Th.--Pharm.--Montpellier 1, 1978.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Notre travail a consisté en un suivi mensuel de l'évolution des concentrations du phosphore inorganique, organique hydrolysable, oxydable dans la petite rade et la grande rade de Toulon. L'activité des phosphatases responsables des conversions du phosphore organique en phosphore inorganique a été mesurée en parallèle. Les concentrations en phosphore inorganique sont toujours très basses (70-80 nM) en particulier en période estivale. Elles fluctuent beaucoup d'avril à septembre et sont plus stables pendant le reste de l'année. La fraction hydrolysable, représente en moyenne 17 à 22 % du phosphore total dont 4 % correspondent à la fraction hydrolysable par la phosphatase. Ces concentrations évoluent de la même manière que celle des formes inorganiques. L'activité phosphatasique dissoute ne représente 10 à 35% en moyenne de l'activité totale. Elle inclut des composantes à forte et à faible affinités, l'activité à faible affinité étant toujours plus élevée que l'activité à forte affinité. Dans les deux sites, les activités à faible affinité présentent des maxima qui coïncident avec ceux des abondances phytoplanctoniques. L'activité particulaire est responsable de près de 60 % de l'activité totale. Elle comporte également des composantes à forte et faible affinités. L'activité à forte affinité serait externe et son pH optimal est proche de celui de l'eau de mer, alors que l'activité à faible affinité serait interne et son pH optimal est supérieur à 9. L'activité particulaire à forte affinité est particulièrement élevée pour la plus petite classe de taille (0,45-1 µm) alors que l'activité à faible affinité est plus élevée pour la plus grande classe (>90µm). Cette activité intracellulaire est plusieurs centaines de fois plus élevés chez les larves de cirripèdes que chez les autres espèces. L'activité phosphatasique à forte affinité est toujours basse quand les concentrations en orthophosphate sont élevées. En revanche, elle augmente souvent quand ces concentrations diminuent. Lorsque ce n'est pas le cas, les concentrations en phosphore organique hydrolysable étaient élevées. L'ensemble de ces données permet de mieux comprendre le mode de régulation de l'activité phosphatasique par les composés phosphorés et de conclure que la mesure de sa composante à forte affinité peut être considérée comme le meilleur indicateur du stress phosphoré dans la rade de Toulon.

L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier l’impact des activités microbiennes sur la spéciation et les flux de phosphore au sein de la colonne d’eau du lac Pavin. Ce lac ferrugineux et méromictique (stratifié de façon permanente) constitue un modèle d’étude des processus de phosphatogenèse, la transition oxique-anoxique délimitant une zone de précipitation de phases minérales phosphatées. Alors que l’on pensait que cette précipitation résultait de processus abiotiques, la contribution des communautés microbiennes a été récemment évoquée mais son ampleur restait à déterminer.Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de révéler une plus forte activité phosphatasique alcaline (APA) au niveau du compartiment supérieur brassé saisonnièrement (mixolimnion). De plus, une corrélation négative entre la concentration en orthophosphates en solution et l’APA a été montrée. Nous avons déterminé le flux et la composition des particules phosphorées sédimentant vers la zone de phosphatogenèse. Nous avons également quantifié par spectrofluorimétrie les inclusions de polyphosphates (poly-P) intracellulaires du mixolimnion et montré qu’elles sont particulièrement abondantes dans le pic de turbidité lié à la biomasse photosynthétique. En outre, l’optimisation d’un protocole de quantification des poly-P nous a permis de déceler plusieurs contraintes associées. Enfin, en utilisant une approche corrélative couplant différentes microscopies, nous avons identifié des bactéries magnétotactiques abondantes à l’interface redox, accumulant des inclusions de soufre et de phosphore (poly-P), et qui pourraient ainsi contribuer significativement aux cycles biogéochimiques de ces éléments. / This work aimed at deciphering the contribution of microbial