La calcification vasculaire est l’accumulation de cristaux de calcium dans les vaisseaux sanguins à travers un processus pathologique qui ressemble à la formation de l’os ou du cartilage. Elle apparaît notamment chez les patients diabétiques ou atteints d’une insuffisance rénale chronique. La conséquence principale de la calcification vasculaire est la perte de l’élasticité qui est indispensable pour la fonction des larges artères, elle est de plus associée à la mortalité des patients hémodialysés. Les traitements contre la calcification vasculaire sont généralement limités à ceux qui corrigent les facteurs causatifs des problèmes de santé mais aucune intervention efficace, spécifique et ciblée n’est disponible. Par conséquence, une compréhension profonde des mécanismes moléculaires impliqués dans la calcification vasculaire est nécessaire dans le but de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. La phospholipase D catalyse l’hydrolyse des phospholipides en acide phosphatidique et une tête polaire, elle est aussi impliquée dans différentes fonctions cellulaires et maladies. Il a été démontré qu’elle peut être activée par des facteurs impliqués dans l’ostéogenèse et par d’autres impliqués dans la calcification vasculaire. Ainsi, nous avons étudié le rôle de la phospholipase D dans la calcification vasculaire dans 3 modèles différents. Le premier est un modèle in-vitro de cellules musculaires lisses murines (lignée cellulaire MOVAS), elles sont cultivées en présence d’acide ascorbique et de β-glycérophosphate. Le deuxième est un modèle ex-vivo d’explants d’aortes cultivés en présence de fortes concentrations de phosphate et le troisième est un modèle in-vivo d’insuffisance rénale chronique produite chez des rats. Dans ce dernier modèle, la calcification vasculaire est induite par un régime riche en phosphore et en calcium et par des injections de vitamine D active. La calcification dans ces trois modèles a été suivie par l’analyse de la minéralisation en dosant les dépôts de calcium, de l’activité phosphatase alcaline, et de l’expression de différents marqueurs ostéo-chondrocytaires. Une augmentation de l’expression génique de Pld1 a été observée dans les trois modèles, en particulier au cours des premières étapes de la calcification, et a été accompagnée d'une activité accrue de la phospholipase D dans les modèles in vitro et ex-vivo. L’inhibition de l’activité phospholipase D dans ces deux modèles ou de la phospholipase D1 dans le modèle MOVAS a bloqué complètement la calcification. Par contre, l’inhibition spécifique de la phospholipase D2 n’a pas montré des effets significatifs. Deux voies par lesquelles la phospholipase D peut être activée ont été testées, la voie de la protéine kinase C et la voie de la sphingosine-1-phosphate. Ces deux voies métaboliques se sont révélées être impliquées dans le processus de calcification mais pas forcément dans l’activation de la phospholipase D au cours de ce processus. Des résultats préliminaires ont montré que la phospholipase D pourrait agir après activation de la sphingosine kinase 2 dont l’activité s’est avérée nécessaire pour la calcification dans le modèle MOVAS. Des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre par quels mécanismes la phospholipase D est activée et comment elle agit. La phospholipase D pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la calcification vasculaire vu que son inhibition ne semble pas avoir des effets secondaires chez les patients / Vascular calcification is the accumulation of calcium phosphate crystals in blood vessels via a pathological process that resembles physiological bone or cartilage formation. Calcification in the medial layer is mainly seen in diabetic and chronic kidney disease patients. Its main consequence is the loss of elasticity which is indispensable for the function of large arteries. Accordingly, vascular medial calcification was significantly associated with mortality in hemodialysis patients. Vascular calcification treatments are limited to those that correct its causative health problems, but no efficient, specific and targeted interventions are available. Therefore, a deep understanding of its molecular mechanisms is needed to find novel therapeutic targets. Phospholipase D catalyses the hydrolysis of phospholipids into phosphatidic acid and a head group. It is implicated in different cellular functions and diseases. It