Les Xanthomonas campestris induisent des maladies sur les plantes de la famille des Brassicacées. l'une de ces maladies la nervation noire est considérée comme l'une des plus dommageables des brassicacées. Cette espèce comprend six pathovars, définis en fonction du type de symptômes provoqués et de la plante hôte d'isolement. Cependant, des doutes ont été emis sur la synonymie de certain de ces pathovars, or il est indispensable de pouvoir identifier sans ambig¨uité ces pathovars afin de mettre en place des stratégies de luttes contre ces bactérioses. Bien que les sources de contamination soient multiples, la semence reste la cause principale de l'infection des plantes. S'assurer de leur qualité sanitaire est le moyen de lutte le plus efficace contre les bactérioses. L'objectif de ce travail était de clarifier la pathogénie et la structure génétique de cette espèce, puis de proposer un nouvel outil de détection fiable et rapide des X. campestris vivantes dans les semences. L'étude de la pathologie de l'espèce X. campestris indique qu'il existe trois pathovars capables de provoquer une maladie, X. c. pv. campestris provoque la nervation noire, X. c. pv. raphani induit la maladie des taches foliaires, X. c. pv. incanae engendre la maladie du dépérissement des giroflées. Nous discutons la taxonomie des espèces du genre Xanthomonas par une approche MLSA. Notre analyse génétique MLSA/MLST révèle que l'espèce X. campestris est particulierement complexe et polymorphe. Cette diversité aurait deux origines d'importance similaire, la recombinaison et les mutations. L'espèce semblerait néanmoins conserver une structure clonale en raison d'une étroite communauté d'hôte. Les pathovars ne forment pas des lignées génétiques identifiées, toutefois ils ne sont pas mélangés entre eux et partagent des séquences proches. Nous avons mis au point une méthode de détection de X. campestris vivant dans les semences par BIO-PCR. Elle permet de détecter jusqu'à 10 ufc/ml de macérat de semence.

Les tests de diagnostic ont pour but de détecter et de quantifier un ou plusieurs analytes en milieu complexe. Depuis les années 80, leur évolution s'est concentrée sur la détection de très faibles quantités d'analytes. Actuellement, cette ligne directrice subsiste mais en parallèle les développements se portent sur de nouveaux objectifs comme la mise au point de tests simples, rapides, transportables et sensibles afin de répondre au mieux aux attentes des nouveaux marchés : le point of care et les pays émergents. Au cours de ce travail, nous nous sommes confrontés à ces nouvelles problématiques. Nous avons choisi d'améliorer la sensibilité du test d'agglutination magnétique précédemment développé au laboratoire en raison de sa simplicité (test homogène) et de sa rapidité (manipulation de billes magnétiques). Nous avons montré que deux paramètres conditionnaient le seuil de détection de ce test à savoir le bruit (variabilité du signal sans antigène) et le signal émis par les billes. Le premier facteur dépend principalement du nombre de billes et le deuxième nous a amené à travailler avec de grandes billes nécessitant une nouvelle méthode de détection, la cytométrie en flux. Le gain en sensibilité n'a pas été clairement démontré en raison de la très faible réactivité des billes utilisées (500 fois moins réactives que les billes "habituelles"). Une chose est sûre, de grandes billes améliorent le signal, la cinétique et la thermodynamique au détriment d'une plus faible mobilité des objets sous champ. Sous couvert d'une bonne réactivité, nous nous sommes aperçus que la première étape de notre test d'agglutination devenait thermodynamiquement et cinétiquement limitante aux faibles concentrations en analyte. Dans le cadre du projet européen DetectHIV, nous avons essayé d'une part de franchir ces barrières à travers un système microfluidique et d'autre part de mettre au point un test complètement intégré. De nouvelles technologies ont vu le jour à l'EPFL (plug magnétique) et à DTU (cytométrie sur puce). Le système développé par l'EPFL est thermodynamiquement favorable, valide l'idée de préconcentration mais nécessiterait un nouveau dimensionnement fluidique pour réellement supplanter les tests en volume. L'intégration, quant à elle, a permis d'acquérir un certain savoir faire dans le domaine de la microfluidique, d'identifier les verrous technologiques et de développer un nouveau mode de circulation des fluides. Pour conclure, ce travail a permis de cerner l'évolution possible des tests d'agglutination magnétique. La sensibilité du test originel c'est-à-dire en volume couplé à une détection turbidimétrique est fixée par le bruit de l'appareil de mesure. Ce paramètre étant peu optimisable, seule une augmentation de la taille des billes permettrait d'augmenter significativement la sensibilité du test (un facteur 10 en théorie). Au delà, une détection individuelle des objets via la cytométrie est nécessaire. D'une part, elle permet de travailler avec de gros objets afin d'amplifier grandement le signal et d'autre part, elle permet de s'affranchir du bruit de l'appareil de mesure. Le bruit mesuré est uniquement dû à la comptabilisation des populations, bruit inhérent au test de diagnostic. Avec cette configuration, un gain de sensibilité passe par une diminution du non-spécifique (relatif au comptage des populations) et par une augmentation de la réactivité des "grosses" billes. En dessous de la dizaine de femtomoles, la formation de complexe n'est plus assurée et devient longue, un changement de format fluidique est alors nécessaire. Le nouveau format fluidique testé, la microfluidique, s'avère très prometteur à condition d'intégrer une méthode de détection (cytométrique ou autre) et d'augmenter les débits.

