inhibiteurs de ces interactions. J’ai ainsi pu travailler sur l’optimisation d’un composé inhibiteur de l’interaction de la protéine virale Nef VIH-1 avec les domaines SH3 des Src kinases, le composé DLC27. J’ai également pu mettre en évidence la pertinence biologique de ce composé, qui cible un mode d’interaction unique, ou très rare, au niveau cellulaire en étudiant l’interaction avec les domaines SH3 de deux protéines, ALIX (ALG2-Interacting Protein X) et la sous-unité p85 de la PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase).J’ai également pu caractériser la surface et le mode d’interaction de protéines virales impliquées dans le complexe de réplication du virus du SRAS (Syndrome Respiratoire Aigu Sévère). Cette étude tend à montrer que la protéine virale nsp10 agit comme une plateforme de reconnaissance pour ses partenaires, les protéines virales nsp14 et nsp16. Ces interactions permettent l’activation ou l’augmentation des activités respectives de nsp16 et nsp14 et jouent un rôle au niveau de la réplication virale. Suite à l’identification d’un ‘point chaud’ d’interaction, le résidu Tyr96 à la surface de nsp10, nous avons mis en évidence la première famille de molécules inhibitrices du complexe nsp10-nsp14 en couplant des méthodes informatiques (in silico) à des criblages expérimentaux. Ces molécules pourraient être utilisées comme antiviraux ou servir d’outils pour la recherche, en permettant par exemple de mieux comprendre et d’élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la réplication du virus du SRAS et des coronavirus en général. / Protein-protein interactions (PPIs) participate in and regulate almost all essential cellular functions. As a consequence, they are frequently involved in various pathologies (going from cancer development to viral replication and host cell infection) but their study remains a challenge.Thus understanding those interactions as well as finding small drug candidates able to modulate them, a field of research not currently fully developed, appear as the future of the healthcare industry.In this context, I chose to learn different techniques to study PPIs that are usually employed in academic (IMR laboratory, CNRS, France) or corporate environments (Genentech, USA). Moreover, I also worked on the development of small organic inhibitors of PPIs coupling in silico methodologies (chemo-informatics, Drug Design) to biological and structural validations.During my PhD, I could manage and work on different projects involving the study of PPIs involved in cancer signaling pathways as well as the development of potent antiviral drugs targeting the HIV and SARS viruses.My organizational, personal and scientific skills as well as the practical experience I developed on various techniques (from cell biology to biophysics, structural biochemistry and Drug Design), make me feel confident on the management of PPIs drug discovery projects.I am thus able to efficiently work on, and manage, the study of protein-protein interactions in various pathologies as well as the development of potent PPIs inhibitors, that will be a major breakthrough for Biotech/Pharma companies in the coming years.

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC. / Heredirary motor and sensory neuropathy with agenesis of the corpus callosum (HMSN/ACC) is a severe neurodegenerative disease associated with developmental anomalies in the central nervous system and mental retardation. Although rare worldwide, this autosomal-recessive disorder is frequent in the French-Canadian population of Quebec because of a founder effect. Different mutations in the gene coding for the potassiumchloride co-transporter 3 (KCC3) have been associated with the disease; however, little is known about the mechanisms leading to the inactivation of the co-transporter. We sequenced 26 exons of the KCC3 gene in individuals recruited worldwide and suspected to be affected by the disease. We identified three new mutations. The functional study of these mutations gave confirmation of a systematic loss-of-function of the mutant co-transporters. As the loss of function occurs mainly via the elimination of C-terminal peptide fragments, we focused on the identification of C-terminal interacting partners. Using different biochemical approaches, such as yeast two-hydbrid, pull-down, and immunostaining, we established that KCC3 interacts with the brain-type creatine kinase CK-B and that this interaction is disrupted by the HMSN/ACC truncation mutations. In addition, a specific creatine kinase inhibitor inactivates KCC3 and shows for the first time the functional link between KCC3 and its C-terminal partners. In addition, we found that anomalies in KCC3 transit—as seen in cultured cells, in Xenopus oocytes, and in human brain samples—is a major pathogenic mechanism that also leads to the disease manifestations.