was found to be activated by factors involved in osteogenesis and others involved in vascular calcification. Thus, we investigated its role in vascular calcification in 3 models: an in-vitro model of murine smooth muscle cell line MOVAS cultured with ascorbic acid and β-glycerophosphate, an ex-vivo model of rat aortas cultured in high phosphate medium, and an in-vivo model of adenine-induced kidney disease in rats in which vascular calcification is induced by further administration of high phosphorus/calcium diet and active vitamin D injections. Calcification was detected in these models using different approaches including alkaline phosphatase activity, calcium dosage, and/or evaluation of osteo-chondrocytic markers expression. Pld1 expression was seen upregulated in all the three models, especially during early stages of calcification, and was accompanied with increased phospholipase D activity in the in-vitro and ex-vivo model. The inhibition of total phospholipase D activity in these two models, or that of phospholipase D1 in case of MOVAS model, abolished calcification. Phospholipase D2-specific inhibition did not induce significant effects. Two pathways by which phospholipase D can be activated were tested, protein kinase C and sphingosine 1-phosphate pathways, but they were found to be involved in calcification but not necessary for phospholipase D activation during this process. Alternatively, the preliminary results showed that PLD may be acting by activation of sphingosine kinase 2 whose activity was found necessary for calcification in the MOVAS model. Further investigations are needed to understand the mechanisms by which phospholipase D is activated and by which it is acting. Phospholipase D could be a novel target for vascular calcification especially that its inhibition in patients did not induce adverse health effects

Différentes stratégies associant des cellules médullaires et/ou des biomatériaux ont été étudiées pour la réparation du tissu osseux dans des modèles murins. Nous avons montré que H2O2 et NaOH, produits utilisés dans les procédés de purification industriels de greffons osseux allogéniques, induisent une détérioration matricielle de surface, diminuant l'adhésion, la prolifération et l'activité de cellules ostéoblastiques. NaHCO3 est apparu comme un agent nettoyant efficace, sans conséquences sur la qualité des greffons et leur cytocompatibilité. Des matrices osseuses ainsi purifiées ont été utilisées comme support pour la réparation par ingénierie tissulaire d'un défaut crânien de taille critique chez la souris. La construction cellules médullaires/matrice, élaborée in vitro, a induit in vivo une régénération osseuse rapide jusqu'au centre du déficit. L'induction de la différenciation ostéoblastique des cellules avant leur implantation n'a pas amélioré nos résultats. Une autre thérapie cellulaire ayant été étudiée est la transplantation systémique de cellules médullaires. L'irradiation corporelle totale et la transplantation ont induit une perte osseuse trabéculaire dramatique. Les cellules transplantées n'ont pas permis la restauration de la masse osseuse mais ont reconstitué un microenvironnement ayant modifié la microarchitecture des receveurs vers un phénotype donneur. Pour ces deux dernières études les cellules médullaires sont issues de souris transgéniques pour la GFP, permettant le suivi des cellules après implantation. L'immunodéplétion des cellules médullaires possédant le CD11b a permis d'enrichir fortement la population cellulaire en ostéoprogéniteurs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Caractérisée surtout par une dégradation du cartilage, l'arthrose est une maladie articulaire qui montre également une sclérose de l'os sous-chondral et une formation d'ostéophytes. Au stade clinique, cette pathologie progressive atteint environ 60% des personnes âgées de 65 ans et plus. La dégradation du cartilage qui accompagne cette maladie est la manifestation clinique la plus importante et la plus étudiée au niveau moléculaire. Par contre, la sclérose de l'os sous-chondral était toujours considérée comme secondaire ou comme un phénomène de compensation suite à l'érosion du cartilage. Cependant, la recherche fondamentale intensive sur le cartilage n'a toujours pas réussi à identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de la dégradation du cartilage. Ainsi, le traitement qui existe