Le transfert adoptif de lymphocytes T virus-spécifiques ou ‘’Chimeric Antigen Receptors’’ (CAR) s’est avéré efficace pour le traitement de plusieurs types d’infections virales et certains cancers à la suite d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, l’immunosuppression administrée pour la prévention du rejet de greffe et de la maladie du greffon contre l’hôte limite l’efficacité et la persistance à long terme des réponses médiées par ces lymphocytes. L’agent immunosuppresseur Tacrolimus (FK506) est parmi les plus utilisés, et fonctionne en liant la protéine FK506-Binding protein (FKBP12) afin d’exercer ses effets immunosuppresseurs sur les lymphocytes T. Dans le but de fournir une protection anti-virale, mais également anti-lymphoprolifératif des lymphocytes B et permettre la poursuite de cette immunosuppression préventive, nous avons pour objectif de générer des lymphocytes CAR-T et virus-spécifiques résistants à l’action du FK506 par l’invalidation du FKBP12. En utilisant la méthode d’édition génique basée sur les CRISPR ciblés par la nucléase Cas9, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T stimulés par CD3-CD28. L’efficacité du knockout a été validée par Western Blot et TIDE sequencing. Le knock-out du gène du FKBP12 a conféré un maintien de la croissance cellulaire et des fonctions effectrices telles que la synthèse de cytokines IL-2, TNFα et IFN γ en présence de Tacrolimus comparativement aux cellules contrôles. Par la même méthode, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T multivirus-spécifiques dont l’efficacité a été validée par cytométrie en flux. Les fonctions effectrices ont également été maintenues en présence de tacrolimus et ont été évaluées par ELISpot. Enfin, des lignées de lymphocytes T multivirus spécifiques dont le gène du FKBP12 a été invalidé ont été transduites avec un vecteur lentiviral dans le but d’exprimer un CAR CD19 dont l’expression a été validée par cytométrie en flux et la réactivité maintenue en présence de tacrolimus. En conclusion, ces résultats nous ont permis de démontrer la faisabilité de génération de lymphocytes T « triple fonction » anti-tumorales, anti-virales et résistantes au tacrolimus. L’application de cette approche semble prometteuse dans un contexte d’une immunothérapie adoptive anti-virale et anti-tumorale post-transplantation de moelle osseuse. / Adoptive transfer of virus-specific T lymphocytes or CAR-T cells has been shown to be effective for the treatment of several types of viral infections and certain cancers following hematopoietic cell transplantation. However, immunosuppression administered for the prevention of transplant rejection and graft-versus-host disease limits the efficacy and long-term persistence of responses mediated by these lymphocytes. The widely used immunosuppressive agent Tacrolimus (FK506) requires FK506-Binding protein (FKBP12) to exert its immunosuppressive effects on T cells. We undertook to engineer a multifunctional T-cell therapy to both optimally prevent viral reactivation and relapse of B-cell malignancies post-transplant in the context of immunosuppression. The objective of our work is to generate tacrolimus resistant, multivirus-specific T-cell lines expressing an anti-CD19 CAR. Using the gene editing method based on Clustered Regular interspaced short palidromic repeats (CRISPR) targeted by the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) nuclease, we were able to invalidate the FKBP12 gene on activated T cells (confirmed by TIDE sequencing and western blotting). Invalidation of FKBP12 conferred maintenance of cell growth and effector functions such as the synthesis of cytokines IL-2, TNFα and IFNγ in the presence of Tacrolimus. Using the same method, we were able to delete the FKBP12 gene in virus-specific T lymphocytes. Effector functions were also maintained in the presence of tacrolimus. Finally, we integrated an anti-CD19 CAR by lentiviral transduction into FKBP12-edited multi-virus T-cell lines, and the efficiency of transduction was determined by flow cytometry. The cells maintained their viral reactivity in the presence of tacrolimus. In conclusion, we were able to confirm the feasibility of generation of ‘’triple function’’ T cells (anti-viral, anti-tumoral and tacrolimus resistant). Multifunctional T-cell product manufacturing is a promising approach to optimize post-transplant T-cell immunity against opportunistic pathogens and underlying malignancies.

Différentes stratégies associant des cellules médullaires et/ou des biomatériaux ont été étudiées pour la réparation du tissu osseux dans des modèles murins. Nous avons montré que H2O2 et NaOH, produits utilisés dans les procédés de purification industriels de greffons osseux allogéniques, induisent une détérioration matricielle de surface, diminuant l'adhésion, la prolifération et l'activité de cellules ostéoblastiques. NaHCO3 est apparu comme un agent nettoyant efficace, sans conséquences sur la qualité des greffons et leur cytocompatibilité. Des matrices osseuses ainsi purifiées ont été utilisées comme support pour la réparation par ingénierie tissulaire d'un défaut crânien de taille critique chez la souris. La construction cellules médullaires/matrice, élaborée in vitro, a induit in vivo une régénération osseuse rapide jusqu'au centre du déficit. L'induction de la différenciation ostéoblastique des cellules avant leur implantation n'a pas amélioré nos résultats. Une autre thérapie cellulaire ayant été étudiée est la transplantation systémique de cellules médullaires. L'irradiation corporelle totale et la transplantation ont induit une perte osseuse trabéculaire dramatique. Les cellules transplantées n'ont pas permis la restauration de la masse osseuse mais ont reconstitué un microenvironnement ayant modifié la microarchitecture des receveurs vers un phénotype donneur. Pour ces deux dernières études les cellules médullaires sont issues de souris transgéniques pour la GFP, permettant le suivi des cellules après implantation. L'immunodéplétion des cellules médullaires possédant le CD11b a permis d'enrichir fortement la population cellulaire en ostéoprogéniteurs.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal