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Biosynthèse des galactolipides de plantes : étude structurale et fonctionnelle de la MGDG synthase 1 (MGD1) d'Arabidopsis thaliana / Biosynthesis of plant galactolipids : structural and functional study of the MGDG synthase 1 ( MGD1 ) ArabidopsisNitenberg, Milène 26 November 2018 (has links)
Les membranes des chloroplastes sont riches en monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) et digalactosyldiacylglycérol (DGDG), deux galactolipides essentiels pour la biogenèse de ces organites et le fonctionnement de la machinerie photosynthétique. MGD1 est la galactolipide synthase majeure chez Arabidopsis thaliana. C’est une protéine monotopique, localisée dans l’enveloppe interne des membranes des chloroplastes, qui transfère un résidu galactose à partir d’UDP-galactose sur le diacylglycérol (DAG) pour former le MGDG. MGD1 a besoin de lipides anioniques tels que le phosphatidylglycérol (PG) pour être active, mais le mécanisme d’activation reste à ce jour inconnu. Des études antérieures ont permis d’identifier le résidu P189 comme étant potentiellement impliqué dans la liaison au PG, et le résidu H155 comme base catalytique potentielle. Le but de ma thèse a été d’obtenir plus d’informations sur le mécanisme de régulation de la MGD1, enzyme clé de la biogenèse des chloroplastes. Mon étude s’est portée sur la protéine native MGD1 et deux de ses mutants, H155A et P189A. Ces protéines ont été exprimées chez Escherichia coli et purifiées jusqu’à homogénéité. Une nouvelle méthode de dosage de l’activité MGDG synthase, adaptée de la technique de bioluminescence UDP-GloTM de Promega, a été mise au point. Cette méthode présente de nombreux avantages en termes de rapidité et de sensibilité comparée à la technique classiquement utilisée qui nécessite l’utilisation d’un UDP-Galactose radiomarqué. L’étude des propriétés d’association de MGD1 et des mutants à des membranes modèles, à l’aide de la technique des monocouches de Langmuir, a permis de proposer un mécanisme réactionnel inédit, impliquant une dyade catalytique de type PG-His, qui permet d’expliquer le rôle d’activateur du PG. Un nouveau test d’activité, basé sur cette même technique de Langmuir, qui présente l’avantage de pouvoir discriminer la capacité de liaison de MGD1 à la membrane et sa capacité à transférer un galactose sur son accepteur DAG a été mis en place. Il s’agit du premier exemple de synthèse d’un galactolipide sur une membrane biomimétique constituée d’un mélange DAG-PG. / The membranes of chloroplasts are enriched in monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), two essential galactolipids to the biogenesis of these organelles and the functioning of photosynthetic machinery. MGD1 is the major galactolipid synthase in Arabidopsis thaliana. It is a monotopic protein, located in the inner envelope of chloroplast membranes, which transfers a galactosyl residue from UDP-galactose to diacylglycerol (DAG) to form MGDG. MGD1 needs anionic lipids such as phosphatidylglycerol (PG) to be active, but the activation mechanism is still unknown. Previous studies identified the P189 residue as potentially involved in PG binding, and H155 as the putative catalytic base. The aim of my thesis was to progress in our understanding of the regulation of MGD1 activity, a key enzyme in the biogenesis of chloroplasts. My study focused on the native protein MGD1 and two mutants, H155A and P189A. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. A new method for assaying MGDG synthase activity, adapted from the Promega UDP-GloTM bioluminescent technique has been developed. This method has many advantages in terms of speed and sensitivity compared to the conventionally used technique which requires the use of a radiolabeled UDP-Galactose. Furthermore, the study of the association properties of MGD1 and mutants with model membranes, using the Langmuir monolayer technique, led us to propose a novel reaction mechanism, involving a PG-His type catalytic dyad, which may explain the role of PG as activator. A new activity test, based on the Langmuir technique, which has the advantage to discriminate the MGD1 binding capacity to the membrane and its ability to transfer a galactose to its acceptor DAG has been set up. This is the first example of galactolipid synthesis on a biomimetic membrane formed of a DAG-PG mixture.
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Etude du mécanisme catalytique de la lipoxygenase 1 d’olive / Study of the catalytic mechanism of lipoxygenase 1 OliveAlberti, Jean-Christophe 13 December 2013 (has links)
Les lipoxygénases (LOX, EC 1.13.11.12) sont des dioxygénases à fer non héminique très répandues. Chez les végétaux, ces enzymes sont à l’origine d’une voie métabolique impliquée dans de nombreux processus physiologiques, mais aussi dans la réponse à un stress environnemental. La LOX initie la voie en catalysant l’incorporation régiospécifique et stéréospécifique de dioxygène sur le système pentadiénique d’un acide gras libre polyinsaturé (préférentiellement l’acide linoléique ou l’acide linolénique) pour générer un hydroperoxyde d’acide gras.Une lipoxygénase d’olive appelée LOX1, clonée au laboratoire, a été exprimée chez E. coli et purifiée. Elle produit à partir d’acide linoléique des hydroperoxydes de configuration 9S et 13R dans des proportions 2:1. Elle est la seule lipoxygénase végétale décrite à ce jour produisant des hydroperoxydes de configuration R. Les modèles proposés pour expliquer le contrôle de la spécificité réactionnelle des LOX ne s’appliquent pas à la LOX1 d’olive. Afin de mieux comprendre son mécanisme de fonctionnement, un modèle tridimensionnel de la LOX1 d’olive a été construit. La modification par mutagénèse dirigée de deux résidus particuliers, la phénylalanine 277 et la tyrosine 280, a permis d’identifier l’entrée du site actif de la LOX1 d’olive. D’autres résidus particuliers ont été modifiés par mutagénèse dirigée afin d’étudier leur rôle dans le mécanisme catalytique et le contrôle de la spécificité réactionnelle de la LOX1 d’olive. L’analyse globale des résultats obtenus a permis de proposer une première hypothèse quant au fonctionnement de cette enzyme : le substrat pénètrerait dans le site actif de la LOX1 d’olive par son extrémité carboxylate, et serait stabilisé dans le site actif par plusieurs résidus hydrophobes. Un canal pourrait cibler l’oxygène dans le site actif par l’intermédiaire du résidu L579 sur le système pentadiénique du substrat, contrôlant de cette manière la spécificité réactionnelle de la LOX1 d’olive.Par ailleurs, des oxylipines retrouvées chez Arabidopsis, appelées arabidopsides, pourraient être formées par action directe d’une 13-LOX sur des acides gras estérifiés des galactolipides. L’action de la 13-LOX1 de soja, la 9/13-LOX1 d’olive et la 9-LOX de pomme de terre a été testée avec des galactolipides. Une faible activité a été mesurée avec la 13-LOX1 de soja et la 9/13-LOX1 d’olive. Une activité plus importante a été mesurée avec la 9-LOX de pomme de terre. Ces résultats suggèrent que l’action des LOX est possible sur des acides gras estérifiés des galactolipides. / Lipoxygenases (LOXs, EC 1.13.11.12) are widespread dioxygenases containing a non heminic iron atom. In plants, LOXs are at the beginning of a metabolic pathway involved in several physiological processes and in the response to environmental stress. A LOX initiates the pathway, catalyzing a regiospecific and stereospecific insertion of oxygen on the pentadiene system of a free polyunsaturated fatty acid (linoleic or linolenic acid) to form fatty acid hydroperoxides.An olive lipoxygenase called olive LOX1, cloned at laboratory, has been expressed in E. coli strain and purified. Olive LOX1 produces 9S-hydroperoxides of and 13R-hydroperoxides from linoleic acid, in a ratio of 2:1, being the only plant LOX to produce R-hydroperoxides described to date. From the currently known models explaining the control of reactional specificity, none can be applied to olive LOX1. A three-dimensional model has been built by homology modeling to understand the catalytic mechanism of olive LOX1. Site-directed mutagenesis experiments have been used to modify two residues of particular interest, the phenylalanine 277 and the tyrosine 280, allowing us to point the active site entrance near these two residues. Other residues of interest have been modified to study their role in the catalytic mechanism and the reactional specificity of olive LOX1. The results have led us to propose a first hypothesis for the reactional mechanism of this enzyme: the substrate could enter into the active site with its carboxylate-end first, and could be stabilized in the active site by hydrophobic side chains of several residues. A channel could bring oxygen into the active site at a position near the side chain of the leucine 579 residue, this one targeting oxygen onto the pentadiene system of the substrate, controlling by this way the reactional specificity of olive LOX1.LOX are involved in oxylipins synthesis. Arabidopsides are a class of oxylipins found in Arabidopsis that could be produced by action of a 13-LOX on galactolipids, which carry esterified fatty acids. Activity of soybean 13-LOX, olive 9/13-LOX1 and potato 9-LOX has been investigated with galactolipids. A low activity was measured when soybean and olive LOXs were used. Activity was far more important when potato LOX was used. These results suggest that LOX can act on esterified fatty acids, especially galactolipids.
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Etude exploratoire de la synthèse des galactolipides chez Plasmodium falciparumSaidani, Nadia 05 September 2008 (has links) (PDF)
Les plastes sont des organites semi-autonomes qui dérivent d'un événement unique d'endosymbiose entre une cyanobactérie et une cellule eucaryote ancestrale. Le plaste le mieux caractérisé est le chloroplaste des cellules de plantes et d'algues vertes. À la différence des systèmes membranaires eucaryotes qui sont en général riches en phospholipides, les membranes des plastes végétaux se composent à plus de 70% de galactoglycérolipides (monogalactosyldiacylglycérol, MGDG ; digalactosyldiacylglycérol, DGDG). Leur synthèse est assurée par des galactosyltransférases, les MGDG synthases (EC 2.4.1.46) et les DGDG synthases (EC 2.4.1.241) localisées dans les membranes de l'enveloppe qui limitent l'organite. Chez les plantes, les galactolipides sont essentiels pour la biogenèse des plastes mais aussi à la synthèse de membranes extraplastidiales sous certaines conditions physiologiques telles qu'en carence de phosphate.La plupart des parasites Apicomplexes (protozoaires parasites à mode de vie intracellulaire) possèdent une structure plastidiale, non photosynthétique, contenant un ADN circulaire. Cet organite, baptisé apicoplaste, a pour origine phylogénétique une endosymbiose secondaire entre deux eucaryotes, avec ingestion d'une algue rouge unicellulaire par un protozoaire ancestral, suivie d'une disparition de la plupart des structures subcellulaires de l'algue. Des protéines codées par des gènes nucléaires sont importées dans l'apicoplaste et impliquées dans des voies métaboliques typiques des plantes telles que la biosynthèse d'acides gras par le système FASII.Des lipides aux propriétés chromatographiques proches de celles du MGDG et du DGDG ont pu être détectés dans des extraits de Plasmodium falciparum et Toxoplasma gondii, suggérant l'existence d'une voie de biosynthèse des galactolipides comparable à celle existant dans le chloroplaste. Au moyen d'une série d'anticorps dirigés contre le DGDG, un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser la localisation d'un épitope de structure proche du digalactolipide chloroplastique (DGLE pour digalactolipid-like epitope) chez P. falciparum et déterminer l'évolution de la distribution subcellulaire de cet épitope au cours du cycle cellulaire du parasite. Ces études suggèrent qu'un lipide de structure proche du DGDG est associé à des systèmes membranaires en périphérie de la cellule, en particulier le complexe membranaire interne. Des parasites transgéniques exprimant une MGDG synthase exogène de plante ont été générés. L'accumulation remarquable à la fois de MGDG et de DGDG chez ces transformants démontre d'une part que l'enzyme de plante est fonctionnelle, catalysant la synthèse de MGDG, et d'autre part qu'une glycosyltransférase de P. falciparum est capable ensuite de catalyser de grandes quantités de DGDG. Le rôle possible de cette glycosyltransférase dans la synthèse du DGDG reste à établir. Un second objectif de cette thèse était d'évaluer le potentiel dans P. falciparum de composés inhibant la synthèse des galactolipides de plante dans une visée thérapeutique. Un criblage à haut débit robotisé d'une banque de 24.000 molécules nous a permis d'identifier des inhibiteurs de la MGDG synthase 1 d'Arabidopsis thaliana, parmi lesquels deux composés présentent un effet inhibiteur mesuré par une CI50 de l'ordre 10 µM sur l'activité MGDG synthase. Nous avons pu caractériser l'effet de ces molécules comme compétiteurs de la fixation du diacylglycérol. Une activité inhibitrice de la prolifération de P. falciparum a pu être mesurée in vitro bien qu'aucune enzyme homologue à la MGDG synthase n'ait pu être identifiée in silico sur les banques de données relatives aux Apicomplexes. Une diversification de la structure du châssis moléculaire a été conduite afin d'améliorer 1) l'effet herbicide et 2) l'inhibition de la croissance des parasites et de développer ainsi de nouvelles molécules antipaludiques, qui puissent être qualifiées de médicaments herbicides. L'étude de 250 analogues a permis de progresser de façon substantielle dans le sens d'une meilleure sélectivité avec des composés actifs à 200 nM.Il n'est pas exclu que les molécules sélectionnées pour leur capacité à inhiber une activité MGDG synthase exercent, chez P. falciparum, un effet sur une autre cible. Nous avons conduit une expérience visant à isoler la(les) protéine(s) cible(s) des molécules bioactives par chromatographie d'affinité, puis identifié ces protéines après digestion trypsique par spectrométrie de masse. Une perspective de ce travail consiste à caractériser certaines de ces cibles candidates.Le développement de candidats-médicaments est un processus long selon le schéma classique, depuis la validation d'une cible jusqu'aux essais cliniques. La nouvelle classe de compétiteurs du diacylglycérol caractérisée dans ce travail de thèse présente des propriétés intéressantes dans une visée thérapeutique, qu'il sera important d'optimiser dans l'avenir.
