Les galactoglycérolipides (i.e. monogalactosyldiacylglycérol, MGDG et digalactosyldiacylglycérol, DGDG) sont les lipides majeurs des membranes des chloroplastes, représentant jusqu'à 80% de la composition membranaire plastidiale. La synthèse de ces galactolipides est catalysée par deux types de galactosyltransférases, les MGDG synthases (ou MGD) et les DGDG synthases (ou DGD). Lors de cette synthèse, un groupement ß-galactosyl provenant d'un UDP- aGal, est transféré sur la position sn-3 d'un diacylglycérol (DAG). Les DGD utilisent le MGDG produit par les MGD comme substrat pour la synthèse du DGDG. La synthèse du MGDG est donc essentielle pour la biogenèse du chloroplaste et par conséquent pour la survie de la cellule végétale. Les Apicomplexes sont des parasites intracellulaires obligatoires d'importance médicale et vétérinaire. Ils possèdent un plaste vestigial non-photosynthétique, nommé apicoplaste, acquis par endosymbiose secondaire d'une algue rouge. L'apicoplaste est impliqué dans de nombreuses voies métaboliques de type végétal. De plus, il est essentiel à la survie du parasite. La synthèse de galactolipides aux propriétés chromatographiques indiscernables de celles du MGDG et du DGDG a été mesurée chez Toxoplasma gondii, le parasite Apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Nous avons entrepris une étude comparative du métabolisme et de la dynamique des galactolipides chez les plantes et des lipides structurellement apparenté chez les parasites Apicomplexes, par des analyses de biochimie, biologie structurale, moléculaire et cellulaire chez A. thaliana et T. gondii. Nous avons tout d'abord établi un modèle structural de la MGDG synthase chloroplastique basée sur son homologie avec la glycosyltransférase bactérienne MURG. Ce modèle structural a été validé par mutations ponctuelles rationalisées. Ce modèle indique les résidus impliqués dans la liaison de l'UDP-Gal et permet d'avancer dans notre compréhension du mécanisme catalytique. Il permet de proposer certaines régions comme participant à la fixation du DAG et à l'association à la membrane du chloroplaste. La structure présentée dans ce manuscrit constitue un outil pour l'étude d'inhibiteurs de la MGDG synthase et la compréhension de l'évolution complexe des enzymes de galactosylation. Nous avons montré que des inhibiteurs des MGDG synthases de plantes, identifiés par criblage pharmacologique d'une chimiothèque de 23360 composés, avaient des propriétés herbicides, algicides et anti-parasitaire sur A. thaliana, C. reinhartdii et T. gondii respectivement. Nous avons par la suite engagé un programme d'optimisation par synthèse chimique et mesuré les effets de plus de 200 dérivés des molécules initiales. Cette stratégie nous a permis d'optimiser certaines de ces molécules dans l'objectif de développer des candidats herbicides/médicaments. Grâce à l'utilisation de serums de lapin et de rat obtenus après immunisation avec du DGDG, nous avons détecté chez T. gondii un lipide, désigné DGLE (digalactolipid-like epitope), structuralement apparenté au digalactolipide. Ce lipide est localisé au niveau des membranes de la pellicule du parasite. De plus, la localisation du DGLE dépend du stade de vie du parasite, redistribué lors de l'invasion dans une cellule hôte. Le DGLE semble lié aux protéines associées au cytosquelette d'actine et/ou à des domaines membranaires. La détermination du lipidome de la pellicule par spectrométrie de masse montre que des dihexosyl-lipides mineurs dérivés de diacylglycérol, alkyl-acyl ou de céramide ont une masse compatible avec le DGLE. La question de la structure du DGLE, pour sa partie hydrophobe, reste donc irrésolue. Ce lipide a été détecté chez d'autres Apicomplexes tels que Plasmodium falciparum (agent de la malaria) et Cryptosporidium parvum (agent de la cryptosporidiose). Le fait d'avoir pu induire une réponse immunitaire par injection du DGDG chez le lapin et le rat conduisant à la détection d'un épitope à la surface de T. gondii, nous a amené à étudier l'antigène digalactolipidique et ses applications éventuelles dans des visées diagnostiques et / ou thérapeutiques. Nous avons montré que le serum provoquait l'agglutination du parasite et empêchait son invasion dans la cellule hôte in vitro. Le marquage de la surface du parasite par le serum (i.e. l'opsonisation) active la réponse immunitaire inné in vitro. La phagocytose par les macrophages et l'activation du complément est accrue par rapport au contrôle. Ces résultats préliminaires suggèrent