La formation de métastases est un processus comportant de multiples étapes, présentées par le paradigme actuel comme devant être franchies séquentiellement par une (des) cellule(s) possédant l'ensemble des capacités génétiques et phénotypiques requises par ce processus sélectif. Les déterminants génétiques responsables de l'acquisition du phénotype métastatique restent cependant incomplètement déterminés à ce jour. Une première approche, dans un modèle in vivo de cancer colo-rectal humain, démontre qu'il existe une coopération entre cellules tumorales métastatiques et non métastatiques. Nous rapportons l'existence d'une colonisation spécifique des métastases (établies par des cellules caractérisées par leur potentiel métastatique) par des cellules tumorales incapables de métastaser seules. Cette colonisation des métastases n'est pas due à l'existence d'embols tumoraux mixtes (qui seraient faits de cellules métastatiques et non métastatiques), ni à l'induction d'un switch métastatique pérenne au sein des cellules tumorales non métastatiques. Cette observation remet fortement en cause le modèle actuel selon lequel les métastases ne seraient formées que par un sous-clone précis de la tumeur primitive et introduit la notion nouvelle de coopération intercellulaire. Une deuxième approche conerne les cellules tumorales disséminées (DTC) dans la moelle hématopoiétique (micrométastases médullaires) dans une cohorte de plus de 800 patientes présentant un cancer du sein. L'existence des DTC, génétiquement hétérogènes et ne donnant pas obligatoirement lieu à une croissance tumorale secondaire, reste en effet inexpliquée par la théorie prévalente de la « sélection clonale ». En situation adjuvante (n=621), nous rapportons que les DTC ont un impact pronostique fort et indépendant sur la survie sans métastase et la survie globale, mais aussi sur la survie sans récidive loco-régionale. Une analyse complémentaire des récidives loco-régionales suggère que l'existence de DTC est associée à une dissémination ganglionnaire nécessitant un traitement par radiothérapie étendu aux aires ganglionnaires susclaviculaires et mammaires internes. En situation métastatique (n=138), nous montrons que les DTC n'ont plus d'impact pronostique, au contraire des cellules tumorales circulantes. Nous rapportons par ailleurs que l'existence de ces cellules disséminées (et potentiellement dormantes) sont associées à un temps jusqu'à la rechute métastatique plus long, suggérant l'existence d'un processus alternatif à la dissémination/dormance, potentiellement plus rapide. Nos travaux montrent donc les limites de la théorie de la sélection clonale et suggérent l'existence d'une coopération intercellulaire ainsi que de possibles voies alternatives de dissémination micrométastique. Les progrès futurs nécessiteront probablement l'analyse intégrée des différentes étapes du processus métastatique qui sont devenues récemment accessibles : tumeur primitive, cellules tumorales circulantes, DTC et macrométastases finales.

Le gène est défini comme une unité fonctionnelle de l'hérédité. En effet, les gènes, transcrits en ARN, codent pour des protéines qui assurent l'essentiel des fonctions cellulaires. Cependant, les gènes ne représentent que 2% du génome humain. Ainsi, notre génome est presque exclusivement composé d'ADN non codant (ADNnc) qui, en raison d'une absence apparente de fonction (c'est-à-dire de transcription et de traduction), est également connu sous le terme peu élogieux d' « ADN poubelle ». De manière surprenante, la quantité d'ADNnc présente dans les cellules est proportionnelle au degré de complexité des organismes, suggérant ainsi que cet ADNnc pourrait avoir une fonction. En particulier, les centromères et des péricentromères, qui contiennent des séquences d'ADNnc de type satellite, permettent la ségrégation correcte de chromatides sœurs lors de la mitose. De plus des études récentes réalisées chez la levure S.pombe montrent que les régions péricentromériques peuvent être transcrites. Les ARNnc ainsi produits participent à l'établissement et au maintien de l'hétérochromatine péricentromérique. Bien que les mécanismes impliqués dans ces processus soient en grande partie identifiés, très peu de choses sont connues quant à la capacité transcriptionnelle de ces séquences satellites chez d'autres espèces.<br /><br />Ainsi, l'objectif de ma thèse a été d'évaluer le potentiel transcriptionnel des séquences satellites du génome humain.<br /><br />A mon arrivée dans le laboratoire, l'équipe du Pr Claire Vourc'h était particulièrement engagée dans ce projet puisqu'elle venait de mettre en évidence la transcription des séquences satellites 3 du locus 9q12 au cours de la réponse au stress. Mon travail de thèse m'a conduit à approfondir cette étude en identifiant de nouvelles séquences satellites dont la transcription est induite par le stress thermique. Par ailleurs, j'ai développé la première approche trancriptomique dédiée à l'expression des séquences satellites du génome humain : la RepChip. Le modèle de la réponse au stress m'a permis de valider cet outil. Ainsi, j'ai pu identifier non seulement de nouveaux contextes cellulaires permettant l'expression de ces séquences mais également deux mécanismes indépendants impliqués dans leur transcription. En particulier, un lien entre la capacité transcriptionnelle de ces séquences et des modifications de l'épigénome a pu être établi. Finalement, j'ai identifié un modèle d'inhibition de la transcription des séquences satellites au cours du choc thermique, le syndrome ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability and Facial anomalies).

