Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La variante d’histone H2AZ joue un rôle important dans l’activation de la transcription, la prolifération cellulaire, le développement et la différentiation. H2AZ orne les promoteurs de la majorité des gènes, mais les mécanismes de bases de cette localisation sont inconnus. La compréhension de l’assemblage et du désassemblage du nucléosome passe par la caractérisation de la dynamique du nucléosome et des chaperonnes d’histones. L’objectif de ma thèse était d’identifier des chaperonnes spécifiques impliqués dans la dynamique de H2AZ en utilisant une approche de protéomique. Pour élucider les mécanismes de déposition/éviction de H2AZ, j’ai purifié le complexe prénucléosomale de H2AZ et j’ai caractérisé toutes les protéines associées. J’ai trouvé que Anp32e fait partie du complexe p400/TIP60 qui est présumée pour être responsable de l’échange d’H2AZ sur la chromatine. Anp32e présente une spécificité pour le dimère H2AZ-H2B, car il n’interagit pas avec le dimère H2A-H2B. L’interaction est accomplie au niveau d’une petite région dans le domaine d’ancrage sur H2AZ et au niveau d’un nouveau domaine ZID sur Anp32e. Finalement, j’ai montré que la suppression d’Anp32e entraine : un défaut dans la dé-répression des gènes dont l’expression est contrôlée par une hormone et une accumulation sur les promoteurs de ces derniers. Dans l’ensemble ces résultats identifient Anp32e comme une nouvelle chaperonne de la variante d’histoneH2AZ impliquée dans l’éviction de H2AZ chez les mammifères. / The histone variant H2AZ has emerged as a key regulator of chromatin function and plays an essential role in transcriptional activation, cell proliferation, development, and differentiation. H2AZ marks nucleosomes flanking the promoters of most genes, but the mechanistic basis for this localization is unknown. A mechanistic understanding of nucleosome assembly/disassembly requiresa detailed knowledge of nucleosome thermodynamics and histone chaperones. The aim of my thesis was to identify specific chaperone involved in H2AZ dynamic by using biochemical and proteomic strategies. To elucidate the mechanism of H2AZ deposition/eviction, I purified the prenucelosomal H2AZ complex and characterized in details the interacting protein partners. I found that Anp32e is a member of the presumed H2A.Z histone-exchange complex p400/TIP60. Bacterially expressed Anp32e binds only to the H2AZ/H2B dimers but not to the H2A/H2B. Anp32e interacts with a short region of the docking domain of H2A.Z. The binding occurred through a novel Anp32e motif, termed ZID. Finally, I show that down regulation of Anp32e interferes with both the de-repression of hormone dependent genes and H2A.Z removal from their promoter. Our data identified Anp32e as a novel mammalian H2AZ chaperone invoved in H2AZ eviction.

Les fibroblastes activés qui composent les stromas tumoraux sont des acteurs majeurs des interactions tumeur-stroma impliquées dans la croissance et la dissémination des cellules tumorales. Ce processus d'activation des fibroblastes est caractérisé par l'expression de marqueurs protéiques spécifiques parmi lesquels figure l'alphaSMA et FAPalpha;. Le TGFbeta;, cytokine secrétée massivement par les cellules tumorales, est un des éléments impliqués dans l'activation des fibroblastes et la formation du stroma tumoral qui en résulte. L'EMMPRIN, glycoprotéine transmembranaire surexprimée dans les cellules tumorales est également un médiateur des interactions tumeur-stroma puisqu'il a la capacité d'induire la synthèse des MMPs par les fibroblastes péri-tumoraux accroissant ainsi la propagation des cellules tumorales à travers l'organisme. Nos travaux identifièrent que le TGFbeta secrété par les cellules tumorales induisait la synthèse du marqueur FAPalpha par les fibroblastes. L'EMMPRIN stromal apparaît comme récepteur de ces signaux tumoraux et est nécessaire à la synthèse du marqueur FAPalpha; par les fibroblastes. L'EMMPRIN participe donc à l'activation TGFbeta; dépendante des fibroblastes. Son inhibition dans ces cellules conduit à un dysfonctionnement de la signalisation médiée par les protéines Smad2/Smad3 aboutissant à une diminution de la synthèse du marqueur alphaSMA ainsi que de certaines protéines matricielles induites par le TGFbeta. L'étude du mécanisme d'action de l'EMMPRIN dans ce processus a permis d'identifier l'EMMPRIN comme nouvelle protéine chaperonne du récepteur de type I au TGFbeta;. / Tumor stroma activated fibroblasts are major actors of tumor stroma interactions taking to tumor growth