que des outils diagnostics et/ou des stratégies vaccinales nouveaux, basés sur la reconnaissance de l'antigène digalactolipidique de surface des parasites Apicomplexes, pourraient être envisagés. Les perspectives de ces travaux incluent une poursuite du développement des inhibiteurs des MGDG synthases pour d'une part des recherches fondamentales par des approches de génétique chimique (invalidation chimique, utilisation de dérivés couplés à la biotine), et d'autre part des applications éventuelles en tant que candidat herbicides et / ou antiparasitaires. L'étude du rôle et de la synthèse des galactolipides chez T. gondii nécessitera la résolution de la structure du DGLE et la recherche des enzymes impliquées dans sa synthèse. Les effets remarquables du serum anti- DGDG mesuré in vitro devront être approfondis sur modèle animal.

La mort cellulaire programmée ou apoptose est un mécanisme conservé chez les eucaryotes multicellulaires qui contribue au développement embryonnaire et à l'homéostasie cellulaire des organismes. Dans les cellules vivantes, l'activité des protéases qui exécutent le programme de mort cellulaire, les caspases, est contrôlée par des signaux de survie provenant de l'environnement cellulaire. Les caspases initiatrices de l'apoptose régulée par l'environnement, la caspase 9 et la caspase 8 sont activées respectivement par l'apoptosome et par les récepteurs de mort. Les signaux environnementaux, parmi lesquels le contact avec la matrice extracellulaire ou la présence de facteurs de croissance, activent des voies de signalisation contrôlant la machinerie de mort cellulaire. La voie des MAPK1/3 est une voie de signalisation contrôlée par le proto-oncogènes Ras et comportant les kinases Raf, MEK1/2 et MAPK1/3 (ERK2/1 ou p42/p44). La voie des MAPK1/3, qui est impliquée dans la prolifération et la différentiation cellulaire, joue un rôle essentiel dans la survie cellulaire. L'objectif de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3. Ce travail est basé sur l'utilisation d'une forme active et inductible de la kinase Raf-1 (DRaf-1:ER) dont l'activation forte et prolongée correspond à une induction pathologique de la voie des MAPK1/3. Nous avons montré que, selon le type cellulaire, l'activation de deltaRaf-1:ER favorise la survie ou la mort cellulaire. Dans les cellules fibroblastiques CCL39, l'activation de deltaRaf-1:ER protège de la mort cellulaire mitochondriale induite par la privation en sérum du milieu de culture. Dans ces conditions, nous avons montré que la stimulation de Raf-1 :ER bloque l'activation de la caspase-9 mais n'empêche pas la délocalisation du cytochrome c, la multimérisation d'APAF1 ni le recrutement de la procaspase 9 dans l'apoptosome. Ce mécanisme post mitochondrial de protection contre la mort cellulaire dépend de la néo-synthèse des protéines et nécessite une activité continue de la kinase MEK. A l'inverse, dans les cellules HEK 293 issues de rein embryonnaire et présentant des caractéristiques neuronales, nous avons montré que l'activation soutenue de la voie des MAPK1/3 par DRaf1-ER induit une mort cellulaire massive. Celle-ci est caractérisée par l'activation des caspases et la fragmentation de l'ADN. La mort cellulaire est détectée plus de 24 heures après l'activation de Raf1-ER, elle est maximale à 48h. L'induction de la mort cellulaire ne requière la synthèse protéique que durant la phase précoce d'activation mais nécessite l'activité continue du module MEK/MAPK. La mort cellulaire résulte de l'activation de la caspase 8 et n'implique pas la voie mitochondriale, elle est caractérisée par une vacuolisation importante du cytoplasme des cellules qui l'apparente à une forme particulière d'apoptose. L'inactivation des fonctions du récepteur fas et de son adaptateur FADD indique que le processus d'activation de la caspase 8 est indépendant de la voie des récepteurs de mort. L'ensemble de ces travaux apporte des connaissances nouvelles sur le contrôle de la mort cellulaire par la voie Raf/MAPK1/3. Nous avons montré que la voie de signalisation peut, selon le contexte cellulaire, favoriser la survie cellulaire ou induire la mort. Dans les deux cas, le contrôle de la mort cellulaire dépend à la fois de la synthèse protéique et de mécanismes post-traductionnels. Les mécanismes moléculaires affectés par l'activation prolongée des MAPK1/3 seraient impliqués aussi bien dans la résistance des cellules tumorales aux traitements proapoptotiques que dans le développement des maladies neurodégénératives.

