Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 164-169 [59 réf.].

Le profil pharmacocinétique de l'immunosuppresseur mycophénolate mofétil (MMF) est caractérisé par une importante variabilité interindividuelle chez les patients greffés. Or, il existe un lien entre la pharmacocinétique et la réponse au MMF (efficacité et apparition d'effets secondaires). Le metabolite actif, l'acide mycophénolique (MPA), est métabolisé par les UDP-glucuronosyltransférases UGT1A8, 1A9 et 2B7, formant le glucuronide (G) majeur et inactif, MPAG et le metabolite actif et toxique AcMPAG. Le transporteur ABCC2 (Multidrug Resistance Protein 2) est de plus impliqué dans l'excrétion du MPA et de ses metabolites. Nous avons d'abord développé une méthode analytique pour la mesure des niveaux plasmatiques et urinaires du MPA, MPAG et AcMPAG en utilisant la chromatographic liquide couplée à la spectrométrie de masse. Une étude pharmacogénétique a subséquemment été effectuée chez 52 individus sains porteurs de polymorphismes fonctionnels du métabolisme et du transport, sélectionnés suite à un criblage génétique de plus de 305 individus. Certains variants entraînent une augmentation (UGT1A9*3 et UGT2B7*2) ou une diminution (UGT1A9 -275T>A et - 2152C>T) de l'exposition (aire totale sous la courbe de concentration-temps; ASC0-12) au MPA. Toutefois, d'autres variations génétiques (UGT1A9*3 et ABCC2 -24C>T) sont associées à une augmentation de l'exposition au metabolite toxique AcMPAG. Une seconde étude pharmacogénétique réalisée chez 68 transplantés thoraciques a révélé que les variants d'UGT2B7 802T et -138A augmentent significativement l'exposition à l'AcMPAG. De plus, l'exposition à l'AcMPAG >50 pg*h/mL et le ratio métabolique AcMPAG/MPA >2 sont associés à l'augmentation de l'occurrence de rejet, d'infection, d'anémie et de leucopénie. Une dernière étude complétée chez 74 transplantés rénaux a démontré une fréquence accrue d'épisodes infectieux chez les individus porteurs du variant du codon 277A (*3) de YUGT1A8. Ces résultats justifient le besoin d'études pharmacogénétiques additionnelles dans d'autres populations de patients, afin de valider l'influence des facteurs génétiques sur la pharmacocinétique et le résultat clinique. Ces étude sont nécessaires afin d'optimiser le traitement au MMF.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Le mycophénolate mofétil (MMF) est un immunosuppresseur utilisé en prophylaxie du rejet dans le cadre de greffes de rein, de poumon et de cœur. La pharmacocinétique de ce médicament est sujette à une importante variabihté interindividuelle d'origine inconnue. Mon projet de maîtrise avait pour but d'approfondir les connaissances relatives au métabolisme de l'acide mycophénolique (MPA), le metabolite actif du MMF, en regard de sa voie principale de biotransformation, soit la glucuronidation par les enzymes UDPglucuronosyltransférases (UGT). Mes travaux ont contribué à l'identification des trois isoformes UGT principalement impliquées dans la formation des deux dérivés glucuronides du MP A, soit les isoformes UGT1A8, UGT1A9 et UGT2B7. Une première étude a permis l'identification de variations génétiques (polymorphismes) du gène UGT1A9 associées à une altération de l'activité de conjugaison du MP A. Dans une seconde étude, des polymorphismes de la région codante des gènes UGT1A8 et UGT2B7 ont démontré une modification importante de l'efficacité catalytique de la protéine UGT pour la formation des glucuronides phénolique et acyl du MP A. À ce jour, nos résultats suggèrent que certains polymorphismes des enzymes UGT pourraient être responsables de la variabilité interindividuelle observée dans la pharmacocinétique du MMF en clinique.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Pharmacie. Pharmacochimie : Nantes : 2007. / Bibliogr.