Würzburg, Univ., Diss., 2000. / Dateien im PDF-Format. Computerdatei im Fernzugriff.

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Würzburg, Universiẗat, Diss., 2000. / Dateien im PDF-Format.

Tübingen, Univ., Diss., 2006.

Die vorliegende Arbeit zeigt die Korrelation zwischen räumlichem und zeitlichem Expressionsmuster von dem Aquaporin NtAQP1 und seiner Funktion im Wasserhaushalt in planta. Immunologische in situ-Studien deuteten auf eine NtAQP1-Protein-Akkumulation in der Wurzelexodermis und -endodermis, im Cortex, in der Nähe der Leitbündel, im Xylemparenchym und in Zellen der Atemhöhle hin. Das Aquaporin wurde auch in longitudinalen Zellreihen der Petiolen in erhöhten Mengen gefunden. Expressionsstudien mit transgenen Pflanzen (Ntaqp1-Promotor::gus oder ::luc) bestätigten die NtAQP1-Akkumulation in der Wurzel, dem Spross und den Petiolen, lokalisierten dessen Expression aber auch in Pollen, Adventivwurzel und Blatthaaren. Die Ntaqp1-Expression wurde während Wachstumsprozessen wie Sprossorientierung nach Gravistimulation oder Photostimulation, Samenkeimung, aber auch während der vergleichsweise schnellen circadianen Blattbewegung induziert. Die Expression wurde weiterhin durch Phytohormone, im Speziellen durch Gibberellinsäure (GA) und osmotischen Stress stimuliert. Weitere Analysen hoben eine diurnale und sogar circadiane Expression von Ntaqp1 in Wurzeln und Petiolen hervor. Die funktionelle Analyse des Aquaporins wurde mittels reverser Genetik und biophysikalischen Studien durchgeführt. Die Antisense-Technik wurde benutzt, um die NtAQP1-Expression in Tabakpflanzen zu reduzieren. Die Antisense (AS)-Pflanzen zeigten eine starke Verringerung der Ntaqp1-mRNA, eine weniger ausgeprägte Verminderung der hoch homologen NtPIP1a-mRNA und keinen Effekt auf die Expression anderer Aquaporin-Genfamilien (PIP2, TIP). Die Funktion von NtAQP1 auf zellulärer Ebene wurde mit einer hierfür neuentwickelten Apparatur untersucht. Der experimentelle Aufbau ermöglichte die Aufzeichnung der osmotisch induzierten Protoplasten-Volumenzunahme. Die Reduktion von NtAQP1 durch die Antisense-Expression verminderte die zelluläre Wasserpermeabilität um mehr als 50 %. Die Funktion von NtAQP1 in der Gesamtpflanze wurde z.B. durch die "High-pressure flow meter" Methode bestimmt. Diese Messungen ergaben eine Reduktion der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit pro Wurzeloberflächeneinheit (KRA) der Wurzeln der AS-Linien um mehr als 50 %. Die KRA wies eine starke diurnale und circadiane Schwankung auf, mit einem Maximum in der Mitte der Lichtperiode, ähnlich dem Verlauf des Expressionsmusters von Ntaqp1 in Wurzeln. Unter gut gewässerten Bedingungen ergaben Gaswechsel-, Spross- (Ystem) und Blatt- Wasserpotenial (Yleaf)-Messungen unterschiedliche Werte in AS- und Kontrollpflanzen. In wasserlimitierender Umgebung zeigten AS-Pflanzen jedoch ein stärker negativeres Y als Kontrollpflanzen, obwohl eine weitere Abnahme der Transpiration in AS-Pflanzen beobachtet werden konnte. Quantitative Analysen belegten eine stärker ausgeprägte Welkreaktion in den AS- als in den Kontrollpflanzen. Quantitative Studien der Blattbewegung von AS- verglichen mit Kontrollpflanzen hoben eine drastische Reduktion in Geschwindigkeit und Ausmaß der Reaktion hervor. Folgende Schlussfolgerungen konnten gezogen werden. NtAQP1 wurde an Orten mit erwartet hohem Wasserfluss von und zum Apoplasten oder Symplasten exprimiert. Außerdem deuteten das spezifische Verteilungsmuster und die zeitliche Expression von NtAQP1 in Petiolen und dem sich biegenden Spross auf eine Beteiligung in der transzellulären Wasserbewegung hin. Die Reduktion von NtAQP1 durch die Antisense-Expression verringerte die zelluläre Pos. Die NtAQP1-Funktion erhöht also eindeutig die Membranwasserpermeabilität von Tabak-Wurzelprotoplasten. Die Abnahme der spezifischen hydraulischen Wurzelleitfähigkeit (KRA) befand sich in der gleichen Größenordnung wie die Verringerung der mittleren zellulären Wasserpermeabilität. Dies weist darauf hin, dass die Aquaporin-Expression essentiell für die Aufrechterhaltung der natürlichen Wurzelleitfähigkeit ist. Die Verringerung von KRA in AS -Pflanzen könnte der erste sichere Beweis dafür sein, dass der Weg der Wasseraufnahme von der Wurzeloberfläche in das Xylem den Übergang über Membranen einschließt. Die Reduktion von NtAQP1 resultierte in einem