La mitochondrie est un centre de régulation métabolique à la fois intégrateur de signaux (visant à ajuster son fonctionnement selon les besoins énergétiques cellulaires) et initiateur de voies rétrogrades (permettant une réponse cellulaire à des changements d'états fonctionneles de la mitochondrie). Ce travail s'intéresse plus particulièrement au métabolisme oxydatif mitochondrial et aux voies de signalisation activées, dans les cellules HepG2, lors de deux situations de stress énergétique : le découplage mitochondrial constitue un signal conduisant les cellules à développer leur métabolisme oxydatif sans modifier la glycolyse (notamment par activation de la transcription de gènes codant pour des protéines mitochondriales). La mitochondrie est également une des cibles du traitement par glucocorticoïdes, ces hormones induisant à la fois des effets à court terme et à long terme. les effets rapides (modification de l'activité des complexes I, II et III de la chaîne respiratoire mitochondriale) sont non génomiques et impliquent la fixation de la dexamethasone sur un récepteur membranaire. Ces effets sont médiés par l'activation calcium-dépendante de la protéine p38MAPK. Les effets à long terme (augmentation de la capacité de la chaîne respiratoire) sont transcriptionnels et nécessitent le recrutement du récepteur intracellulaire classique aux glucocorticoïdes. Les modifications du fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale par les glucocorticoïdes sont induites par le recrutement graduel de différents sites de liaison aux glucocorticîdes (membranaire et intracellulaire).

L'érythropoïèse est le processus permettant la production de globules rouges matures à partir de cellules souches hématopoïétiques. Ce programme de différenciation est en grande partie sous le contrôle du facteur de transcription GATA-1 qui active la transcription des gènes érythroïdes et de la protéine anti-apoptotique Bcl-xL. Au cours de l'apoptose, la caspase-3 clive GATA-1 induisant la diminution d'expression de Bcl-xL. Il a été montré que l'activation transitoire de la caspase-3 est indispensable pour la différenciation érythroïde terminale, mais GATA-1 n'est pas clivé. Dans ce travail, nous montrons qu'à la différence du proccessus apoptotique induit par la privation en Epo, au cours de la différenciation érythroïde, GATA-1 est protégé du clivage de la caspase-3 par la protéine chaperonne Hsp70. Au moment de l'activation de la capase-3, Hsp70 s'accumule dans le noyau des érythroblastes et protège GATA-1, permettant ainsi l'expression de Bcl-xL. Par contre, lors de la privation en Epo, Hsp70 est exportée du noyau et GATA-1 est clivé par la caspase-3 ce qui induit l'apoptose. D'autre part, la surexpression de GATA-1 induit un blocage de la maturation donc, l'expression de GATA-1 doit être finement régulée pour permettre une différenciation érythroïde normale. Nous avons montré qu'Hsp27 s'accumule dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation sous l'action de la phosphorylation de la MAPK p38. Hsp27 nucléaire interagit avec la forme acétylée de GATA-1 et induit son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome. Ces résultats montrent un nouveau rôle d'Hsp70 et Hsp27 au cours de la différenciation érythroïde terminale en intervenant dans des mécanismes de régulation fine de l'expression de GATA-1. Nous avons déterminé les mécanismes par lesquels Hsp70 est accumulé dans le noyau des érythroblastes au cours de la différenciation érythroïde terminale. L'érythropoïèse est régulée positivement par deux facteurs indispensables à la prolifération et la survie des progéniteurs éythroïdes, le SCF pour les phases précoces jusqu'au stade d'érythroblaste basophile et l'Epo à partir des CFU-E jusqu'au stade d'érythroblastes. Avant la diminution d'expression de c-Kit, le récepteur au SCF, au stade d'érythroblastes basophiles, Hsp70 est principalement cytoplasmique. En effet, le SCF induit l'export nucléaire d'Hsp70 par la phosphorylation induite par AKT sur la sérine 400 résultant en une faible quantité d'Hsp70 nucléaire. Au stade de la diminution d'expression de c-Kit, l'export nucléaire induit par le SCF est diminué. D'autre part, l'Epo, en activant Lyn, induit la rétention nucléaire d'Hsp70. Nous décrivons donc un nouveau mécanisme du retard de la différenciation érythroïde par c-Kit puisque sa diminution est nécessaire pour que GATA-1 soit protégé du clivage de la caspase-3 par Hsp70 nucléaire. De plus, nous suggérons un nouveau mécanisme de Lyn dans la survie et la différenciation des érythroblastes sous Epo. Nous avons testé notre modèle au cours de syndromes myélodysplasiques (SMD) de bas grade, caractérisés par une anémie associée à un excès d'activation des caspases et de l'apoptose ainsi qu'un retard de différenciation des progéniteurs érythroïdes. Nous avons démontré qu'un défaut de localisation nucléaire d'Hsp70 est en partie responsable du phénotype observé puisque l'expression d'Hsp70 nucléaire restaure en partie le phénotype des progéniteurs érythroïdes de patients atteints de SMD. Ces résultats concordent avec notre modèle physiologique. De plus, il est envisageable que c-Kit pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour les patients atteints de SMD.