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue une avenue thérapeutique potentiellement curative pour plusieurs cancers hématologiques comme la leucémie. L’utilisation d’une thérapie immunosuppressive pour prévenir la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est un déterminant majeur du succès de la greffe. Malgré tout, cette complication survient chez 25 à 50% des transplantés et est une cause majeure de mortalité. L’optimisation du régime d'immunosuppression est un facteur facilement modifiable qui pourrait améliorer le pronostic des patients. Particulièrement, les polymorphismes du génome du donneur ou du receveur dans les voies pharmacogénomiques des immunosuppresseurs pourraient influencer l’exposition et l’action de ces médicaments, de même que le pronostic du patient. Le profilage de 20 pharmacogènes prioritaires chez des paires de donneurs-receveurs en greffe de CSH a permis d’identifier des variations génétiques liées au risque de la GvHD aiguë. Principalement, le statut génétique du receveur pour les protéines ABCC1 et ABCC2, impliquées dans le transport du méthotrexate (MTX), ainsi que des cibles moléculaires de ce médicament (ATIC et MTHFR) ont été associées au risque de GvHD aiguë. Similairement, le NFATc1, codant pour une cible moléculaire de la cyclosporine, augmentait lui aussi le risque de la maladie. Les porteurs de deux génotypes à risque et plus étaient particulièrement prédisposés à développer cette complication. Par surcroît, le statut génétique du donneur influençait également le pronostic du receveur après la greffe. Entre autres, des allèles protecteurs ont été identifiés dans les voies liées au transport (SLC19A1) et à l’action du MTX (DHFR). Inversement, NFATc2 a été associé à une augmentation du risque de GvHD aiguë. Afin de mieux comprendre les associations observées entre ces marqueurs génétiques et le risque de GvHD aiguë, une étude prospective innovante est en cours chez des greffés de CSH. Cette étude permettra d’étudier comment la génétique du patient ou du donneur peut influencer la pharmacocinétique et la pharmacodynamie des immunosuppresseurs, de même que leurs liens avec la GvHD aiguë. Ces paramètres sont quantifiés grâce à des approches analytiques que nous avons mises au point afin de répondre aux besoins spécifiques et uniques de cette étude. Les approches proposées dans cette thèse sont complémentaires aux méthodes classiques de suivi des immunosuppresseurs et pourraient aider à optimiser la pharmacothérapie du patient. Une meilleure identification des patients à haut risque de GvHD aiguë avant la greffe, basée sur des marqueurs pharmacogénomiques identitaires, pourrait guider le choix de la prophylaxie immunosuppressive, et ainsi améliorer l’issue clinique de la greffe. / Hematopoietic stem cells transplantation (HSCT) is a potentially curative therapy for several hematological cancers such as leukemia. Following transplantation, effective immunosuppression prophylaxis is mandatory to prevent the graft-versus-host disease (GvHD) and improved the clinical outcome. However, GvHD still occurs in 25-50% of transplanted patient and is associated with high mortality rate. Optimization of immunosuppressive therapy is an easily modifiable factor that can improve the prognosis of patient after HSCT. In particular, polymorphisms of recipient and donor in genes with functions related to drugs transport, metabolism and action might influence the exposure and the efficacy of immunosuppressive therapy, and thus the clinical outcome. The evaluation of 20 candidate pharmacogenes in donor-recipient pairs of HSCT identified genetic polymorphisms associated with the risk of GvHD. Recipient genetic status for ABCC1 and ABCC2, related to methotrexate (MTX) transport, as well as polymorphisms in genes encoding molecular targets (ATIC and MTHFR) of this drug, exhibit a remarkable influence on acute GvHD prevalence. Similarly, the cyclosporin molecular target NFATc1 also increases the risk of GvHD. Importantly, the presence of ≥2 of these SNPs was found to be associated with high risk of developing severe grade of acute GvHD. In donor, we identified protective alleles in pathways related to transport (SLC19A1) and action (DHFR) of MTX. Conversely, NFATc2 enhances the risk of acute GvHD. To improve our understanding of the process behind these associations, we have an ongoing prospective study in HSCT. This innovative study will provide the opportunity to evaluate the influence of such genetic markers on the pharmacokinetic and pharmacodynamic of immunosuppressive drugs, as well as their relation with the risk of GvHD. For the specific needs of our study, we have developed two analytical methods based on mass spectrometry. The approaches we proposed in this thesis are complementary to conventional monitoring method and are promising tools to optimize drug therapy in HSCT. Identification of such biomarkers assessed before transplantation can help personalized patient care in order to prevent GvHD and improve survival.