activities to the speciation and fluxes of phosphorus particles in the water column of Lake Pavin. This ferruginous and meromictic (i.e. permanently stratified) lake is a model case for phosphatogenesis; the oxic/anoxic boundary is located within the water column, delimiting a zone where precipitation of phosphate mineral phases occurs. While it was previously assumed that this precipitation was induced by abiotic processes only, recent clues highlighted the contribution of microbial communities. Yet, the nature and magnitude of this contribution were poorly known.Here, we show that the highest activity of alkaline phosphatases (APA) occurred within the mixolimnion (the upper layer affected by seasonal mixing). Moreover, we found a negative correlation between the concentration of dissolved orthophosphates and the APA. We quantified the flux and the composition of the phosphorus particles settling to the phosphatogenesis zone. We also quantified the intracellular polyphosphate (poly-P) inclusions in the mixolimnion, by using spectrofluorimetry. We showed that poly-P were particularly abundant at depths where the photosynthetic biomass dominated. Furthermore, the development of a poly-P quantification protocol enabled us to detect several associated issues. Finally, using a correlative approach with different types of microscopy, we identified abundant magnetotactic bacteria at the redox interface, containing intracellular inclusions of sulfur and phosphorus (poly-P). These bacteria may therefore play a major role in the biogeochemical cycles of these elements.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le métabolisme lipidique affecte la maturation et la différenciation des cellules osseuses. L'objectif de ma thèse est d'approfondir deux aspects du métabolisme lipidique mal connus, soit les actions de la phospholipase D (PLD) et celles des récepteurs de prostaglandine PGE2 pendant la différenciation des cellules. Une lignée humaine, les Saos-2 et les ostéoblastes primaires issus de calvaria de souriceaux ont servi de modèles cellulaires de la minéralisation physiologique. La culture d'aorte ex vivo sous des conditions d'hyperphosphatémie a été utilisée pour reproduire la calcification de l'aorte qui est un modèle ex vivo de calcification cardiovasculaire (CCV). Nous avons montré que l'expression et l'activité de la PLD augmentent dans les Saos-2 et les ostéoblastes primaires au bout du 5ème jour de la différenciation tandis qu'elles s'accroissent au bout du 6ème jour de traitement de l'aorte dans un milieu d'hyperphosphatémie. Les inhibiteurs de PLD diminuent l'activité de phosphatase alcaline (TNAP) dans les ostéoblastes et dans l'aorte calcifiée tandis que la surexpression de la PLD1 dans les Saos-2 l'augmente. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons suivi la variation d'expression des récepteurs de PGE2 au cours de la maturation des Saos-2. L'expression du gène EP3 augmente au stade tardif de la minéralisation tandis que celle d'EP4 diminue. Pour conclure, ces résultats indiquent que l'activité de la PLD en affectant l'activité de la TNAP pourrait moduler finement la minéralisation physiologique et la CCV et que la minéralisation s'accompagne d'un changement d'expression des récepteurs de PGE2, dans les Saos-2 / Lipid metabolism affects the maturation and the differentiation of bone cells. The aim of my PhD thesis is to explore two unknown sides of lipid metabolism which are the actions of phospholipase D (PLD) and those of prostaglandin PGE2 receptors during cell differentiation. Human lineage, Saos-2 cells and primary osteoblasts from calvaria of mice were used as cellular models of physiological mineralization. The ex vivo aorta culture under hyperphosphatemia conditions has been used to reproduce the calcification of the aorta, which is an ex vivo model of cardiovascular calcification (CVC). We showed that the expression and the activity of PLD increased in Saos-2 and primary osteoblasts after the fifth day of differentiation while in the aorta under hyperphosphatemia condition, PLD activity increased at the end of the sixth day. PLD inhibitors decreased the activity of alkaline phosphatase (TNAP) in osteoblasts and in calcified aorta while the overexpression of PLD1 in the Saos-2 increased it. In the second part of this work, we monitored the variation of the expression of PGE2 receptors during the maturation of Saos-2 cells. The EP3 gene expression increased in the late stage of the mineralization while that of EP4 decreased. In conclusion, these results indicated that the PLD activity by affecting the activity of TNAP could modulate the physiological mineralization and CVC. We showed that the mineralization is dependent of the change of the expression of PGE2 receptors in Saos-2 cells

Chez les patients atteints d'athérosclérose, les calcifications vasculaires sont une caracteristique des plaques d'athérome. Elles résultent de la trans-différenciation des cellules musculaires lisses (CMLs) en cellules de type ostéoblastique et/ou chondrocytaire, notamment en réponse à des cytokines inflammatoires. Les CMLs forment alors des cristaux par l'activité de la phosphatase alcaline non-spécifique du tissu (TNAP). A la lumière de résultats récents, nous avons émis l'hypothèse que la TNAP module la trans-différenciation des CMLs. Nos objectifs étaient donc de déterminer l'effet de la TNAP dans la trans-différenciation des CMLs, et d'étudier les mécanismes impliqués dans son induction. Nous avons observé que l'ajout de phosphatase alcaline purifiée ou la surexpression de TNAP stimule l'expression de marqueurs chondrocytaires en culture de CMLs et de cellules souches mésenchymateuses. De plus, l'inhibition de la TNAP bloque la maturation de chondrocytes primaires. Nous avons observé un rôle des cristaux formés par la TNAP, puisque l'ajout de cristaux seuls ou associés à une matrice collagénique a reproduit les effets de la TNAP. Nous suspectons que la TNAP agit en hydrolysant le PPi et en générant des cristaux. Ces cristaux ensuite induisent l'expression du facteur ostéogénique BMP-2 et l'inhibition des effets de la BMP-2 annule les effets de la TNAP. De plus, nous étions intéressés par les la localisation et la fonction de marqueurs de minéralisation comme les annexines en parallèle de la TNAP. Nous avons observé que l'activité TNAP des CMLs induit la minéralisation en grande partie quand la TNAP est associée aux vésicules matricielles et au fibres de collagène / Vascular calcification (VC) is a hallmark of atherosclerosis plaques. Calcification (formation of apatite) of advanced lesions share common features with endochondral ossification of long bones and appears to stabilize plaques. This process is associated with trans-differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) into chondrocyte-like cells. On the other hand, microcalcification of early plaques, which is poorly understood, is thought to be harmful. The two proteins necessary for physiological mineralization are tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and collagen. Under pathological conditions, TNAP is activated by inflammatory cytokines in VSMCs, whereas collagen is produced constantly. The activation of TNAP appears to induce calcification of these cells. Therefore, the objective of this PhD thesis was to study the role of TNAP and generated apatite crystals in the VSMC trans-differentiation and determine underlying molecular mechanisms. Based on the obtained results, we propose that activation of BMP-2, a strong inducer of ectopic calcification, and formation of apatite crystals generated by TNAP represents a likely mechanism responsible for stimulation of VSMC trans-differentiation. Moreover, we were interested in localization and function of mineralization markers such as TNAP and annexins in mineralization process mediated by trans-differentiated VSMCs and VSMC-derived matrix vesicles (MVs). We observed that, similarly as in the case of typical mineralizing cells, increased TNAP activity in VSMC-derived MVs and association with collagen were important for their ability to mineralize