and spreading. Activated fibroblasts are characterized by the expression of specific markers including alphaSMA and FAPalpha;. The TGFbeta;, a cytokine highly secreted by tumor cells, is one of the key factors involved in fibroblast activation and tumor stroma formation. EMMPRIN, a transmembrane glycoprotein overexpressed in tumor cells, is also a mediator of tumor-stroma interactions by its ability to induce the synthesis of MMPs by peri-tumor fibroblasts enhancing then tumor cells dissemination across the organism.Here, we demonstrate that TGFbeta; secreted by tumor cells is the tumor factor involved in the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. Stromal EMMPRIN appeared to be the receptor of these tumor-stroma interactions and is required for the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. EMMPRIN was also evidenced to take part in TGFbeta;-dependent fibroblast activation. Its inhibition in these cells correlate to a dysfunction in Smad2/Smad3 signaling leading to a decrease in the expression of alphaSMA and matrix proteins induced by TGFbeta;. The study of the mechanism used by EMMPRIN in this process evidenced this protein as a new chaperone for the type I TGFbeta; receptor.

Les anticorps à visée thérapeutique sont en pleine expansion. Le développement de ces protéines issues de la bioingénierie est toutefois entravé par leur tendance naturelle à l'agrégation, particulièrement critique au cours des étapes de repliement. L'association réversible (non covalente) de protéines avec des polymères hydrosolubles pourrait permettre de résoudre ce problème. Nous avons ici étudié les interactions entre des protéines modèles et des dérivés hydrophobes du poly(acrylate de sodium) (PAA) grâce à diverses techniques expérimentales, incluant la spectroscopie de corrélation de fluorescence, le dichroïsme circulaire sous radiation synchrotron, la diffusion de lumière, l'électrophorèse capillaire et la calorimétrie différentielle à balayage. Comme preuve de concept, nous avons démontré que les dérivés du PAA augmentent le rendement de renaturation d'une enzyme modèle, l'anhydrase carbonique bovine, grâce à la protection de conformères partiellement repliés. La stabilisation colloïdale au cours du repliement a été étendue à des fragments d'anticorps de type scFv, d'importants modèles de biothérapeutiques sensibles à l'agrégation. L'efficacité des polymères a aussi été validée pour des immunoglobulines G soumises à un stress thermique. La prédominance de l'association hydrophobe est remise en cause dans cette étude. L'ancrage électrostatique des chaines de PAA s'avère suffisant pour minimiser l'agrégation des protéines, grâce à des associations dynamiques avec les intermédiaires partiellement repliés. Un avantage majeur de ces polymères est la faible quantité nécessaire comparé aux osmolytes conventionnels et l'absence de modification chimique des protéines. / Antibodies constitute the fastest growing class of human biopharmaceuticals. The development of these engineered proteins is yet hampered by their natural propensity towards irreversible aggregation particularly critical during refolding steps. Reversible (non-covalent) association of proteins with water-soluble polymers could circumvent this issue. In the present study, we investigated the interactions between model proteins and hydrophobically-modified poly(sodium acrylate) (PAA) chains with experimental techniques including fluorescence correlation spectroscopy, synchrotron-radiation circular dichroism, light scattering, capillary zone electrophoresis and differential scanning calorimetry. As a proof of concept, we demonstrated that PAA derivatives enhanced the renaturation yield of a single-domain model enzyme, bovine carbonic anhydrase, because of protection of partly-folded conformers against aggregation. Colloidal stabilisation during refolding was extended to two-domain artificial antibody fragments, single chains Fv fragments, as important models of aggregation-prone biotherapeutics. On similar basis, efficient protection was also validated with full-length immunoglobulins G under heat-stress. Prevalence of hydrophobic association between polymers and proteins is questioned in this work. Rather, electrostatic binding with PAA chains turns out to be sufficient to minimize in vitro protein aggregation, most-likely because of dynamic association with partly-folded conformers. A major advantage of these polymers is their use at extremely low amount compared to conventional osmolytes and absence of chemical modification of proteins.

Le cancer de la prostate est le second cancer diagnostiqué chez les hommes dans le monde. Malgré le développement de nouveaux traitements au cours de ces cinq dernières années, les chimiothérapies par taxanes, docetaxel et cabazitaxel, restent des traitements de référence dans la prise en charge des patients atteints de cancer de la prostate métastatique résistant à la castration. Cependant, des résistances primaires et acquises émergent chez environ la moitié des patients. C’est pourquoi, il est urgent de découvrir et de comprendre les mécanismes de résistance aux taxanes afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, de nouvelles thérapies ciblées peuvent émerger de la compréhension des voies de signalisation impliquées dans le cancer de la prostate pour contourner la chimiorésistance et améliorer les traitements. Les protéines chaperonnes jouent un rôle clef dans la régulation de l’homéostasie cellulaire et dans le développement de résistance aux traitements. Elles constituent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour contourner la chimiorésistance. En réalisant un criblage fonctionnel par siARN à partir de profils d’expression génique, nous avons identifié FKBP7, une chaperonne moléculaire encore jamais étudiée chez l’homme, impliquée dans la résistance au docetaxel et au cabazitaxel. FKBP7 est surexprimée dans les tumeurs de la prostate et son expression est corrélée avec la récurrence chez les patients ayant reçu du docetaxel en thérapie néoadjuvante. De plus, FKBP7 est surexprimée dans des lignées cancéreuses prostatiques résistantes aux taxanes et son expression est nécessaire à leur croissance in vitro et à la croissance tumorale dans un modèle murin de résistance au docetaxel. Par des approches de protéomique haut-débit, nous avons identifié la voie de signalisation régulée par FKBP7 qui est responsable de la survie des cellules chimiorésistantes. Enfin, nous proposons une stratégie thérapeutique pour contourner la chimiorésistance au docetaxel et au cabazitaxel en ciblant l’effecteur moléculaire en aval de FKBP7. / Prostate cancer is the second cancer diagnosed among men worldwide. Beside approval of new therapies in the last five years, chemotherapeutic agents, docetaxel and cabazitaxel taxanes remain key treatments for metastatic castration resistant prostate cancers. However, primary and acquired resistance to taxanes still emerged in about half of patients. There is therefore an urgent need to discover and understand the taxane resistance mechanisms in order to identify new therapeutic targets. Indeed, targeted therapies that exploit the signaling pathways involved in prostate cancer are required to overcome chemoresistance and improve treatment outcomes. Molecular chaperones play a key role in the regulation of cellular homeostasis and the development of treatment resistance, and are promising therapeutic targets. Using high throughput siRNA functional screening based on a gene expression signature, we identified FKBP7, involved in acquired resistance to docetaxel and cabazitaxel. FKBP7 is a molecular chaperone that has not been studied in human so far. FKBP7 is overexpressed in prostate tumors and its expression is correlated with recurrence in patients who received docetaxel as neoadjuvant therapy. Moreover, FKBP7 is upregulated in taxane resistant prostate cancer cell lines and its expression sustains their growth in vitro and in a mice model of Docetaxel resistance. Using a high throughput proteomic approach, we identified the signaling pathway regulated by FKBP7 which is responsible for the survival of chemoresistant cells. Finally, we proposed a promising therapeutic strategy to overcome both docetaxel and cabazitaxel chemoresistance by targeting the downstream effector of FKBP7.