Reproduction de : Mémoire du DES : Pharmacie hospitalière : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

En transplantation d'organes solides ou en greffe de moelle osseuse, la ciclosporine et letacrolimus ont prouvé leur efficacité. Ils sont cependant de maniement délicat du fait d'unintervalle thérapeutique étroit et d'une grande variabilité pharmacocinétique inter et intraindividuelle.Un suivi thérapeutique et une adaptation des posologies de ces médicaments sontnécessaires pour diminuer le risque de rejet et limiter leur toxicité.Un modèle PBPK est construit à partir de considérations anatomiques, physiologiques etbiochimiques. Il permet d'apporter des informations sur les cinétiques tissulaires et sur lesrépercussions des altérations physiologiques ou pathologiques.Les modalités optimales d'administration de la ciclosporine en greffe de moelle osseusepédiatrique, ainsi que les zones thérapeutiques à atteindre, font l'objet de débats. Un modèlePBPK-PD pour la ciclosporine construit à partir de données chez le rat puis extrapolé etvalidé chez l'homme a permis d'estimer l'exposition à la ciclosporine dans les organes ciblesde la GVH, de comparer les modalités d'administration en perfusion intraveineuse, et dedéfinir des concentrations cibles en fonction des indications. L'adaptation posologique du tacrolimus en transplantation hépatique par la méthodeBayésienne reste relativement imprécise dans la période initiale après la greffe, parce que lesfacteurs de variabilité sont imparfaitement connus. Un modèle PBPK a été construit et évaluéafin de rechercher les covariables pertinentes par une approche bottom-up : la fonctionhépatique, l'hématocrite, le génotype du cytochrome P450 3A5 du donneur, la fraction libre etcertaines comédications ont été retrouvées. / In solid organ or bone marrow transplantation, cyclosporine and tacrolimus have proven theireffectiveness. However, their handling remains difficult because of a narrow therapeuticwindow and high inter- and intra-individual pharmacokinetic variabilities. Therapeutic drugmonitoring and dose adjustments of these drugs are necessary to reduce the risk of rejectionand minimize their toxicity.A PBPK model is built from anatomical, physiological and biochemical data. It can provideinformation on the kinetics in tissues and on the effects of physiological or pathologicalalterations.How to best administer cyclosporine in pediatric bone marrow transplantation, as well astherapeutic ranges to achieve, are discussed. A PBPK-PD model for cyclosporin built fromdata in the rat and then extrapolated and validated in humans was used to estimate exposure tocyclosporine in the target organs of GVHD, to compare schedules of administration byintravenous infusion, and to define target blood concentration based on therapeuticindications.Dose adjustment of tacrolimus in liver transplant patients by the Bayesian method is relativelyinaccurate in the initial period after transplantation because factors of variability areincompletly understood. A PBPK model was constructed and evaluated in order to findrelevant covariates by a bottom-up approach. Liver function, hematocrit, cytochrome P4503A5 genotype of the donor, the unbound fraction and some comedications were found. Newdosing regimen recommendations have been developed from this model.