CFTR est un canal chlorure appartenant à la superfamille des transporteurs ABC. Cette protéine est composée de 5 domaines : 2 domaines de liaison aux nucléotides (NBDs), 2 domaines transmembranaires (TMD) et un domaine de régulation. Les interactions entre ces différents domaines sont essentielles pour de nombreux processus, tels que le repliement, la maturation et la fonction de CFTR. Cependant, les rôles de ces domaines de manière individuelle dans la biogenèse, le repliement, la maturation, la fonction et la stabilité membranaire de CFTR restent inconnus.<br />Dans le but de préciser ceux-ci, nous avons étudié le comportement intracellulaire de protéines CFTR génétiquement modifiées. Nos résultats ont confirmé que contrairement à NBD2, NBD1 est essentiel pour la maturation et le trafic de CFTR vers la membrane plasmique. Bien que NBD2 ne soit pas important pour le repliement de la protéine, nous avons montré pour la première fois que celui-ci était nécessaire pour la stabilité de CFTR à la membrane plasmique. Nous avons montré que le 6ème segment transmembranaire de TMD1 n'est pas stable dans la membrane plasmique et doit être important pour le repliement de la protéine, sans doute par son implication dans l'interaction entre les TMDs.<br />L'ensemble de ces résultats confirme aussi l'importance des interactions interdomaines dans le comportement cellulaire de la protéine CFTR.

Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

Le virus de l'hépatite C (VHC) touche 2 à 3% de la population mondiale et la plupart des individus infectés développe une hépatite chronique qui est fortement associée au développement d'un cancer du foie. Bien que les mécanismes de régulation de l'entrée du VHC dans ses cellules cibles, les hépatocytes, soient encore très mal connus, plusieurs protéines de surface cellulaire ont été identifiées comme des facteurs nécessaires à l'entrée virale. Parmi ces protéines, la tétraspanine CD81 est essentielle à l'entrée du VHC. Les membres de la famille des tétraspanines ont la particularité de s'associer entre eux et avec d'autres protéines, appelées partenaires, pour former des complexes multimoléculaires dans des microdomaines appelés microdomaines enrichis en tétraspanines (TEM). Dans notre étude, nous avons analysé le rôle de CD81 et de ses protéines associées dans le mécanisme d'entrée du VHC. En effet, nous avons identifié un nouveau partenaire de CD81, EWI-2wint, qui inhibe l'infection par le VHC, et nous avons analysé le rôle de la fraction de CD81 associée aux TEM dans l'infection par le VHC.<br />Dans un premier temps, nous avons donc montré qu'EWI-2wint, un nouveau partenaire de CD81, est exprimé dans différentes lignées cellulaires mais pas dans les hépatocytes. L'expression ectopique d'EWI-2wint dans des Huh-7, une lignée de cellules hépatiques susceptibles à l'infection par le VHC, bloque l'entrée virale. Nous avons pu montrer que ce blocage se fait par une inhibition de l'interaction entre CD81 et les glycoprotéines d'enveloppe présentes à la surface des particules virales. Notre travail suggère ainsi que l'hépatotropisme du VHC ne serait pas lié uniquement à la présence de facteurs d'entrée spécifiques, mais également à l'absence du facteur inhibiteur EWI-2wint. Ce type de mécanisme de contrôle de l'entrée virale par un inhibiteur cellulaire n'avait jamais été décrit auparavant.<br />En parallèle, nous avons montré que l'entrée du VHC est directement corrélée au niveau d'expression de CD81 dans les cellules hépatocytaires. En utilisant des particules du VHC hautement infectieuses produites en culture cellulaire, nous avons isolé des clones cellulaires indépendants présentant des niveaux d'infection variables. Parmi ces clones, un clone résistant à l'infection avait perdu l'expression de CD81 (cellules Huh-7w7) et l'expression ectopique de la CD81 humaine (hCD81) permet de restaurer la permissivité de ces cellules. De manière intéressante, l'expression ectopique de la CD81 d'origine murine (mCD81) dans les cellules Huh-7w7 restaure également la permissivité au virus, suggérant que la mCD81 dans un contexte cellulaire humain est capable de mimer la hCD81 dans le mécanisme d'entrée du VHC et probablement dans les interactions avec les facteurs cellulaires. Nous avons donc utilisé ces cellules exprimant la mCD81 et des anticorps monoclonaux décrits précédemment, MT81/MT81w, pour analyser le rôle de CD81 associée aux TEM dans l'infection par le VHC. L'anticorps MT81w, qui reconnaît uniquement CD81 associée aux TEM, n'inhibait pas l'infection et la déplétion des cellules en cholestérol, qui inhibe l'infection, n'affectait pas les niveaux de CD81 associée aux TEM. De manière similaire, le traitement des cellules avec la sphingomiélinase, qui réduit l'infection, augmentait les niveaux de CD81 associée aux TEM. En résumé, nous avons montré que l'entrée du VHC dans ses cellules cibles est directement liée au niveau d'expression de CD81 et la sous-population de CD81 associée aux TEM ne participe pas aux étapes initiales du cycle viral du VHC.

La cachexie cancéreuse est caractérisée principalement par une perte de poids progressive qui concerne 30% à 80 % des patients selon le type su cancer. Elle conduit au décès du patient cancéreux dans 20 % des cas. Ce syndrome implique de nombreux troubles métaboliques susceptibles d'altérer le métabolisme énergétique ainsi qu'une fonte des tissus adipeux et musculaires. Le patient cachectique semble présenter un déséquilibre énergétique. Le muscle squelettique représente près de 40 % du poids corporel. Une chute de sa capacité à produire de l'énergie est susceptible de créer un déficit énergétique au niveau du corps entier et une oxydation des réserves de l'organisme en compensation .<br />Nous avaons comparé le métabolisme énergétique de patients cancéreux cachectiques ou non-cachectiques. Nos résultats montrent qu'au repos, malgré un état inflammatoire chronique, les patients cachectiques présentent une dépense énergétique identique à celle de patients cancéreux non-cachectiques. En dépit de la perte de poids des patients cachectiques, les deux groupes étudiés présentent une efficacité et une fonction mitochondriales musculaires similaires. L'analyse transcriptionnelle réalisée grâce à notre puce à ADN (Mitoligo) ne révèle aucune différence d'expression de gènes liés au métabolisme énergétique entre les deux groupes.<br />La perte de poids observée au stade précoce de cachexie cancéreuse que nous avons étudié n'est pas associée à une élévation de la dépense énergétique de repos ou à un déficit énergétique musculaire.

L'accident de Tchernobyl, en 1986, a mis en lumière le cancer de la thyroïde. Ce cancer, assez rare, est pourtant en forte augmentation, et cela avant même 1986. Le diagnostic des tumeurs folliculaires thyroïdiennes par analyses anatomopathologiques est parfois difficile. Ce travail s'intéresse à la classification moléculaire de ces tumeurs ainsi qu'à la recherche de marqueurs spécifiques à chaque pathologie. En regroupant et en analysant le transcriptome de plus de 90% des types de lésions folliculaires de la thyroïde, nous avons établi une classification moléculaire globale de ces lésions, nous avons défini des marqueurs spécifiques faisant l'objet d'un brevet, et nous avons permis de préciser le diagnostic de la majorité des tumeurs de malignité incertaine. L'étude bioinformatique des données issues de biopuces apporte des précisions à la classification internationale des tumeurs, particulièrement pour les tumeurs oncocytaires, microfolliculaires et de malignité incertaine.