La régulation de l’expression des gènes est critique pour l’adaptation des cellules à leur environnement et pour leur homéostasie. La transcription, qui représente une étape essentielle de l’expression des gènes, est contrôlée par plusieurs facteurs et cofacteurs. L’un de ces cofacteurs, TRRAP, correspond à la plus grosse sous-unité de deux complexes de remodelage de la chromatine, SAGA et TIP60. TRRAP interagit avec divers facteurs de transcription, tels que c-MYC et E2Fs et permet ainsi le recrutement de SAGA et TIP60 aux promoteurs des gènes. TRRAP est un membre d’une famille de kinases atypiques, les PIKKs. Des études antérieures ont défini la co-chaperonne TTT comme régulateur essentiel de la stabilité et l’activité des PIKKs. Contrairement aux autres PIKKs, TRRAP ne possède pas les résidus requis à son activité catalytique et représente donc la seule pseudo-kinase parmi les PIKKs. Bien que TTT interagit et stabilise TRRAP, son rôle sur l’activité de ce dernier reste inconnu. En utilisant un système de dégron inductible qui permet la dégradation rapide de protéines endogènes, nous avons démontré que TTT est requis pour l’assemblage de TRRAP dans ses complexes fonctionnels précédent son import nucléaire. De plus, à travers des analyses transcriptomiques, nous avons pu déterminer que TTT régule la transcription de plusieurs gènes TRRAP-dépendants dans des cellules de cancer colorectal. L’analyse du profile de fixation de TRRAP à l’échelle du génome grâce à la technique du CUT&RUN suivie d’un séquençage à haut débit (CUT&RUN-seq), a permis d’identifier les cibles directes de TRRAP, parmi lesquelles seule une fraction restreinte correspond à des cibles directes de MYC. Nous avons également découvert que TRRAP possède un rôle de répresseur direct sur la transcription d’une partie des gènes stimulés par l’interféron (ISGs) qui interviennent dans la réponse à l’interféron du système immunitaire innée. En outre, nos résultats suggèrent que TRRAP et sa co-chaperonne TTT participent à la tumorigenèse notamment en maintenant et régulant un programme transcriptionnel spécifique. / Gene expression regulation is critical for cells to adapt to external changes and maintain their homeostasis. Transcription is an essential step in gene expression and is controlled by numerous factors and cofactors. One such cofactor is TRRAP, the largest subunit of two distinct chromatin-modifying complexes, SAGA and TIP60. TRRAP interacts with a diverse range of transcription factors including c-MYC and E2Fs, and mediates the recruitment of SAGA and TIP60 to gene promoters. TRRAP is a member of the PIKK family of atypical kinases. Prior studies defined the TTT co-chaperone as an essential regulator of PIKK stability and activity. In contrast to its cognate kinases, TRRAP lacks catalytic residues and is the sole pseudokinase among PIKKs. Although TTT has been shown to stabilize and interact with TRRAP, the role of TTT on TRRAP function remains unknown. Using an inducible degron system that allows the rapid and acute depletion of endogenous proteins, we demonstrated that TTT is required to assemble TRRAP within its functional complexes prior its nuclear import. Additionally, through transcriptomic analyses we determined that TTT regulates a large number of TRRAP-dependent genes in colorectal cancer cells. Profiling of the genome-wide binding of TRRAP via CUT&RUN-seq identified the direct targets of TRRAP, of which only a small fraction overlaps with MYC targets. We also uncovered a direct inhibitory role of TRRAP on a subset of the interferon-stimulated genes, which mediate the interferon response in the innate immune system. Altogether, our data suggest that TRRAP and its chaperone TTT are involved in tumorigenesis through the maintenance of a specific transcriptional program.

Le lupus érythémateux disséminé est une maladie autoimmune systémique provoquant des lésions tissulaires graves. Notre laboratoire a découvert un peptide phosphorylé, appelé P140, présentant des propriétés thérapeutiques pour le traitement du lupus. Le mode d’action du peptide P140 dans le traitement du lupus repose sur son interaction avec la protéine de choc thermique HSPA8/HSC70 et l’objectif de mon projet de thèse a été de consolider et compléter ce mécanisme. Nous avons démontré qu’après internalisation par endocytose dépendante des clathrines, le peptide P140 se localise rapidement au sein du lysosome des lymphocytes B. Dans cet organelle, il réduit l’import de substrat cytosolique par autophagie dépendante des chaperonnes en ciblant et réduisant l’activité de HSPA8 intralysosomale. Nous avons également entrepris une analyse comparative du répertoire des lymphocytes T et B des souris lupiques par rapport aux souris saines. Nos résultats révèlent un changement dans la fréquence de certains réarrangements du TCR entre les souris lupiques et les souris saines et un effet bénéfique du peptide P140 sur certains réarrangements associés au lupus. / Systemic lupus erythematosus is a multi-organ autoimmune disease provoking tissue damages. Our laboratory has discovered a phosphorylated peptide, named P140, with therapeutic activities in lupus. The mode of action used by P140 peptide relies on its interaction with the heat shock protein HSPA8/HSC70. The aim of my thesis project was to consolidate and complete this HSPA8-dependent mechanism. We have demonstrated that, upon internalization by clathrin-mediated endocytosis, P140 peptide homes rapidly into B cell lysosome. In this organelle, the peptide reduces chaperone-mediated autophagy by interacting and inhibiting intralysosomal HSPA8 activity. We also performed a comparative analysis of T cell and B cell repertoire on lupic mice compared to healthy mice Our results show a modification in the frequency of certain TCR rearrangements between lupus-prone mice and healthy mice and a beneficial effect of P140 peptide on certain lupus-associated rearrangements.