Le transfert adoptif de lymphocytes T virus-spécifiques ou ‘’Chimeric Antigen Receptors’’ (CAR) s’est avéré efficace pour le traitement de plusieurs types d’infections virales et certains cancers à la suite d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, l’immunosuppression administrée pour la prévention du rejet de greffe et de la maladie du greffon contre l’hôte limite l’efficacité et la persistance à long terme des réponses médiées par ces lymphocytes. L’agent immunosuppresseur Tacrolimus (FK506) est parmi les plus utilisés, et fonctionne en liant la protéine FK506-Binding protein (FKBP12) afin d’exercer ses effets immunosuppresseurs sur les lymphocytes T. Dans le but de fournir une protection anti-virale, mais également anti-lymphoprolifératif des lymphocytes B et permettre la poursuite de cette immunosuppression préventive, nous avons pour objectif de générer des lymphocytes CAR-T et virus-spécifiques résistants à l’action du FK506 par l’invalidation du FKBP12. En utilisant la méthode d’édition génique basée sur les CRISPR ciblés par la nucléase Cas9, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T stimulés par CD3-CD28. L’efficacité du knockout a été validée par Western Blot et TIDE sequencing. Le knock-out du gène du FKBP12 a conféré un maintien de la croissance cellulaire et des fonctions effectrices telles que la synthèse de cytokines IL-2, TNFα et IFN γ en présence de Tacrolimus comparativement aux cellules contrôles. Par la même méthode, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T multivirus-spécifiques dont l’efficacité a été validée par cytométrie en flux. Les fonctions effectrices ont également été maintenues en présence de tacrolimus et ont été évaluées par ELISpot. Enfin, des lignées de lymphocytes T multivirus spécifiques dont le gène du FKBP12 a été invalidé ont été transduites avec un vecteur lentiviral dans le but d’exprimer un CAR CD19 dont l’expression a été validée par cytométrie en flux et la réactivité maintenue en présence de tacrolimus. En conclusion, ces résultats nous ont permis de démontrer la faisabilité de génération de lymphocytes T « triple fonction » anti-tumorales, anti-virales et résistantes au tacrolimus. L’application de cette approche semble prometteuse dans un contexte d’une immunothérapie adoptive anti-virale et anti-tumorale post-transplantation de moelle osseuse. / Adoptive transfer of virus-specific T lymphocytes or CAR-T cells has been shown to be effective for the treatment of several types of viral infections and certain cancers following hematopoietic cell transplantation. However, immunosuppression administered for the prevention of transplant rejection and graft-versus-host disease limits the efficacy and long-term persistence of responses mediated by these lymphocytes. The widely used immunosuppressive agent Tacrolimus (FK506) requires FK506-Binding protein (FKBP12) to exert its immunosuppressive effects on T cells. We undertook to engineer a multifunctional T-cell therapy to both optimally prevent viral reactivation and relapse of B-cell malignancies post-transplant in the context of immunosuppression. The objective of our work is to generate tacrolimus resistant, multivirus-specific T-cell lines expressing an anti-CD19 CAR. Using the gene editing method based on Clustered Regular interspaced short palidromic repeats (CRISPR) targeted by the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) nuclease, we were able to invalidate the FKBP12 gene on activated T cells (confirmed by TIDE sequencing and western blotting). Invalidation of FKBP12 conferred maintenance of cell growth and effector functions such as the synthesis of cytokines IL-2, TNFα and IFNγ in the presence of Tacrolimus. Using the same method, we were able to delete the FKBP12 gene in virus-specific T lymphocytes. Effector functions were also maintained in the presence of tacrolimus. Finally, we integrated an anti-CD19 CAR by lentiviral transduction into FKBP12-edited multi-virus T-cell lines, and the efficiency of transduction was determined by flow cytometry. The cells maintained their viral reactivity in the presence of tacrolimus. In conclusion, we were able to confirm the feasibility of generation of ‘’triple function’’ T cells (anti-viral, anti-tumoral and tacrolimus resistant). Multifunctional T-cell product manufacturing is a promising approach to optimize post-transplant T-cell immunity against opportunistic pathogens and underlying malignancies.