Les anomalies moléculaires des tumeurs corticosurrénaliennes sporadiques, bénignes (adénomes corticosurrénaliens ; ACS) ou malignes (carcinomes corticosurrénaliens ; CCS), sont relativement bien caractérisées, tandis que leur implication dans chaque étape du processus de tumorigenèse, de l'initiation à la formation de tumeurs métastatiques, reste très peu connue. Nous ne savons également pas si les CCS et les ACS sont deux entités distinctes ou si les carcinomes font suite aux adénomes dans un processus tumoral multi-étapes. Les altérations les plus fréquemment liées aux CCS sont la mutation de N-Ras (12,5%), la mutation de TP53 (25%), la mutation de ß-caténine (30%) et la surexpression de IGF-2 (90%). Nous avons reproduit ces anomalies en surexprimant une forme oncogénique de Ras, RasG12V, un mutant de ß-caténine, ß-caténineS37A, un dominant négatif de p53, p53DD et la forme sauvage de IGF-2. Grace à un modèle de reconstruction tissulaire in vivo, consistant à transplanter des cellules corticosurrénaliennes bovines (BAC) sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, nous avons entrepris de définir une combinaison minimale d'altérations permettant de transformer des BAC primaires en cellules malignes. Cette étude n'a pas permis de définir de combinaisons impliquant IGF-2 et ß-caténineS37A car, suite à leur transplantation, les BAC surexprimant ces gènes induisaient la formation d'une tumeur murine, masquant les cellules transplantées. Par ailleurs, nous avons montré que la coopération de RasG12V et p53DD induit la transformation complète des BAC primaires, mais selon un ordre précis. En effet, seule la séquence faisant intervenir la surexpression de RasG12V en tant que première altération, suivie de la surexpression de p53DD, permet une transformation maligne. Dans cette séquence, RasG12V seul induit un phénotype hyperplasique et l'ajout de p53DD provoque la progression de l'hyperplasie en CCS. Pour conclure, nous avons identifié la première combinaison d'altérations génétiques à l'origine d'un CCS (expression d'un oncogène et altération d'un gène suppresseur de tumeurs) et apporté un argument en faveur de la progression tumorale corticosurrénalienne multi-étapes. De plus, ce modèle animal pourrait constituer un outil intéressant pour définir des biomarqueurs de la malignité et développer des alternatives thérapeutiques pour le traitement des CCS.