La grossesse est une période de majoration du risque vasculaire, participant à une morbi-mortalité maternelle et fœtale pouvant justifier des mesures de prévention primaire et secondaire. Notre travail évalue l'impact de certains déterminants et l'apport de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la dysfonction vasculo-placentaire. Le but ultime étant d'optimiser les prises en charge et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons étudié les complications vasculaires placentaires associées à des marqueurs biologiques connus : mutation du facteur V Leiden, mutation du gène de la prothrombine et marqueurs conventionnels du syndrome des anticorps anti-phospholipides (SAPL). Nos résultats montrent que les femmes à antécédents de fausses couches précoces répétitives et porteuses, soit du polymorphisme du facteur V, soit du polymorphisme du facteur II, soit d'un SAPL (traité par héparine et aspirine faible dose), ont un risque élevé de fausse couche tardive lors d'une nouvelle grossesse. Les femmes à antécédent de fausse couche tardive et porteuses des mêmes particularités biologiques, traitées pendant leur grossesse selon les recommandations (héparine pour l'anomalie du facteur V ou II, héparine plus aspirine faible dose pour le SAPL), ont un risque diminué de récidive de perte fœtale tardive mais demeurent, dans le groupe SAPL, fréquemment exposées aux complications tardives de la grossesse malgré la prophylaxie antithrombotique. Nous avons évalué l'apport de nouveaux marqueurs de la dysfonction vasculaire placentaire. Nous montrons que le polymorphisme Ile89Leu du gène de la phosphatase alcaline placentaire (PLAP), enzyme exprimée par les cellules du syncytiotrophoblaste -polymorphisme associé à une augmentation de l'activité PLAP-, exerce un effet protecteur sur l'échec d'implantation et la survenue d'une fausse couche primaire. Un facteur angiogénique (brevet en cours) a également été étudié (génétique, dosage plasmatique, fécondation in vitro) et nous montrons une association de ce marqueur avec les échecs d'implantation et les fausses couches idiopathiques. L'ensemble de ces travaux suggère que ces nouveaux marqueurs moléculaires pourraient contribuer au diagnostic des complications vasculaires de la grossesse et fournir des biomarqueurs d'implantation embryonnaire et/ou de développement placentaire. Ils pourraient suggérer de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques, répondant aux limites des traitements disponibles. / Vascular risk increases during pregnancy, contributing to maternal and foetal morbidity and mortality, and potentially justifying primary and secondary preventive measures. Our work evaluates the impact of some determinants and the contribution of new molecular actors implicated in placental vascular dysfunction. The ultimate aim is to optimize management and to develop new therapeutic strategies. We studied the placental vascular complications associated with known biological markers: the factor V Leiden or prothrombin polymorphisms, and conventional markers of the antiphospholipid antibody syndrome (APS). Women with previous recurrent abortions carrying polymorphisms of either factor V or factor II, or with APS (treated with heparin and low-dose aspirin), had an increased risk of foetal loss during subsequent pregnancies. Women with a previous foetal loss carrying these biological markers, treated according to recommendations during a new pregnancy (heparin for the polymorphisms, heparin plus low-dose aspirin for APS) had a lower risk of foetal loss, but an excess of late complications was observed in the APS group despite prophylaxis. We evaluated the contribution of new markers of placental vascular dysfunction. The placental alkaline phosphatase enzyme (PLAP) is synthesized and expressed by syncytiotrophoblastic cells. We found that the Ile89Leu polymorphism of the PLAP gene provides protection against implantation failure and primary miscarriage and induces increased PLAP activity. We also studied (genetics, plasma determinations, in vitro fertilisation) an angiogenic factor (patent application underway), which we showed to be associated with idiopathic implantation failure and miscarriage. These findings suggest that these molecular actors are potentially useful for the diagnosis of placenta-mediated pregnancy complications and may be relevant biomarkers of embryo implantation and/or placental development. They may indicate new targets for relevant therapeutic strategies, potentially overcoming the limitations of the currently available treatments.