Wasserstresssignal, das ein Schließen der Stomata zur Folge hatte. NtAQP1 scheint an der Vermeidung von Wasserstress in Tabak beteiligt zu sein. NtAQP1 spielt eine essentielle Rolle bei schnellen Pflanzenbewegungen und der transzellulären Wasserverschiebung. / The presented work shows the analysis of the correlation between the spatial and temporal expression pattern of NtAQP1 and its function in water relation in planta. In situ immunological studies indicated NtAQP1-protein accumulation in the root exodermis and endodermis, in the cortex, close to vascular bundles, in the xylem parenchyma and in cells of the stomatal cavities. The aquaporin was also found to be abundant in longitudinal cell-rows in the petioles. Expression studies with generated transgenic plants (Ntaqp1-promoter::gus or luc) confirmed the Ntaqp1 accumulation in the root, stem and petioles but also revealed further localization in pollen grains, adventitious roots and leaf glandular hairs. Ntaqp1-expression was induced during growth processes, like stem bending after gravistimulation or photostimulation, seed germination and hypocotyl elongation as well as during the comparatively fast circadian leaf movement. The expression was further stimulated by phytohormones, especially gibberellic acid (GA) and osmotic stress. Further analysis displayed a diurnal and even circadian expression of Ntaqp1 in roots and petioles. The functional analysis of the aquaporin was accomplished by reverse genetics and biophysical studies. The antisense technique was used to reduce NtAQP1-expression in tobacco plants. The antisense (AS) plants exhibited a severe reduction of Ntaqp1-mRNA, less reduction of the highly homologous NtPIP1a RNA and no effect on expression of other aquaporin family genes (PIP2, TIP). The function of NtAQP1 at the cellular level was investigated by a newly developed experimental setup to record the osmotically induced increase in protoplast volume. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular waterpermeability Pos for more than 50 %. Function of NtAQP1 at the whole plant level was e.g. measured by the “high-pressure flow meter method”. Those measurements revealed that the root hydraulic conductivity per unit root surface area (KRA) of roots from the AS-lines was reduced by more than 50 %. KRA displayed a strong diurnal and circadian variation with a maximum in the middle of the light period, similar to the expression pattern of Ntaqp1 in roots. Gas exchange-, stem (Ystem) and leaf (Yleaf) water potential measurement gave dissimilar values in AS and control plants under well-watered conditions. Under a water-limiting environment the Y of AS-plants remained at more negative water values, even though a further decrease in transpiration of AS-plants was detected. Quantitative analysis displayed a much stronger wilting reaction in the AS than in the control plants. Quantitative studies of the leaf movement in AS compared to control plants exhibited a dramatic reduction in velocity and also in the extent of the process. The following conclusions can be drawn. NtAQP1 was expressed at sites of anticipated high water fluxes from and to the apoplast or symplast. Additionally, the specific distribution pattern and temporal expression of NtAQP1 in petioles and the bending stem strongly indicate a role in transcellular movement of water. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular Pos. Conclusively, NtAQP1-function increases membrane water permeability of tobacco root protoplasts. The decrease of the specific root hydraulic conductivity (KRA) was in the same order of magnitude as the mean cellular water permeability reduction, indicating that aquaporin expression is essential in maintaining a natural root hydraulic conductance. Reduction of KRA in AS plants might be the first definitive proof that the pathway of water uptake from the root surface to the xylem involves passage across membranes. The absence of NtAQP1 resulted in a water stress signal, causing a certain stomatal closure. NtAQP1 seems to contribute to water stress avoidance in tobacco. NtAQP1 plays an essential role in fast plant movements and transcellular water shift.

Darmstadt, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Darmstadt, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. / Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.