La thérapie antirétrovirale (TAR) n'éradique pas le VIH de l'organisme. Le VIH persiste grâce à la prolifération de lymphocytes T CD4+ infectés de manière latente. De plus, bien que la plupart des provirus persistent sous une forme latente, un petit nombre de cellules infectées produisent des protéines virales et des virions. Les immunosuppresseurs administrés aux personnes subissant une greffe de rein, pour prévenir le rejet d’organe, inhibent la prolifération des lymphocytes T et l'activation immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que les immunosuppresseurs pourraient réduire à la fois la taille du réservoir viral latent ainsi que les marqueurs associés à la production résiduelle de VIH. Sept participants vivant avec le VIH sous TAR efficace et ayant subi une transplantation rénale suivie de la prise d’un traitement immunosuppresseur ont été recrutés. Des échantillons sanguins longitudinaux ont été prélevés avant et après la greffe (6-7 échantillons/participant, sur 2 ans). Les effets des immunosuppresseurs sur l'activation des lymphocytes T ainsi que les taux d’anticorps plasmatiques dirigés contre l'enveloppe du VIH (un reflet de la production virale résiduelle) ont été évalués par cytométrie en flux et ELISA, respectivement. L'ADN total du VIH et les transcrits d'ARN-gag-LTR associés aux cellules ont été quantifiés par qPCR et la fréquence des cellules p24+ par HIV-Flow. Pour confirmer les résultats obtenus in vivo, nous avons optimisé un protocole de culture cellulaire pour évaluer l'impact des immunosuppresseurs les plus fréquemment utilisés (MMF, tacrolimus, dasatinib) sur les cellules infectées dans un environnement contrôlé. Suite à la transplantation et à l’initiation du traitement immunosuppresseur, nous avons observé une diminution significative des niveaux d'expression des marqueurs d’activation et de prolifération HLA-DR et Ki67 dans les lymphocytes T CD4+, accompagnée d'une augmentation de la fréquence des cellules mémoires centrales et d'une forte diminution de la fréquence des lymphocytes T régulateurs. Les niveaux d'anticorps ciblant l'enveloppe du VIH ont également diminué pendant le traitement immunosuppresseur. Il y avait une diminution modeste et transitoire des niveaux d'ADN et d'ARN du VIH un mois après la transplantation rénale. Les résultats de HIV-Flow n'ont montré aucun impact significatif des immunosuppresseurs sur le réservoir inductible, avec de grandes variations entre les participants. Le modèle de culture cellulaire in vitro a révélé que de faibles doses d'immunosuppresseurs induisent généralement une diminution des marqueurs du VIH, alors que des doses plus élevées conduisent à des variations dépendantes des donneurs. Ainsi, nos résultats montrent que les traitements immunosuppresseurs diminuent la prolifération et l'activation des lymphocytes T CD4+, ce qui est concomitant avec une diminution modeste et transitoire des taux d'ADN et d'ARN du VIH. Nos résultats indiquent que la combinaison des traitements immunosuppresseurs actuels sont toutefois insuffisants pour affecter profondément et durablement le réservoir du VIH et suggèrent que la taille du réservoir est étroitement régulée par des forces homéostatiques difficiles à contrer. / Antiretroviral therapy (ART) does not eradicate HIV from the body. HIV persists through proliferation of latently infected CD4+T-cells. Moreover, although most proviruses persist in a latent form, a small number of infected cells produce viral protein and virions. Immunosuppressants given to people undergoing kidney transplants to prevent rejection inhibit T-cell proliferation and immune activation. We hypothesized that immunosuppressants could reduce both the size of the latent viral reservoir as well as markers associated with residual production of HIV. Seven participants living with HIV on suppressive ART who underwent kidney transplantation and initiated immunosuppressive therapy were enrolled. Longitudinal blood samples were collected before and after the transplant (6-7 samples/participant, over 2years). The effects of immunosuppressants on T-cell activation as well as plasma HIV-envelope antibody responses (a surrogate of residual viral production) were assessed by flow cytometry and ELISA, respectively. Total HIV-DNA and cell-associated LTR-gag-RNA transcripts were quantified by qPCR and the frequency of p24+ cells by HIV-Flow in isolated CD4+T-cells. To confirm the results saw in vivo, we optimized a cell culture protocol to assess the impact of frequently given immunosuppressants (tacrolimus, MMF and dasatinib) on infected cells in a controlled environment. Following organ transplant and initiation of immunosuppressive treatment, we observed a significant decrease in the expression levels of HLA-DR and Ki67 in CD4+T-cells, which was accompanied by an increase in the frequency of central memory cells and a sharp decrease in the frequency of regulatory T-cells. Antibody levels targeting HIV envelope also decreased during immunosuppressive therapy. There was a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels one month following kidney transplantation. HIV-Flow results showed no significant impact of immunosuppressants on the inducible reservoir, with large variations between participants. The in vitro cell culture model showed that low doses of immunosuppressants generally induces a reduction in HIV markers, but higher doses lead to variations between donors. Immunosuppressive therapy decreases the proliferation and activation of CD4+ T-cells which is concomitant with a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels. Our results indicate that current immunosuppressive drugs are insufficient to profoundly and durably affect the HIV reservoir and suggest that the size of the reservoir is tightly regulated by homeostatic forces that are difficult to counteract.