Nous avons cherché à concevoir des macromolécules ayant un comportement de chaperonne vis à vis de diverses protéines et notamment en fondant leur activité sur des propriétés stimulables par la lumière. Les interactions hydrophobes constituent un paramètre clé de l'effet chaperonne qui a été mis en évidence dans les chaperonnes biologiques aussi bien que dans les chaperonnes artificielles. Nous avons synthétisé des polymères à amphiphilie photo-stimulable portant des chaînes pendantes azobenzènes. Ces polymères sont capables d'association/dissociation photo-stimulables avec des particules colloïdales à coeur hydrophobe. Différents paramètres peuvent moduler ces associations comme la force ionique, le taux de modification hydrophobe, la nature du greffon... Ces polymères ont montré plusieurs propriétés caractéristiques de chaperonnes artificielles : ils déstabilisent une protéine modèle, le cytochrome C, protègent de l'agrégation et augmentent l'efficacité des procédés de renaturation de l'anhydrase carbonique et d'un fragment d'anticorps surexprimé en bactérie. L'évolution du repliement a été caractérisée par suivi des structures secondaires en dichroïsme circulaire et par suivi de la compacité des protéines en fluorescence. L'association polymère/protéine a été étudiée par électrophorèse capillaire et par diffusion de la lumière.

Le système de sécrétion de type III est présent chez plusieurs pathogènes à Gram négatif chez qui cette véritable nanomachine est impliquée dans le transport de molécules de virulence directement des bactéries vers le cytoplasme des cellules-cible. Pseudomonas aeruginosa, bactérie dont l'aiguille de sécrétion de type III est étudiée dans cette thèse, est responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce système de sécrétion est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne et d'une structure creuse en forme d'aiguille qui est un homopolymère d'une petite protéine.<br /><br />Dans le cytoplasme bactérien, la protéine PscF qui forme l'aiguille de type III chez P. aeruginosa est stabilisée avant sa sécrétion par 2 chaperonnes distinctes; PscE et PscG. Ceci est nécessaire à la fonctionnalité du système de sécrétion de type III.<br /><br />La structure cristallographique à 2.0A de résolution du complexe hétérotrimérique PscE:PscF55-85-PscG révèle que le domaine C-terminal de la protéine de l'aiguille PscF, impliqué dans le processus de polymérisation, est enfoui dans une cavité hydrophobe de la protéine PscG repliée de façon semblable à un domaine TPR. Ceci montre que le repliement macromoléculaire nécessaire pour stabiliser la protéine de l'aiguille de type III est différent de celui décrit chez le pilus de type IV et le flagelle. Les résidus qui précèdent l'hélice C-terminale de PscF sont maintenus dépliés par des interactions hydrophobes avec PscG. Ainsi, avant sa sécrétion, PscF est maintenue partiellement dépliée par ses chaperonnes. Elle transiterait ensuite sous forme partiellement dépliée à travers l'aiguille avant de se replier lors de sa polymérisation.<br /><br />La rupture des interactions spécifiques entre PscG et PscF entraîne une nette baisse de la cytotoxicité de la bactérie envers une lignée de macrophages, ce qui indique que cet hétérotrimère essentiel, qui possède des homologues chez une grande variété de pathogènes, est une cible thérapeutique attractive pour le développement de nouveaux médicaments.