L'intégrité de l'endothélium vasculaire est dépendante de l'organisation des jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales. La VE (Vascular Endothelial)-cadhérine un constituant essentiel de ces jonctions et sa phosphorylation sur tyrosine pourrait être un moyen de régulation de la perméabilité endothéliale. Ce travail de thèse a permis de valider l'existence in vivo de la phosphorylation sur tyrosine de la VE-cadhérine. Nous montrons en effet la très forte induction de cette phosphorylation au cours de l'angiogenèse physiologique dans l'ovaire et l'utérus, par rapport aux tissus quiescents. Pour la première fois, nous rapportons l'association constante de la tyrosine kinase Src à la VE-cadhérine, à la fois in vivo et in vitro. De plus, en accord avec les données de la littérature in vitro, nous confirmons in vivo l'association transitoire du VEGFR2 à la VE-cadhérine dans un contexte angiogénique. Par différentes approches, nous apportons la preuve que la VE-cadhérine est un substrat direct de Src, et que la tyrosine 685 du domaine cytoplasmique est la cible unique de la kinase en réponse au VEGF. Grâce à un test de blessure d'HUVECs, nous montrons l'importance de la phosphorylation par Src de la tyrosine 685 dans la migration des cellules endothéliales induite par le VEGF. Enfin, l'étude de carcinomes mammaires nous as permis de démontrer l'existence d'une forme phosphorylée sur tyrosine de la VE-cadhérine également dans l'angiogenèse tumorale, et son association avec une activité kinase de type Src et PI3K. L'ensemble de ce travail permet de conclure à la phosphorylation par Src de la VEcadhérine sur la Y685 en réponse au VEGF, et suggère que cette phosphorylation représente in vivo la signature d'un endothélium activé.

Au cours de la spermiogenèse, une réorganisation très importante de la chromatine se produit : la quasi-totalité des histones sont progressivement enlevées et remplacées par des protéines de transition puis par des protamines. Mon travail de thèse a alors consister à caractériser l'organisation finale de cette chromatine dans les spermatozoïdes ainsi que les mécanismes mis en jeu. Nos résultats montrent pour la première fois l'existence, dans les spermatides condensées de souris, de structures nucléoprotéiques contenant l'histone testiculaire TH2B ainsi que de nouveaux variants d'histones identifiés au laboratoire. De plus, ces structures organisent de manière préférentielle l'hétérochromatine péricentromérique de ces cellules. Cette réorganisation impliquerait la protéine chaperonne NAP1L4, qui pourrait être ciblée sur la chromatine en interagissant avec les queues N-terminales des histones H3. D'autres régions particulières du génome pourraient être la cible de la réorganisation différentielle de la chromatine par ces structures, permettant de les différencier du reste du génome et constituant ainsi le support d'une information épigénétique mâle transmise lors de la fécondation. L'analyse des protéines présentes dans les cellules germinales nous a également permis d'identifier deux autres protéines, HMGB4 et FYTTD1, qui ne semblent pas impliqués dans le processus de réorganisation de la chromatine dans les stades tardifs de la spermiogénèse. Néanmoins, le rôle potentiel de FYTTD1 dans le phénomène de maturation des ARN, ces derniers pouvant être un autre support de l'information épigénétique, pourrait s'avérer être un nouveau champ d'investigations très intéressant.