Le terme de CLIP-170 désigne la protéine de lien cytoplasmique de 170 KDa, isolée par Rickard et Kreis (1990). In vitro, elle constitue un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). En chacun des points où la CLIP-170 est localisée, elle se co-distribue avec le complexe moteur dynéine/dynactine (D/D). Les auteurs ont initialement établi un modèle de fonctionnement de concert de ces trois protagonistes : la CLIP-170 établirait le lien initial entre le cargo et le MT. Le complexe D/D serait recruté sur le cargo. Une fois le moteur associé au MT, le lien statique serait levé, rendant possible le mouvement. Ce modèle offrait une explication aux données d'immunolocalisation. Toutefois, le fonctionnement de concert de la CLIP-170 et du moteur moléculaire nécessitait que l'on puisse trouver une interaction entre les protagonistes. Les travaux présentés dans cette thèse apportent pour la première fois la preuve d'une interaction indirecte entre le complexe D/D et la CLIP-170. LIS1 est une protéine codée par le gène causal du syndrome de Miller-Dieker, une forme de lissencéphalie de type I. Elle sert d'adaptateur entre le domaine carboxy-terminal de la CLIP-170 et le complexe moteur dont elle régule l'activité. Nos résultats établissent que le domaine d'interaction de la CLIP-170 avec LIS1 est requis pour l'adressage de la première aux kinétochores prémétaphasiques. Il est nécessaire à l'adressage de LIS1 (et du complexe moteur) aux bouts (+) des MTs interphasiques. Nous présentons deux nouvelles approches permettant d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 tant en interphase qu'en mitose : la microinjection d'anticorps dirigés contre les domaines extrêmes de la protéine, ainsi que l'utilisation de siRNA dirigés contre l'ARNm la codant. Combinées aux techniques de suivi de protéines fluorescentes par vidéomicroscopie 3D développées au laboratoire, elles permettront d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 et de définir ainsi son rôle.

La membrane plasmique des cellules épithéliales polarisées comporte deux domaines distincts, le domaine apical et le domaine basolatéral. Chaque domaine a une composition en lipides et en protéines déterminée, leur permettant d'assurer des fonctions spécifiques. Les mécanismes moléculaires responsables du tri et de l'adressage des protéines transmembranaires vers le pôle apical sont encore mal connus. La membrane apicale est enrichie en glycosphingolipides et en cholestérol qui forment des microdomaines appelés « rafts ». Expérimentalement, les rafts peuvent être isolés sous forme de DRM (detergent-resistant membranes) définis par leur résistance à un détergent non ionique, le Triton X-100. Il a été proposé que les rafts recrutent les protéines apicales au niveau du réseau trans-golgien et servent de plateforme pour leur adressage au pôle apical. Effectivement les protéines ancrées par le glycosylphosphatidyl-inositol sont résistantes au Triton et sont localisées en général à la membrane apicale. En revanche, la plupart des protéines transmembranaires apicales sont solubles dans le Triton, bien qu'elles soient résistantes à l'action de détergents plus doux comme le Lubrol WX. L'objectif des travaux de thèse a été d'étudier le rôle des rafts dans l'adressage apical de protéines transmembranaires et de comprendre l'effet différentiel du Triton et du Lubrol sur leur solubilisation. Les nucléotides pyrophosphatases NPP1 (basolatérale) et NPP3 (apicale) exprimées de façon stable dans les cellules MDCK ont servi de modèles. NPP3 est insoluble dans le Lubrol et partiellement insoluble dans le Triton, tandis que NPP1 est essentiellement solubilisée. L'étude de la localisation et de la sensibilité aux détergents de mutants et de chimères combinant des domaines cytoplasmiques, transmembranaires et extracellulaires de NPP3 et NPP1, a montré qu'il n'existait pas de corrélation stricte entre l'adressage apical et la résistance aux détergents. La résistance de NPP3 à la solubilisation par le Lubrol est acquise précocement au cours de sa biosynthèse, indépendamment de sa destination finale. Cette résistance dépend d'acides aminés chargés positivement situés dans la queue cytoplasmique, proches de la membrane. Afin de comprendre la sélectivité du Triton et du Lubrol dans l'extraction des protéines et des