présentement se limite à calmer la douleur des patients. Par ailleurs, les études visant à comprendre le rôle de l'os sous-chondral, qui fait partie des tissus touchés par cette maladie, ont été toujours marginales. Notre hypothèse générale est qu'un défaut dans le métabolisme de l'os sous-chondral pourrait contribuer au déclenchement et/ou à la progression de l'arthrose. Ce défaut expliquerait la sclérose osseuse de l'os sous-chondral observée chez ces patients, situation qui serait alors responsable de la détérioration du cartilage via soit; i) un (des) messager(s) chimique(s), ii) l'imposition d'une contrainte mécanique sur le cartilage, ou iii) les deux précédents. De manière à démontrer notre hypothèse générale, nous avons utilisé des extraits d'expiants ex vivo et nous avons mis au point une technique pour cultiver les ostéoblastes provenant du plateau tibial medial de patients arthrosiques ou d'individus normaux. Au tout début de nos travaux nous avons démontré que, grâce à la mesure de marqueurs spécifiques, les ostéoblastes provenants de patients arthrosiques auraient un phénotype altéré lorsque comparé aux normaux. Ainsi, au niveau des expiants d'os sous-chondral, nos données montrent que l'activité de la phosphatase alcaline était augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques avant et après une stimulation avec la 1,25 (OH)2 D3 (métabolite actif de la vitamine Ds). La même observation a été notée pour l'ostéocalcine suite à une stimulation à la 1,25 (OH)2 D3 chez les ostéoblastes arthrosiques. Par ailleurs, les ostéoblastes arthrosiques ont montré une résistance à la stimulation par la PTH et la prostaglandine E2 (PGE2), leur taux de synthèse de l'AMPc (Adénosine 3', 5' monophosphate cyclique) étant 50% et 100% inhibé versus les ostéoblastes normaux. Une altération dans la voie de signalisation de la PTH pourrait être la cause de cette inhibition de synthèse d'AMPc chez les ostéoblastes arthrosiques. Toutefois, une stimulation directe de l'adénylate cyclase avec de la foskoline, produit qui court-circuite le récepteur à la PTH et la protéine Gs, a ramené le niveau de l'AMPc à la normale, démontrant que l'activité de l'adénylate cyclase est intacte dans les ostéoblastes arthrosiques. Un traitement à la toxine de choléra qui ribosyle la protéine Gs n'a toutefois pas réussi à augmenter le niveau de l'AMPc après stimulation avec la PTH, ce qui signifie que l'activité de la protéine Gs est partiellement et/ou totalement inhibée. Au contraire, la stimulation de la protéine Gi (la protéine G inhibitrice) par la toxine de Pertussis a complètement inhibé la formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH indiquant que la protéine Gi est intacte. Par la suite, la protéine Gs fût l'objet d'une quantification par western blot qui n'a révélé aucun changement au niveau de la quantité de cette protéine versus les ostéoblastes normaux. La quantification du récepteur de la PTH à l'aide d'une étude de liaison avec du I-PTH a montré une diminution de 50% du niveau de récepteurs à la PTH. Cette diminution pourrait être causée par une désensibilisation hétérologue par la PGE2. En effet, les ostéoblastes arthrosiques synthétisent plus de PGE2 que les ostéoblastes normaux et l'inhibition de la synthèse de la prostaglandine par le Naproxen a ramené à la normale le niveau de formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH. Par ailleurs, le niveau d'ARNm du récepteur à la PTH évalué par RT-PCR semi-quantitatif était diminué. Le ratio avec le glycéraldehyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) dans les ostéoblastes arthrosiques était de 25 à 65 % plus faible que pour les ostéoblastes normaux, le niveau d'inhibition variant en parallèle avec la sévérité de la maladie. Ceci indique que l'expression du récepteur à la PTH était diminuée dans les cellules arthrosiques. Nos résultats ont également montré que l'activité du système PA/Plasmine, le premier système à initier la résorption osseuse, est inhibé dans l'os sous-chondral arthrosique ce qui pourrait entraîner une diminution de la résorption osseuse. Le niveau protéique et l'activité de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) et du facteur de croissance de type insulinique-1 (IGF-1) sont tous les deux augmentés dans les expiants arthrosiques comparativement aux expiants normaux, tandis que le niveau de la protéine inhibitrice du plasminogène (PAI-1) pour sa part était inchangée. Afin de vérifier si les modifications observées avec les expiants arthrosiques étaient vraiment dues à un défaut dans les ostéoblastes arthrosiques eux-mêmes, nous avons repris ces expériences avec ces cellules. Les niveaux d'uPA (activité et protéine) et d'IGF-1, dans les surnageants des ostéoblastes arthrosiques ont montré une augmentation significative comparativement aux ostéoblastes normaux. Par contre, le niveau de l'inhibiteur du PA (PAI-1) était similaire entre arthrose et normal. Puisque les systèmes d'uPA/plasmine et d'IGF1/IGFBP sont tous deux impliqués dans la résorption et/ou la formation osseuse, et que des travaux récents démontraient une interrelation possible de ces deux systèmes, nous avons étudié cette question chez les ostéoblastes arthrosiques. L'ajout d'IGF-1 diminua significativement P<0.05) le niveau d'uPA seulement dans les ostéoblastes arthrosiques. Au contraire, l'uPA n'a pas modifié le niveau de l'IGF-1 dans les ostéoblastes normaux ni dans les ostéoblastes arthrosiques. Suite à une stimulation avec l'IGF-1, l'activité basale de l'uPA fut augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques, tandis qu'aucun changement n'était observé dans les ostéoblastes normaux. L'ajout de plasminogène a fortement augmenté l'activité de l'uPA via un phénomène de rétro-action positive causée par la génération de la plasmine qui peut à son tour activer l'uPA latent en uPA actif. Le mécanisme de rétroaction positive fut inhibé par le PAI-1 et l'a2-antiplasmine. Le traitement des ostéoblastes arthrosiques avec l'IGF-1 a inhibé le phénomène de rétroaction positive et ceci d'une façon dose-dépendante, ce facteur de croissance n'ayant aucun effet chez les ostéoblastes normaux. Cette inhibition ne peut être due à une modification du niveau de PAI-1 parce que le niveau de cette protéine n'a révélé aucun changement après le traitement avec l'IGF-1. L'ajout d'IGF-1 a aussi diminué l'activité de la plasmine, dosée par l'hydrolyse d'un substrat spécifique, dans les ostéoblastes arthrosiques mais pas dans les ostéoblastes normaux. En résumé nos travaux ont montré que les ostéoblastes arthrosiques avaient un métabolisme altéré. En plus de montrer des changements à la réponse de marqueurs spécifiques, ces cellules pathologiques présentaient une diminution au niveau des récepteurs à la PTH et une réponse anormale au système uPA/plasmine à leur traitement avec l'IGF-1. Cette observation est appuyée par la diminution du nombre de récepteurs à la PTH dans les ostéoblastes, une situation qui est aussi en accord avec une diminution possible de la résorption osseuse. Si ces observations in vitro se transposent in vivo, ceci signifie que la sclérose de l'os sous-chondral pourrait être due en partie à la diminution de la résorption osseuse. Par ailleurs, l'augmentation du niveau d'IGF-1 et son rôle dans le contrôle négatif de la rétroaction positive du système uPA/Plasmine pourrait aussi contribuer à augmenter la formation osseuse et réduire la résorption osseuse respectivement. La sclérose de l'os sous-chondral pourrait alors jouer un rôle clef dans le déclenchement et la progression de l'arthrose.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes âgées. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie à cause des coûts économiques qu’elle engendre mais surtout à cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractérise par une dégradation du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la présence d’ostéophytes. L’étiologie de cette pathologie est restée nébuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rôle clé de l’os sous-chondral dans l’OA est maintenant reconnu. L’obésité étant un facteur de risque de l’OA, nous avons émis l’hypothèse que la leptine, une adipocytokine clé dans l’obésité, joue un rôle important dans l’OA. En effet, la leptine modifie le phénotype des ostéoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phénotype altéré, notre objectif était de déterminer le rôle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires d’Ob issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et d’individus normaux (N). L’expression de la leptine et de son récepteur actif (OB-Rb) ont été mesurées par RT-PCR en temps réel, et leur production a été mesurée par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifération des Ob OA a été déterminée par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a été déterminée par IB. Le phénotype des Ob fut déterminé par la mesure de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et la sécrétion d’ostéocalcine (OC), en présence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs d’interférences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phénotype des Ob OA furent déterminés via leur impact sur l’activité de l’ALP et sur la sécrétion d’OC. L’effet dose-réponse de la leptine sur les expressions d’OB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent déterminées par RT-PCR en temps réel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a été étudiée en évaluant l’effet dose réponse de celle-ci sur la production des protéines JAK2 et STAT3 phosphorylées par IB. Les résultats obtenus ont montrés que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phénotypique, ces Ob OA possèdent une activité de l’ALP ainsi qu’une sécrétion d’OC plus importante que celles observées chez les Ob N. L’ajout d’anticorps inactivant l’interaction leptine et OB-Rb ou d’inhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminuèrent l’activité de l’ALP ainsi que la sécrétion d’OC dans les Ob OA. Par contre, l’ajout de leptine exogène aux Ob OA augmenta l’activité de l’ALP sans pour autant faire varier la sécrétion d’OC. La leptine à des doses de 1ng/ml à 10mg/ml stimula la prolifération des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogène diminua l’expression de TFG-1 tandis qu’elle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manière dose-dépendante. Cependant, l’expression d’OB-Rb diminua de manière dose-dépendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua l’activité d’ALP, la sécrétion d’OC, l’expression de la leptine, l’expression d’OB-RB ainsi que l’expression du facteur TGF-1. L’ensemble de ces données démontre que la leptine endogène des Ob OA est sous contrôle des facteurs de croissance et qu’elle contribue à maintenir le phénotype anormal de l’os sous-chondral OA. De plus, ceci suggère que la leptine serait un acteur important dans la régulation du remodelage osseux. / Osteoarthritis (OA) is a disease which mainly affects the joints in the elderly. It becomes essential to better understand this disease because of the economic costs it brings, but mainly because of population aging. This disease is characterized by a deterioration of cartilage, bone sclerosis, inflammation of the synovial membrane and the presence of osteophytes. The knowledge of its etiology has remained incomplete because research on this disease focused mainly on the articular cartilage. However, the key role of subchondral bone in OA is now recognized. Obesity is a risk factor for OA, then we hypothesized that leptin, a key adipocytokine in obesity plays an important role in OA. Indeed, leptin alters the phenotype of osteoblasts (Ob) and human Ob has altered phenotype in OA patients, our objective was to determine the potential role of leptin in OA Ob. To do this, we prepared primary cultures of Ob from the sub-chondral plate of the tibial plateaus of OA patients and normal individuals (N). The expression of leptin and its receptor active (OB-Rb) were measured by RT-PCR in real time, and their production was measured by ELISA and western blot (WB). The proliferation of Ob OA was determined by BrdU incorporation. The phosphorylation of p42/44 MAPK was evaluated by WB. The phenotype of Ob was determined by measuring the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the secretion of osteocalcin (OC), in the presence or absence of leptin. Moreover, the effects of small interference RNAs (siRNAs) anti-leptin and anti OB-Rb on the phenotype of OA Ob were determined through their impact on the activity of the ALP and the secretion of OC. The dose-response effect of 1eptin on its own expression or the expressions of OB-Rb, the growth factor TGF-β1 were determined by RT-PCR in real time. Finally, signalisation of leptin in OA Ob was studied by evaluating the dose-response effect of this on the production of JAK2 and STAT3 protein phosphorylated by WB. The results showed that the OA Ob express and produce more leptin than N. Moreover, these Ob OA have an activity of the ALP and a secretion OC higher than those observed in N Ob. The addition of antibodies inactivating interaction leptin and OB-Rb or chemical inhibitors such as tyrphostin or piceatannol diminished the activity of the ALP and the secretion of OC in OA Ob against by the addition of exogenous leptin to Ob OA increased the activity of the ALP without influencing the secretion of OC. Leptin at doses of 1ng/ml to 10mg/mL stimulated the proliferation of OA Ob and the phosphorylation of p42/44 MAPK. Exogenous leptin decreased the expression of TGF-β1 while it stimulated the phosphorylation of JAK2 and STAT3 and expression of its own in dose-dependent manner. However, the expression of OB-Rb decreased in dose-dependent. Finally, the treatment of OA Ob with Si leptin or Si OB-Rb decreased activity of ALP, the secretion of OC, the leptin expression, expression of OB-Rb and the expression of TGF-β1 factor. All these data show that endogenous leptin Ob OA controls the growth factors and contributes to maintaining the abnormal phenotype of the subchondral bone OA. Moreover, this suggests that leptin is an important player in the regulation of bone remodelling

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Une approche in situ et expérimentale sont menées en baie de Marseille. Des mesures simultanées de PB, de RB, de la phosphatase alcaline (phos) et de la protéase (prot) sont réalisées. Des gradients de températures (12-32°C) de ces 4 activités sont effectués. Les résultats montrent que 1) les températures optimales et les Q10 varient saisonnièrement, 2) le BGE ne diminue pas nécessairement lorsque la température augmente et 3) quelles que soit les conditions in situ, l'assemblage bactérien possède un BGE à la température in situ proche de sa température optimale. Des expériences d'enrichissements en PO4 et glucose incubées à température in situ et température in situ + 3°C montrent que la nature de l'interaction entre la température et les ressources est principalement synergétique. L'hypothèse d'un scénario supposant des changements relatifs de PB, prot et phos lors d'un changement de température suggère que les taux prot/PB et phos/PB diminuent lors d'un réchauffement et augmentent lors d'un refroidissement. Enfin, ces expériences témoignent que la température et la disponibilité du PO4 sont les principaux facteurs limitant les activités hétérotrophes. L'étude du mode d'apport de la MO (pulsé ou en continu) menée sur 4 cultures saisonnières montre que selon les conditions environnementales et le mode d'apport de la MO, l'AB, la PB et la RB varient significativement. Toutefois, l'AB, la PB, la RB et le BGE ne montrent pas de différences significatives entre les réservoirs d'ajouts pulsés et d'ajouts continus de MO suggérant des communautés bactériennes peu sensibles à la nature de la perturbation nutritionnelle alors que leurs activités en sont fortement dépendantes. / In this work, in situ and experimental approaches have been carried out in Marseilles' Bay. Simultaneous measurements of bacterial production (BP), bacterial respiration (BR), alkaline phosphatase activity (phos) and protease activity (prot) have been performed. Kinetic temperatures (12-32°C) of these 4 activities have been also conducted. The results demonstrate that i) the optimum temperature and Q10 values vary seasonally, ii) BGE value does not necessarily decrease with increasing temperature and iii) whatever the in situ conditions, the bacterial assemblage has a in situ temperature BGE value close to its optimal temperature. Enrichments experiments in PO4 and glucose incubated at in situ temperature and in situ temperature + 3°C allow to observe that the synergistic nature of the interaction between temperature and resources. The assumption of a scenario assuming that BP, prot and phos changes during a temperature change suggests that prot:BP and phos:BP ratios decrease with a warming and increase with a cooling. Finally, these experiments show that temperature and PO4 availability are the main factors controlling heterotrophic activities. The study on OM availability and associated timing (pulsed or continuous) conducted during 4 seasonal cultures demonstrates that at different seasons and according to the delivery mode of OM, BA, BP and BR are varying significantly. However, the BA, BP and the BR does not show significant differences between the tanks with pulse OM addition and continuous OM addition suggesting that predominant bacterial communities are insensitive to the nature of nutritional disturbance whereas bacterial activities are highly dependent.

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Caractériser la fonction des protéines est crucial pour notre compréhension des mécanismes moléculaires de la vie, des maladies, et aussi pour inspirer de nouvelles applications en bionanotechnologie. Pour y arriver, il est nécessaire de caractériser la structure et la dynamique de chaque état occupé par la protéine durant sa fonction. La caractérisation expérimentale des états transitoires des protéines représente encore un défi majeur parce que les techniques à haute résolution structurelle, telles que la spectroscopie RMN et la cristallographie aux rayons X, peuvent difficilement être appliquées à l’étude des états de courte durée. De plus, les techniques à haute résolution temporelle, telles que la spectroscopie de fluorescence, nécessitent généralement une chimie complexe pour introduire des fluorophores à des endroits spécifiques dans la protéine. Dans cette thèse nous introduisons l’utilisation des nanoantennes fluorescentes en tant que nouvelle stratégie pour détecter et signaler les changements de conformation des protéines via des interactions non covalentes entre des fluorophores spécifiques et la surface de la protéine. En utilisant des expériences et des simulations moléculaires, nous démontrons que des fluorophores chimiquement divers peuvent se lier et être utilisés pour sonder différentes régions d’une enzyme modèle, la phosphatase alcaline (PA). Ces nanoantennes peuvent être fixées directement aux protéines ou utilisées à l'aide du système de fixation simple et modulaire, le complexe biotine-streptavidine (SA), qui permet un criblage rapide et efficace de la nanoantenne optimale tant dans sa composition que sa longueur. Dans le cas de la PA, nous montrons que nos nanoantennes permettent la détection et la caractérisation des conformations distinctes incluant les changements conformationnels nanoscopiques produisant durant la catalyse du substrat. Nous démontrons également que les signaux fluorescents émis par la nanoantenne peuvent également permettre de caractériser la cinétique enzymatique d’une protéine en une seule expérience tout en incluant la détermination des paramètres « Michaelis-Menten » de ses substrats et inhibiteurs. Nous avons également exploré l'universalité de la stratégie ces nanoantennes fluorescentes en utilisant une autre protéine modèle, la Protéine G et son interaction avec les anticorps, et avons démontré son utilité pour mettre au point un essai permettant de détecter les anticorps. Ces nanoantennes simples et faciles à utiliser peuvent être appliquées pour détecter et analyser les changements conformationnels de toutes tailles et nos résultats suggèrent qu'elles pourraient être utilisées pour caractériser n’importe quel type de fonction. / The characterisation of protein function is crucial to understanding the molecular mechanisms of life and disease, and inspires new applications in bionanotechnology. To do so, it is necessary to characterise the structure and dynamics of each state that proteins adopt during their function. Experimental study of protein transient states, however, remains a major challenge because high-structural-resolution techniques, including NMR spectroscopy and X-ray crystallography, can often not be directly applied to study short-lived protein states. On the other hand, high-temporal-resolution techniques, such as fluorescence spectroscopy, typically require complicated site-specific labelling chemistry. This thesis introduces the use of fluorescent nanoantennas as a new strategy for sensing and reporting on protein conformational changes through noncovalent dye-protein interactions driven by a high local concentration. Using experiments and molecular simulations, we first demonstrate that chemically diverse dyes can bind and be used to probe different regions of a model enzyme, intestinal alkaline phosphatase (AP). These nanoantennas can be attached directly to proteins or employed using the simple and modular biotin-streptavidin (SA) attachment system, which enables rapid and efficient screening for high sensitivity by tuning their length and composition. We show that these nanoantennas enable the detection and characterisation of distinct conformational changes of AP, including nanoscale conformational changes that occur during substrate catalysis. We also show that the fluorescent signal emitted by the nanoantenna enables complete characterisation of enzyme kinetics in one experiment, including determination of Michaelis-Menten parameters of substrates and inhibitors of AP. We then explored the universality of the nanoantenna strategy by using a different model protein system. Protein G was shown to interact with antibodies, using a rapid screening strategy for antibody detection. These effective and easy-to-use nanoantennas could potentially be employed to monitor various conformational changes, and our results offer potential for characterising various protein functions.