Le cancer de la prostate est la seconde cause de mortalité par cancer chez l'homme. Actuellement, les traitements hormonaux visent à diminuer le taux d'androgènes actifs. Malheureusement, avec le temps, les patients développent un cancer androgènes dont l'issue est fatale. Le calcium (Ca2+), second messager ubiquitaire, est impliqué dans de nombreux processus tels que l'apoptose ou la prolifération. Le Réticulum Endoplasmique (RE) est un acteur essentiel de la signalisation calcique. Ainsi, l'étude de canaux calciques réticulaires est fondamentale dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les travaux effectués ont permis d'identifier deux nouvelles protéines sur le RE : le translocon et le canal TRPM8 (Transient Receptor Potential Melastatin 8). Ces deux protéines seraient des éléments majeurs de la signalisation calcique en régulant la concentration de Ca2+ du RE. Par ailleurs, l'étude de l'évolution de la signature calcique au cours de la cancérogenèse prostatique a permis de mettre en évidence qu'Orai1 (identifié ici comme étant la protéine responsable de l'Entrée Capacitive de Ca2+) est moins exprimée dans les cancers les plus agressifs. A l'opposé, TRPV6 (Transient receptor potential Vanilloid 6), canal calcique impliqué dans l'entrée constitutive de Ca2+, est surexprimé dans des stades avancés de cancer. Ainsi, les variations d'expression de ces protéines seraient responsables respectivement d'un défaut d'apoptose ou d'une augmentation de la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques androgéno-indépendantes. Ceci permettrait d'expliquer l'évolution du cancer de la prostate vers des stades plus agressifs.

Le dépistage des patients porteurs de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) à l'admission à l'hôpital est motivé par la nécessité d'identification précoce d'un réservoir asymptomatique afin de mettre rapidement en place des mesures de prévention de la transmission. Cependant, il représente un coût important et ses modalités sont toujours discutées, en particulier en dehors des services de réanimation. C'est pourquoi nous avons étudié dans ce travail différents aspects des programmes de dépistage. Parallèlement à des facteurs de risque classiques, nous avons identifié les soins à domicile comme un facteur de risque indépendant de portage à l'admission, ainsi que la possibilité de transmission intra-familiale de souches hospitalières, soulignant la nécessité de redéfinir les caractéristiques des patients à risque. Nous avons montré l'intérêt du dépistage à l'admission dans deux services de soins non intensifs (médecine interne et accueil-urgences), et nous avons défini un choix de sites anatomiques à prélever. Les conséquences du type de politique de dépistage choisi sur la valeur de certains indicateurs de surveillance ont également été étudiées. Enfin, nous avons présenté en parallèle l'évolution épidémiologique des SARM dans deux établissements pratiquant des politiques opposées en matière de dépistage. Le dépistage paraît incontournable dans les programmes de lutte contre le SARM. Il doit cependant être accompagné de mesures barrières efficientes, dont certaines restent discutées ou insuffisamment validées.

Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies.

La mitochondrie joue un rôle majeur dans la mort cellulaire par nécrose et apoptose. Un des phénomènes hautement régulés conduisant à cette mort cellulaire est la transition de perméabilité mitochondriale qui est médiée par l'ouverture du pore de transition de perméabilité (PTP) localisé dans la membrane interne. Dans les mitochondries de foie de rat, il a été constaté que les analogues de l'ubiquinone ont trois types d'action sur l'ouverture du PTP : l'induction, l'inhibition ou l'interaction sans effet régulateur. Bien que l'inhibition du PTP soit habituellement protectrice de la mort cellulaire, il a été rapporté que des quinones inhibitrices provoquent une toxicité sur certaines lignées cellulaires.<br />Dans notre étude, nous nous sommes attachés à comprendre d'où peuvent provenir ces divergences, en travaillant sur des lignées hépatocytaires immortalisées et cancéreuses. Nous avons observé que la régulation du PTP par les analogues de l'ubiquinone peut être bouleversée par l'immortalisation et/ou la cancérisation, alors que l'effet de la ciclosporine A demeure inchangé. Tant en culture qu'en co-culture, cette caractéristique unique permet une toxicité ciblée, même entre deux lignées cellulaires très proches. Dans certaines lignées, certaines ubiquinones inhibitrices entraînent malgré tout une mort cellulaire. Nous avons pu montrer que cette toxicité est due à l'augmentation de la production radicalaire. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives dans l'utilisation du PTP comme cible moléculaire de thérapie anticancéreuse sélective.