lipides membranaires, la composition lipidique des DRM obtenus après extraction par le Triton et le Lubrol a été comparée. Les DRM extraits par le Triton et le Lubrol sont enrichis en cholestérol ce qui correspond à la définition des rafts. Cependant, les DRM Triton sont appauvris en lipides du feuillet interne tandis que les DRM Lubrol sont enrichis en phosphatidyléthanolamine. Les DRM Lubrol sont également enrichis en protéines associées au feuillet interne de la membrane. En conclusion, ces travaux montrent que la résistance de la protéine apicale NPP3 à l'extraction par le Lubrol, et en partie par le Triton, est une propriété intrinsèque qui correspond probablement à une adaptation de la protéine à la composition lipidique du domaine apical, mais que cette propriété ne détermine pas son adressage polarisé. De plus, ces travaux montrent que les détergents sont des outils très intéressants pour étudier les interactions entre les protéines et les lipides membranaires, mais qu'il n'existe probablement pas de détergent capable d'isoler de façon stricte des microdomaines membranaires tels que sont définis les rafts. Nos résultats suggèrent que le feuillet interne des rafts est enrichi en phosphatidyléthanolamine et en cholestérol, qu'il est en partie solubilisé par le Triton, ce qui déstabiliserait les protéines transmembranaires et entraînerait leur extraction. Mots clés: détergent, raft, , ciblage apical, cholestérol, microdomaine membranaire, feuillet interne de la membrane, phosphatidyléthanolamine.

Les dérivés du tétrahydrofolate (THF), plus connus sous le nom de folate(s) ou vitamine B9, sont des cofacteurs indispensables au métabolisme cellulaire puisqu'ils sont à la base des réactions de transfert d'unités monocarbonées, regroupées sous le terme de "métabolisme C1". Chez tous les organismes, ces réactions sont impliquées dans des processus cellulaires clés comme la synthèse des nucléotides (purines, thymidylate), la synthèse de certains acides aminés (sérine, glycine, méthionine) et, indirectement, dans la synthèse de S-adénosylméthionine. Cette dernière constitue le donneur universel de groupements méthyles et intervient donc dans l'ensemble des réactions de méthylation. Les plantes, les champignons et certains micro-organismes possèdent la capacité de réaliser la synthèse de novo de THF alors que les animaux en sont incapables et sont contraints de puiser cette vitamine dans leur alimentation.<br /> Lors du développement de la plante, la capacité de synthèse du THF, le pool global et la nature des folates ainsi que la demande en unités C1 varient de façon importante. Pourtant, la littérature reste succincte en ce qui concerne les mécanismes qui permettent de contrôler l'homéostasie en folates en fonction des besoins fluctuants en unités C1 de la plante et sur la manière dont sont distribuées ces unités entre les différentes voies utilisatrices.<br /> Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence différents niveaux de régulation du métabolisme C1 permettant à la plante de répondre à une diminution du pool de folates. Ainsi, l'étude transcriptomique de la réponse de cellules d'Arabidopsis à un traitement par un antifolate, le méthotrexate, a révélé une absence de processus de compensation de la baisse de la quantité de folates puisque les gènes impliqués dans la synthèse, le transport et la dégradation du THF ne présentent pas de modification de leur expression. La régulation transcriptionnelle mise en place suite à une limitation en folates concerne un nombre restreint de gènes qui vont influencer la composition en dérivés du THF et non l'abondance de ce cofacteur vitaminique. En effet, alors qu'en situation physiologique le flux d'unités C1 alimente majoritairement les réactions de méthylation, il se trouve que le déficit en folates provoque une réorientation de ce flux vers la synthèse des nucléotides.<br /> La diminution des méthylations cellulaires en situation de déficit en folates a été illustrée lors de l'étude d'une méthyltransférase particulière qui intervient dans la synthèse des chlorophylles, la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase. Des feuilles de pois déficientes en folates présentent une forte diminution de l'index de méthylation qui se traduit par une régulation métabolique de l'activité de la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase, conduisant ainsi à une baisse de la synthèse des chlorophylles. Cette étude démontre que le statut en folates influence, via les réactions de méthylations, des processus physiologiques essentiels comme la biogenèse de l'appareil photosynthétique.