Les plastes sont des organites semi-autonomes qui dérivent d'un événement unique d'endosymbiose entre une cyanobactérie et une cellule eucaryote ancestrale. Le plaste le mieux caractérisé est le chloroplaste des cellules de plantes et d'algues vertes. À la différence des systèmes membranaires eucaryotes qui sont en général riches en phospholipides, les membranes des plastes végétaux se composent à plus de 70% de galactoglycérolipides (monogalactosyldiacylglycérol, MGDG ; digalactosyldiacylglycérol, DGDG). Leur synthèse est assurée par des galactosyltransférases, les MGDG synthases (EC 2.4.1.46) et les DGDG synthases (EC 2.4.1.241) localisées dans les membranes de l'enveloppe qui limitent l'organite. Chez les plantes, les galactolipides sont essentiels pour la biogenèse des plastes mais aussi à la synthèse de membranes extraplastidiales sous certaines conditions physiologiques telles qu'en carence de phosphate.La plupart des parasites Apicomplexes (protozoaires parasites à mode de vie intracellulaire) possèdent une structure plastidiale, non photosynthétique, contenant un ADN circulaire. Cet organite, baptisé apicoplaste, a pour origine phylogénétique une endosymbiose secondaire entre deux eucaryotes, avec ingestion d'une algue rouge unicellulaire par un protozoaire ancestral, suivie d'une disparition de la plupart des structures subcellulaires de l'algue. Des protéines codées par des gènes nucléaires sont importées dans l'apicoplaste et impliquées dans des voies métaboliques typiques des plantes telles que la biosynthèse d'acides gras par le système FASII.Des lipides aux propriétés chromatographiques proches de celles du MGDG et du DGDG ont pu être détectés dans des extraits de Plasmodium falciparum et Toxoplasma gondii, suggérant l'existence d'une voie de biosynthèse des galactolipides comparable à celle existant dans le chloroplaste. Au moyen d'une série d'anticorps dirigés contre le DGDG, un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser la localisation d'un épitope de structure proche du digalactolipide chloroplastique (DGLE pour digalactolipid-like epitope) chez P. falciparum et déterminer l'évolution de la distribution subcellulaire de cet épitope au cours du cycle cellulaire du parasite. Ces études suggèrent qu'un lipide de structure proche du DGDG est associé à des systèmes membranaires en périphérie de la cellule, en particulier le complexe membranaire interne. Des parasites transgéniques exprimant une MGDG synthase exogène de plante ont été générés. L'accumulation remarquable à la fois de MGDG et de DGDG chez ces transformants démontre d'une part que l'enzyme de plante est fonctionnelle, catalysant la synthèse de MGDG, et d'autre part qu'une glycosyltransférase de P. falciparum est capable ensuite de catalyser de grandes quantités de DGDG. Le rôle possible de cette glycosyltransférase dans la synthèse du DGDG reste à établir. Un second objectif de cette thèse était d'évaluer le potentiel dans P. falciparum de composés inhibant la synthèse des galactolipides de plante dans une visée thérapeutique. Un criblage à haut débit robotisé d'une banque de 24.000 molécules nous a permis d'identifier des inhibiteurs de la MGDG synthase 1 d'Arabidopsis thaliana, parmi lesquels deux composés présentent un effet inhibiteur mesuré par une CI50 de l'ordre 10 µM sur l'activité MGDG synthase. Nous avons pu caractériser l'effet de ces molécules comme compétiteurs de la fixation du diacylglycérol. Une activité inhibitrice de la prolifération de P. falciparum a pu être mesurée in vitro bien qu'aucune enzyme homologue à la MGDG synthase n'ait pu être identifiée in silico sur les banques de données relatives aux Apicomplexes. Une diversification de la structure du châssis moléculaire a été conduite afin d'améliorer 1) l'effet herbicide et 2) l'inhibition de la croissance des parasites et de développer ainsi de nouvelles molécules antipaludiques, qui puissent être qualifiées de médicaments herbicides. L'étude de 250 analogues a permis de progresser de façon substantielle dans le sens d'une meilleure sélectivité avec des composés actifs à 200 nM.Il n'est pas exclu que les molécules sélectionnées pour leur capacité à inhiber une activité MGDG synthase exercent, chez P. falciparum, un effet sur une autre cible. Nous avons conduit une expérience visant à isoler la(les) protéine(s) cible(s) des molécules bioactives par chromatographie d'affinité, puis identifié ces protéines après digestion trypsique par spectrométrie de masse. Une perspective de ce travail consiste à caractériser certaines de ces cibles candidates.Le développement de candidats-médicaments est un processus long selon le schéma classique, depuis la validation d'une cible jusqu'aux essais cliniques. La nouvelle classe de compétiteurs du diacylglycérol caractérisée dans ce travail de thèse présente des propriétés intéressantes dans une visée thérapeutique, qu'il sera important d'optimiser dans l'avenir.

L'hormonothérapie permet une régression du cancer de la prostate métastatique par apoptose des cellules tumorales. L'évolution inéluctable de la maladie vers un stade hormono-indépendant et apoptose-résistant souligne l'importance de l'étude des gènes androgéno-sensibles impliqués dans l'apoptose de la prostate normale et pathologique, tels que le ligand TRAIL et ses récepteurs DR4 et DR5 pro et, DcR1 et DcR2 anti-apoptotiques.<br />Nous rapportons une corrélation entre la régulation du récepteur DcR2, le statut hormonal et l'apoptose dans la prostate de rat et dans la lignée humaine hormonosensible de cancer prostatique, LNCaP. Nous montrons que l'expression de DcR2 joue un rôle régulateur de l'apoptose TRAIL-induite dans la cellule LNCaP. Enfin, dans un modèle de cancer prostatique humain hormonosensible greffé chez la souris nude traitée par un anti-androgène nous montrons l'expression des récepteurs au TRAIL, et de certains gènes renseignant sur la relation entre croissance tumorale et statut hormonal.