Les vésicules matricielles sont des organites extracellulaires impliques dans les processus de minéralisation. Nous avons détermine le mode d’action du strontium, ion contenu dans le principe actif d’un médicament antiostéoporotique sur les vésicules matricielles. Nous avons montre que le strontium agit en fonction de la concentration aussi bien sur la formation de l’hydroxyapatite que sur les activités phosphomonoéstérase et phosphodiestérase de la phosphatase alcaline tissu non spécifique. Pour des faibles concentrations (comprises entre 25 et 100^M), le strontium augmente l’activité phosphodiestérase et inhibe partiellement l’activité phosphomonoestérase. La balance entre la production de PPi, inhibiteur de la minéralisation et la production de Pi, essentiel a la formation d’hydroxyapatité pourrait être affectée par le strontium. / The matrix vesicles are extracellular organelles implicated in the process of mineralization.We determined the mode of action of strontium, ion contained in the active principle of an antiosteoporotic drug on the matrix vesicles. We showed that the action of strontium is concentration dependent on the hydroxyapatite formation and on phosphomonoesterase and phosphodiesterase activities of the tissue non specific alkaline phosphatase. At low concentration (between 25 and 100^M), strontium increased phosphodiesterase activity and inhibited partly phosphomonoesterase activity. The balance between the production of PPi, inhibitor of mineralization and the production of Pi, essential in the formation of hydroxyapatite could be affected by the strontium.

Chez les patients souffrant d'insuffisance rénale chronique, les calcifications vasculaires représentent la première cause de mortalité. Elles résultent de la trans-différenciation des cellules musculaires lisses (CMLs) en cellules de type ostéoblastique et/ou chondrocytaire, en réponse à des cytokines inflammatoires ou à une hyperphosphatémie. Les CMLs forment alors des cristaux par l'activité de la phosphatase alcaline non-spécifique du tissu (TNAP). A la lumière de résultats récents, nous avons émis l'hypothèse que la TNAP module la trans différenciation des CMLs. Nos objectifs étaient donc de déterminer l'effet de la TNAP dans la trans-différenciation des CMLs, et d'étudier les mécanismes impliqués dans son induction, avec un intérêt particulier pour les microRNAs. Nous avons observé que l'ajout de phosphatase alcaline purifiée ou la surexpression de TNAP stimule l'expression de marqueurs chondrocytaires en culture de CMLs et de cellules souches mésenchymateuses. De plus, l'inhibition de la TNAP bloque la maturation de chondrocytes primaires. Nous excluons un rôle des cristaux formés par la TNAP, puisque l'ajout de cristaux seuls ou associés à une matrice collagénique n'a pas reproduit les effets de la TNAP. Nous suspectons que la TNAP agit en hydrolysant le pyrophosphate inorganique (PPi). En effet, c'est la TNAP qui hydrolyse le PPi en culture de CMLs et de chondrocytes, et le PPi mime les effets de l'inhibition de TNAP en culture de chondrocytes. Enfin, nous rapportons le profil de microRNA des artères cultivées en conditions hyperphosphatémiques. Ces résultats pourraient être particulièrement importants dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques / In patients with chronic kidney disease (CKD), vascular calcification represents the main cause of mortality. Vascular calcification results from the trans-differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) into cells similar to osteoblasts and/or chondrocytes, in response to inflammatory cytokines or hyperphosphatemia. Calcifying VSMCs form calcium phosphate crystals through the activity of tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). In light of recent findings, we hypothesized that TNAP also modulates VSMC trans-differentiation. Our objectives were therefore to determine the effect of TNAP activity on VSMC trans-differentiation, and secondly to investigate the molecular mechanisms involved in TNAP expression in aortas, with a particular interest in microRNAs. We first observed that addition of purified alkaline phosphatase or TNAP over-expression stimulates the expression of chondrocyte markers in culture of the mouse and rat VSMC lines, and of mesenchymal stem cells. Moreover, TNAP inhibition blocks the maturation of mouse primary chondrocytes and reduces mineralization. We exclude a role for crystals in TNAP effects, since addition of crystals alone or associated to a collagenous matrix fails to mimic TNAP effects. We rather suspect that TNAP acts through the hydrolysis of inorganic pyrophosphate (PPi). Indeed, PPi is hydrolyzed by TNAP in VSMCs and chondrocytes and addition of PPi mimics the effects of TNAP inhibition on chondrocyte maturation. Finally, we report microRNA signature of aortic explants treated under hyperphosphatemic conditions that induce vascular calcification. These results could be of particular importance in patients with CKD