<br /> Ce travail de thèse a également mis en évidence un mécanisme de régulation post-traductionnelle de la synthèse de méthionine en situation de carence en folates. Ce mécanisme consiste en un clivage protéolytique de l'extrémité N-terminale de la première enzyme dédiée à la synthèse de méthionine, la cystathionine γ-synthase. L'élimination de ce domaine régulateur de l'enzyme permet, par un mécanisme encore inconnu, d'accroître la biosynthèse de méthionine en situation de déficit en folates.

Dans les neurones, la stabilité des microtubules est induite par leur association avec deux protéines associées aux micotubules, les protéines E- et N-STOP (Early and adult neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne des défauts de la transmission synaptique associée à une réduction du nombre de vésicules synaptiques. <br />Les neurones matures contiennent également une protéine apparentée à la protéine N-STOP, la protéine SL21 (STOP like protein of 21 kDa) qui possède deux zones homologues aux protéines STOPs : un domaine homologue au domaine de liaison et de stabilisation des microtubules et une région de 35 acides aminés située à l'extrémité amino-terminale. Cette protéine se localise à la fois au niveau de l'appareil de Golgi et des microtubules.<br />La première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation fonctionnelle du domaine amino-terminal. Il contient 3 résidus cystéines en position 5, 10 et 11 qui peuvent être palmitoylée (modification permettant l'association des protéines aux membranes). Nous avons montré que les cystéines 5 et 11 de SL21 sont palmitoylables mais que seule la cystéine 5 est suffisante et nécessaire pour localiser SL21 au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons également mis en évidence que la protéine STOP, en plus d'être localisée aux microtubules, s'associe également au Golgi par l'intermédiaire de son domaine amino-terminal homologue à SL21 et qu'elle est aussi palmitoylable.<br />Dans la deuxième partie de ce travail, pour mieux comprendre la fonction de SL21, nous nous sommes intéressées aux partenaires de SL21. Un criblage ciblé en Double-Hybride, utilisant comme protéines cibles des protéines connues comme étant des partenaires de STOP, a été réalisé au laboratoire. Trois partenaires potentiels ont été mis en évidence : la protéine Tctex1, une des chaînes légère du moteur moléculaire dynéine. Nous avons confirmé l'interaction de ces protéines avec SL21 par co-immunoprécipitation après surexpression dans les cellules et aussi, à partir d'un extrait de cerveau pour l'interaction de SL21 et de STOP. Nous avons également déterminé leur site d'interaction au niveau de SL21. La protéine Tctex1 interagit avec SL21 au niveau de son module de liaison aux microtubules, le site de multimérisation de SL21 se localise au niveau du domaine amino-terminal, pouvant impliquer la palmitoylation de ces protéines. <br />L'ensemble de ces résultats permet d'envisager un rôle des protéines STOPs au niveau de la régulation de la relation microtubule-membrane des vésicules synaptique au sein de la synapse

The detection and annotation of cis-regulatory sequences is a difficult problem. There is currently no generally applicable experimental procedure or computational algorithm to identify the non-coding regions of the genome that serve to activate gene expression in a given cell type. The only indicator of cis-regulatory function is the conservation of a sequence in other genomes. Regions can then be tested one-by-one in transgenic assays but this is time-consuming in vertebrates. Only a limited number of these already validated cis-regulatory sequences have been curated in biological databases. One of the main advantages of the model organism Ciona intestinalis is that cis-regulatory tests can be conducted very easily and the result is observable after one day while the animal follows the chordate body plan. However, a sequence found to be active in this organism can currently not be mapped to genomes of other animals.

La protéine E2F-1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Ayant préalablement décrit son profil d'expression différentielle dans les tumeurs bronchiques, nous avons étudié son rôle potentiel dans ces tumeurs.<br>L'épissage alternatif des pré-ARNm joue un rôle important dans la régulation de l'apoptose et les protéines de la famille SR sont des régulateurs principaux des événements de l'épissage alternatif et constitutif. Actuellement très peu de données existent concernant leurs activateurs en amont ainsi que leurs gènes cibles impliqués au cours du processus apoptotique. Dans ce travail, nous avons identifié la protéine SC35, un membre de la famille des protéines SR, comme une cible transcriptionnelle directe de E2F1. Nous avons montré que les deux protéines interagissent et coopèrent pour induire l'apoptose, notamment en réponse aux agents génotoxiques, en modifiant les patrons d'épissage de certains gènes apoptotiques dont Bcl-x, ou caspase-9, en faveur des transcrits codant pour les isoformes pro-apoptotiques. Ces résultats démontrent la capacité de E2F1 à réguler les profils d'épissage de transcrits contrôlant l'apoptose via la protéine SC35. Finalement, nous avons obtenu des résultats impliquant SC35 dans le contrôle des fonctions transactivatrices de E2F1 au niveau de gènes contrôlant la division cellulaire, et notamment la synthèse d'ADN. La protéine VEGF-A existe sous la forme de multiples isoformes protéiques résultant de l'épissage alternatif de son ARNm pré-messager et dénommées de façon générique VEGFxxx (formes pro-angiogéniques) et VEGFxxxb (formes anti-angiogéniques). L'expression des différentes isoformes de VEGF-A est fortement dérégulée dans les tumeurs. Dans un deuxième axe de ce travail, nous avons montré que E2F1 réprime l'activité du promoteur du VEGF-A dans nos lignées dépourvues de p53 fonctionnelle et dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons montré que E2F1 n'affecte pas négativement le niveau d'expression des isoformes VEGFxxxb suggérant que E2F1 stimule l'inclusion de l'exon 8b du VEGF-A par un mécanisme restant à identifier. Nos résultats montrent qu'E2F1 affecte la balance des isoformes du VEGFA en faveur de ses formes anti-angiogeniques et suggèrent que le facteur d'épissage SC35 contribue à ces effets. Nos travaux ouvrent des perspectives quand aux conséquences biologiques de la dérégulation de l'expression de E2F1 dans les cancers bronchiques via une modification des facteurs d'épissage et un rôle de E2F1 dans le processus de néoangiogénèse.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l'action conjuguée d'un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l'oxygène. Dans le cadre d'un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l'effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d'un corécepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d'ARN interférence visant à éteindre l'expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur dépendante du conjugué. In vivo, l'accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l'endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l'accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d'augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide Aψ[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.

La maladie de Parkinson est une maladie neuro-dégénérative d'hypo-motricité. Des facteurs génétiques et environnementaux ont été mis en évidence dans son apparition. Les traitements reposent sur une approche pharmacologique ou chirurgicale. Le traitement par stimulation cérébrale profonde (SCP) mis au point par le Professeur Benabid a démontré son efficacité.<br />L'objectif de cette étude est de comprendre les mécanismes d'action de la SCP. Nous avons montré, par une étude du transcriptome par micro-array, que la stimulation électrique à haute fréquence provoque un profil d'expression génique propre. Les modifications de l'expression génique portent essentiellement sur des gènes de la synthèse et dégradation protéique ainsi que de la transcription et maturation des ARN. L'importance des contrôles qualités est mise en avant et nous présentons des moyens d'améliorer la reproductibilité des résultats de micro-array. L'étude a été poursuivi par une approche de l'expression protéique par incorporation de méthionine marquée et par spectrométrie de masse SELDI-TOF. Les résultats montrent une diminution significative de l'expression protéique lors de la stimulation électrique.