L'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) peut s'associer chez les patients à des manifestations extrahépatiques auto-immunes. La question se pose de l'origine de cette auto-réactivité et de ses cibles. Le stress induit par l'infection chronique par le VHC induit la surexpression d'HSP70 dans les tissus hépatiques et dans le sang, phénomène s'accompagnant de l'apparition d'anticorps anti-HSP uniquement chez les patients ayant une dysimmunité associée au VHC. Grâce à un modèle cellulaire exprimant de façon stable une partie de la polyprotéine virale, nous montrons qu'à l'échelon cellulaire, ce stress viral se traduit non seulement par une augmentation du taux d'HSP, mais aussi par la présence de complexes HSP-peptides inhabituels, doués d'antigénicité. Ce stress cellulaire semble être en partie lié à l'activité protéolytique de la protéase NS3. C'est la première fois qu'est mis en évidence le rôle direct d'une protéase virale dans le développement du stress cellulaire secondaire à une infection virale. NS3 semble exercer une activité protéolytique vis-à-vis de plusieurs protéines cellulaires substrats dont le cytochrome P450 2D6, dont des épitopes sont impliqués dans l'hépatite auto-immune associée au VHC. NS3 est donc susceptible de favoriser, par son activité protéase, l'émergence d'épitopes nouveaux. L'interaction de NS3 avec C1Inh suggère un possible contrôle cellulaire de la protéase, qui serait favorisé par l'IFN, cytokine connue pour augmenter la synthèse de C1Inh.

A l'interface physico-chimie/biologie, ce travail s'intéresse à l'interaction de colloïdes lipidiques (virus, vecteurs modèles...) en contact avec des cellules vivantes en culture (HeLa). Par une approche cinétique statistique complétée d'une mesure de force locale, nous décrivons l'adhésion de particules fonctionnalisées présentant une affinité spécifique pour des récepteurs cellulaires. En raison de son intérêt (ciblage de tumeurs, voie rétrograde), le couple ligand/récepteur de la toxine de Shiga et de son récepteur Gb3 a été utilisé pour le ciblage des colloïdes (chapitre 1). Les mesures cinétiques réalisées sur ces colloïdes fonctionnalisés par la toxine de Shiga, confrontées à plusieurs modèles cinétiques originaux, ont alors permis de mettre en évidence les mécanismes impliqués dans l'accrochage des objets sur la surface cellulaire. En particulier, un modèle inspiré des mécanismes de polymérisation et s'appuyant sur des effets de coopérativité des récepteurs (recrutement par diffusion) a été retenu et permet de proposer une description microscopique des processus mis en oeuvre (2). De plus, des modifications physico-chimiques de la surface des colloïdes (polymères PEG, nature et densité du ligand) ont été envisagées (3 et 4). L'étude a permis notamment de quantifier l'effet du PEG sur l'adhésion des colloïdes et de proposer une interprétation de l'origine microscopique (répulsion par le glycocalyx). Par ailleurs, nous avons pu, en utilisant une technique de micromanipulation (Biomembrane Force Probe) mesurer localement la force de la liaison colloïde/cellule. Cette mesure a révélé une quantification des forces de rupture, suggérant l'existence de liens multiples (5). Enfin, l'étude de l'entrée et du devenir des particules à l'intérieur des cellules a été amorcée (6). Ce travail souligne ainsi de quelle façon des mesures physiques quantitatives peuvent permettre de proposer une description microscopique de mécanismes biologiques.

Les bases moléculaires de la sécrétion hormonale et de la libération de neurotransmetteurs dépendantes du calcium sont très semblables. Durant ma thèse, je me suis intéressé à divers aspects du cycle des granules de sécrétion dans des modèles cellulaires neuroendocriniens. J'ai en particulier étudié la contribution des transporteurs plasmiques de neuromédiateurs à la taille du quantum de sécrétion. Nous avons démontré que la surexpression de SERT (le transporteur plasmique de recapture de la sérotonine) au sein de la lignée neuroendocrine PC12 induit une augmentation de la taille des quanta sécrétés, et que le contrôle du remplissage vésiculaire était cinétique plutôt que thermodynamique. Ces observations ont permis de développer une méthode de mesure de l'activité sécrétrice d'une sous-population transfectée des cellules PC12. Cette technique permet de quantifier l'effet d'une protéine co-transfectée avec SERT sur l'activité sécrétrice.<br /><br />Une autre partie de mon travail concerne les petites GTPases Rab. Ces protéines régulent de nombreuses étapes du trafic cellulaire. Rab3 joue un rôle dans le contrôle d'étapes tardives de la neurotransmission/sécrétion d'hormones. Nos résultats, basés sur des analyses électrochimiques et biochimiques, suggèrent que Rab3 contrôlerait l'étape d'amorçage de la fusion.<br /><br />Plus récemment, notre attention s'est portée sur Rab27, une Rab proche de la famille Rab3, ainsi que sur MyRIP (Myosin and Rab Interacting Protein). Nous avons montré que MyRIP est un ligand de Rab27 et que ces deux protéines sont associées aux granules de sécrétion. MyRIP interagit aussi avec les myosines 7a/5a et avec l'actine. Ainsi, Rab27 et MyRIP lient les granules au cytosquelette d'actine et contrôlent leur mobilité au voisinage de la membrane plasmique.<br /><br />Nos études sur Rab3 et Rab27 ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires des processus impliquant ces GTPases, et illustrent la diversité des modes d'action de ces protéines.

L'histone déacétylase HDAC6 est une enzyme multifonctionnelle possédant deux domaines déacétylases en tandem et un domaine fixant l'ubiquitine. Localisée exclusivement dans le cytoplasme, cette protéine peut déacétyler les microtubules acétylés et participer à la prise en charge des protéines ubiquitinées lors de la formation d'agrésomes. Elle possède également une activité sur d'autres substrats comme les histones ou HSP90, et elle contribue à divers processus cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse décrit un rôle supplémentaire de cette déacétylase dans la réponse après un stress. Il vise à comprendre comment HDAC6 participe dans les mécanismes d'activation des gènes HSPs, et dans les processus de récupération cellulaire à la suite d'un choc thermique. La découverte d'un nouveau domaine nommé SE14 chez la protéine HDAC6 humaine, présente un dispositif supplémentaire de régulation nucléocytoplasmique pour cette protéine. Ce domaine permet la rétention dans le cytoplasme de cette protéine en renforçant le mécanisme d'export nucléaire. A coté de ce contrôle, le fonctionnement des deux domaines déacétylases est analysé. Des expériences in vitro et in vivo confirment l'importance de l'arrangement spatial des deux domaines dans la réaction de déacétylation. Finalement, ce travail montre que la protéine HDAC6 intervient lors de la différenciation ostéoclastique. Par son activité catalytique sur les microtubules acétylés et grâce à son interaction avec l'effecteur mDIA2, cette déacétylase est impliquée dans la maturation des ostéoclastes.

L'infection des hépatocytes par les sporozoïtes constitue une première étape obligatoire du cycle de Plasmodium chez l'hôte vertébré. Les mécanismes impliqués dans l'invasion des hépatocytes restent mal caractérisés. Nous avons découvert que CD81, une protéine transmembranaire appartenant à la famille des tétraspanines, est nécessaire à l'infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium falciparum, de Plasmodium yoelii, et dans certains cas de Plasmodium berghei. L'expression de CD81 suffit à rendre les cellules hépatocytaires HepG2 sensibles à l'infection par les sporozoïtes de P. yoelii mais pas P. falciparum, suggérant l'intervention d'autres molécules pour ce parasite. Une caractéristique majeure des tétraspanines est leur capacité de s'associer entre elles et avec d'autres molécules de surface pour former des microdomaines membranaires distincts des radeaux lipidiques classiques (« rafts »). Nos résultats montrent que le cholestérol membranaire contribue non seulement à la localisation de CD81 dans les microdomaines enrichis en tétraspanines mais aussi à l'infection par les sporozoïtes de Plasmodium lorsqu'elle implique une voie dépendante de CD81. Nous n'avons pas pu mettre en évidence d'interaction directe entre CD81 et les sporozoïtes, ce qui suggère que CD81 pourrait ne pas jouer un rôle de récepteur pour le parasite mais intervenir de manière indirecte. EWI-F et EWI-2, deux protéines transmembranaires associées à CD81 dans les hépatocytes, ne sont pas directement impliquées dans l'infection par les sporozoïtes. Au contraire, EWI-F a un effet inhibiteur sur l'infection, peut-être lié à une réorganisation des microdomaines à tétraspanines ou à une compétition avec un autre partenaire de CD81. Une autre molécule associée à CD81 pourrait donc jouer un rôle essentiel dans l'infection par les sporozoïtes, éventuellement comme récepteur, mais sa nature reste à déterminer.

De nombreuses kinases participent au bon déroulement de chaque étape du cycle cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, les kinases Aurora-A et Aurora-B, structuralement très proches, exercent des rôles fondamentaux durant la mitose. Aurora-A est une protéine localisée au niveau des centrosomes, impliquée dans le cycle de division du centrosome et la formation du fuseau mitotique. Aurora-B est une protéine passagère localisée sur les centromères et qui migre, en anaphase, sur le sillon de division et se concentre en cytocinèse sur le corps résiduel. Aurora-B est responsable de la phosphorylation massive, en mitose, du résidu Serine 10 de l'histone H3. Par un système de pseudo-génétique, j'ai ciblé, dans l'extrémité amino-terminale de Aurora-A, le domaine responsable de sa localisation centrosomique. Ces expériences ont montré que les domaines catalytiques de Aurora-A et Aurora-B possèdent tous deux un signal de localisation centromérique. Mais, à l'inverse de Aurora-B, le domaine catalytique de Aurora-A ne se transfert pas des centromères vers le sillon de division en anaphase. Ces travaux montrent également que Aurora-A est capable d'assurer une partie des fonctions mitotiques de Aurora-B. J'ai par ailleurs identifié et cloné la séquence de la protéine passagère TD-60 de Xenopus laevis. J'ai exprimé des domaines protéiques de la protéine xTD60, afin de générer un anticorps spécifique de TD-60 de xénope. Des expériences de co-sédimentation de complexes protéiques d'extraits mitotiques d'œufs de xénope et des expériences d'immunolocalisation cellulaire nous permettent d'envisager pour xTD-60 des fonctions plus larges que celles attribuées aux protéines passagères.

CE TRAVAIL A PORTE SUR L'ETUDE DE LA PROTEINE MULTIMODULAIRE ALIX CHEZ DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM, UN ORGANISME EUCARYOTE Où DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE ET PROGRAMME DE MORT CELLULAIRE SONT ETROITEMENT LIES. L'INVALIDATION D'ALX MONTRE QUE CETTE PROTEINE EST ESSENTIELLE A LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE ET A LA MORPHOGENESE AU COURS DU DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE MAIS PAS AU PROGRAMME DE MORT. UNE APPROCHE STRUCTURE/FONCTION A REVELE QUE LE DOMAINE SUSCEPTIBLE DE PARTICIPER A DES TORSADES D'HELICES DE CETTE PROTEINE EST INDISPENSABLE A SA FONCTION DEVELOPPEMENTALE. DE PLUS, SA DISTRIBUTION CELLULAIRE INDIQUE QU'ALIX EST LOCALISE DANS LA VOIE ENDOCYTAIRE EN ASSOCIATION AVEC LA MACHINERIE ESCRT (ENDOSOMAL SORTING COMPLEX REQUIRED FOR TRANSPORT), IMPLIQUEE DANS LE TRI ET LA FORMATION DU CORPS MULTIVESICULAIRE (MVB). CEPENDANT, L'INVALIDATION DES GENES CODANTS POUR DIFFERENTS COMPOSANTS DES COMPLEXES ESCRT INDUIT DES PHENOTYPES DISSEMBLABLES. CECI SUGGERE QUE SOIT CES PROTEINES ONT DES ROLES DANS D'AUTRES PROCESSUS CELLULAIRES SOIT QUE CETTE VOIE N'EST PAS PERTURBEE DE LA MEME FAÇON DANS LES DIFFERENTS MUTANTS.

La traduction est une étape critique de la régulation de l'expression des gènes. Chez l'oursin, la fécondation induit une augmentation de la synthèse protéique, qui dépend essentiellement de la traduction d'ARN messagers maternels. Cette synthèse protéique est indispensable au déroulement des cycles cellulaires du développement précoce. Le développement embryonnaire de l'oursin constitue ainsi un modèle de choix pour étudier la régulation de la traduction. Dans le cadre de cette thèse, le contrôle de la traduction a été étudié chez l'oursin dans deux situations : le contexte physiologique de la fécondation et le contexte de l'induction de l'apoptose. Nous nous sommes interrogés d'abord sur les mécanismes régulateurs impliqués dans la synthèse protéique après fécondation. L'une des étapes limitantes de la traduction est l'initiation. Dans ce cadre, le facteur d'initiation eIF2 joue un rôle clé. eIF2 est responsable de l'apport de la méthionine initiatrice au niveau du ribosome. Lorsque la sous-unité alpha d'eIF2 est phosphorylée, la synthèse protéique globale est inhibée et la traduction sélective de certains ARNm est stimulée. Dans les ovules non fécondés d'oursin, eIF2alpha est physiologiquement phosphorylé et la fécondation provoque sa déphosphorylation. En micro-injectant dans les ovules non fécondés un variant d'eIF2alpha mimant l'état phosphorylé, nous avons montré que la déphosphorylation d'eIF2alpha est nécessaire pour la première division mitotique chez l'oursin. Nous nous sommes intéressés au lien entre la phosphorylation d'eIF2alpha et l'induction de l'apoptose chez l'oursin. En effet, la traduction d'ARNm codant pour des protéines pro- ou anti- apoptotiques influence directement la survie des cellules. L'embryon d'oursin possède la machinerie nécessaire pour le déclenchement de l'apoptose, après induction par l'agent génotoxique MMS. Le traitement au MMS des embryons provoque la phosphorylation d'eIF2alpha. Dans cette situation, nous avons trouvé que la kinase GCN2 est impliquée dans la phosphorylation d'eIF2alpha. En fin, dans le but d'étudier comment la machinerie traductionnelle module le recrutement polysomal, nous avons analysé le traductome en réponse à la fécondation et après le traitement au MMS. Nous avons effectué une approche de séquençage à haut-débit des transcrits purifiés par gradients de polysomes. L'analyse de ces transcrits nous permettra d'appréhender le réseau des gènes régulés au niveau traductionnel lors de la fécondation et de l'induction de l'apoptose dans les embryons d'oursin.