Cette thèse tente d'aborder, avec quelques détours, deux questions centrales concernant le<br />centrosome des vertébrés : son rôle dans la motilité cellulaire et son rôle dans le cycle de<br />division cellulaire.<br />Après une introduction en trois parties (un tour d'horizon dans une optique historique, un<br />exposé détaillé des connaissances actuelles, puis une réflexion plus générale sur des bases<br />phylogénétiques), deux travaux sont présentés : une étude des rôles respectifs des deux<br />centrioles du centrosome des cellules de vertébrés, puis une étude du comportement<br />particulier du centrosome dans ces cellules en sortie de mitose.<br />L'ensemble de ce travail se fonde sur un outil précieux : l'établissement de lignées cellulaires<br />qui expriment de manière stable la centrine 1 humaine couplée à la GFP, ce qui constitue un<br />excellent marqueur des centrioles et de leur stade de maturation. En effet, le centrosome des<br />vertébrés contient deux structures microtubulaires appelée centrioles qui se reproduisent en<br />synchronie avec le cycle de division cellulaire par un mécanisme de duplication, un nouveau<br />centriole étant assemblé à proximité de chaque centriole présent. Il y a donc dans chaque<br />cellule, après une mitose, un nouveau et un ancien centriole aussi appelés centriole parental<br />ou centriole père et centriole fils.<br />La première étude, après avoir succinctement défini le comportement des centrioles dans les<br />différentes phases du cycle, se concentre plus précisément sur la phase G1 pendant laquelle il<br />a pu être observé que les deux centrioles peuvent transitoirement se séparer de plus de dix<br />microns. L'un des deux centrioles, qui a pu être identifié comme le centriole le plus jeune, a<br />une mobilité parfois importante, alors que le plus ancien, qui est associé à l'aster de<br />microtubules par des appendices qui sont caractéristiques de son ancienneté reste près du<br />centroïde de la cellule. La différence d'abondance des microtubules à proximité des deux<br />centrioles a pu être attribuée à une régulation différentielle de l'ancrage : le centriole le plus<br />ancien capture les microtubules qui sont nucléés dans un rayon de quelques microns autours<br />de lui, alors que le centriole fils, qui a une capacité de nucléation équivalente, a une capacité<br />d'ancrage des microtubules réduite. Ainsi, quand les deux centrioles sont éloignés l'un de<br />l'autre, de nombreux microtubules libres peuvent être observés dans la cellule, au contraire,<br />quand ils sont proches, la plupart des microtubules cellulaires sont ancrés sur le centrosome<br />(et en particulier sur le centriole père). Nous avons donc proposé que la cellule puisse<br />modifier son réseau microtubulaire en modulant la distance intercentriolaire.<br />La deuxième étude présentée porte sur un comportement particulier du centriole parental en<br />fin de mitose : après que les cellules se sont étalées, mais alors qu'elles sont encore reliées par<br />un pont cytoplasmique, les deux centrioles, dans chaque cellule fille, se séparent puis le<br />centriole parental quitte sa position centrale et stationne pendant 10 à 30 minutes à proximité<br />du pont cytoplasmique intercellulaire. Le pont se pince alors de chaque côté de la pièce<br />intermédiaire puis se rompt lorsque le centriole parental regagne sa position près du noyau.<br />Nous avons pu déterminer que le pincement du pont correspondait au détachement des<br />faisceaux de microtubules qu'il contient. Nous avons ensuite, à l'aide de drogue qui<br />dépolymérisent les microtubules, suggéré l'existence d'un contrôle de la présence du centriole<br />parental dans le pont. Nous avons étudié des cas de cellules acentriolaires et pu mettre en<br />évidence des défauts liés à la cytocinèse. Enfin, il nous est apparu, à la suite d'expériences sur<br />des substrats plus ou moins adhésifs que l'adhésion de la cellule à son substrat est un des<br />paramètres clé de la régulation de cet événement de fin de mitose.<br />Des interprétations plus spéculatives sont proposées dans les discussions qui suivent l'exposé<br />des résultats, ainsi que des expériences pour les tester.

Un système d'évaluation in vitro de l'activité de médicaments anti-EBV a été mis au point en utilisant la PCR/RT-PCR quantitative en temps réel. Trois composés appartenant à différentes classes antivirales ont été testés : un analogue nucléosidique, le ganciclovir (GCV), un analogue nucléotidique, le cidofovir (HPMPC), et un analogue du pyrophosphate, le foscarnet (PFA). Après 7 jours de traitement des cellules P3HR-1 productrices de virions, les concentrations inhibant de 50 % la réplication de l'ADN viral sont respectivement de 0.28 µg/mL, 0.29 µg/mL et 13.6 µg/mL pour le GCV, le HPMPC et le PFA. L'expression de l'ARNm de la glycoprotéine tardive gp350/220 est réduite de 79 à 89 % après 4 jours. Nous avons aussi démontré la spécificité de l'effet antiviral en mesurant les taux d'ADN (b-globine) ou d'ARN (hPBGD) cellulaires. En conclusion, notre système permet l'évaluation de l'effet antiviral contre l'EBV de façon quantitative, simple et précise.