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ETUDES STRUCTURALES, CELLULAIRES ET PHARMACOLOGIQUES DE LA SYNTHESE DES GALACTOLIPIDES CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA ET TOXOPLASMA GONDIIBotte, Cyrille 20 December 2007 (has links) (PDF)
Les galactoglycérolipides (i.e. monogalactosyldiacylglycérol, MGDG et digalactosyldiacylglycérol, DGDG) sont les lipides majeurs des membranes des chloroplastes, représentant jusqu'à 80% de la composition membranaire plastidiale. La synthèse de ces galactolipides est catalysée par deux types de galactosyltransférases, les MGDG synthases (ou MGD) et les DGDG synthases (ou DGD). Lors de cette synthèse, un groupement ß-galactosyl provenant d'un UDP- aGal, est transféré sur la position sn-3 d'un diacylglycérol (DAG). Les DGD utilisent le MGDG produit par les MGD comme substrat pour la synthèse du DGDG. La synthèse du MGDG est donc essentielle pour la biogenèse du chloroplaste et par conséquent pour la survie de la cellule végétale. Les Apicomplexes sont des parasites intracellulaires obligatoires d'importance médicale et vétérinaire. Ils possèdent un plaste vestigial non-photosynthétique, nommé apicoplaste, acquis par endosymbiose secondaire d'une algue rouge. L'apicoplaste est impliqué dans de nombreuses voies métaboliques de type végétal. De plus, il est essentiel à la survie du parasite. La synthèse de galactolipides aux propriétés chromatographiques indiscernables de celles du MGDG et du DGDG a été mesurée chez Toxoplasma gondii, le parasite Apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Nous avons entrepris une étude comparative du métabolisme et de la dynamique des galactolipides chez les plantes et des lipides structurellement apparenté chez les parasites Apicomplexes, par des analyses de biochimie, biologie structurale, moléculaire et cellulaire chez A. thaliana et T. gondii. Nous avons tout d'abord établi un modèle structural de la MGDG synthase chloroplastique basée sur son homologie avec la glycosyltransférase bactérienne MURG. Ce modèle structural a été validé par mutations ponctuelles rationalisées. Ce modèle indique les résidus impliqués dans la liaison de l'UDP-Gal et permet d'avancer dans notre compréhension du mécanisme catalytique. Il permet de proposer certaines régions comme participant à la fixation du DAG et à l'association à la membrane du chloroplaste. La structure présentée dans ce manuscrit constitue un outil pour l'étude d'inhibiteurs de la MGDG synthase et la compréhension de l'évolution complexe des enzymes de galactosylation. Nous avons montré que des inhibiteurs des MGDG synthases de plantes, identifiés par criblage pharmacologique d'une chimiothèque de 23360 composés, avaient des propriétés herbicides, algicides et anti-parasitaire sur A. thaliana, C. reinhartdii et T. gondii respectivement. Nous avons par la suite engagé un programme d'optimisation par synthèse chimique et mesuré les effets de plus de 200 dérivés des molécules initiales. Cette stratégie nous a permis d'optimiser certaines de ces molécules dans l'objectif de développer des candidats herbicides/médicaments. Grâce à l'utilisation de serums de lapin et de rat obtenus après immunisation avec du DGDG, nous avons détecté chez T. gondii un lipide, désigné DGLE (digalactolipid-like epitope), structuralement apparenté au digalactolipide. Ce lipide est localisé au niveau des membranes de la pellicule du parasite. De plus, la localisation du DGLE dépend du stade de vie du parasite, redistribué lors de l'invasion dans une cellule hôte. Le DGLE semble lié aux protéines associées au cytosquelette d'actine et/ou à des domaines membranaires. La détermination du lipidome de la pellicule par spectrométrie de masse montre que des dihexosyl-lipides mineurs dérivés de diacylglycérol, alkyl-acyl ou de céramide ont une masse compatible avec le DGLE. La question de la structure du DGLE, pour sa partie hydrophobe, reste donc irrésolue. Ce lipide a été détecté chez d'autres Apicomplexes tels que Plasmodium falciparum (agent de la malaria) et Cryptosporidium parvum (agent de la cryptosporidiose). Le fait d'avoir pu induire une réponse immunitaire par injection du DGDG chez le lapin et le rat conduisant à la détection d'un épitope à la surface de T. gondii, nous a amené à étudier l'antigène digalactolipidique et ses applications éventuelles dans des visées diagnostiques et / ou thérapeutiques. Nous avons montré que le serum provoquait l'agglutination du parasite et empêchait son invasion dans la cellule hôte in vitro. Le marquage de la surface du parasite par le serum (i.e. l'opsonisation) active la réponse immunitaire inné in vitro. La phagocytose par les macrophages et l'activation du complément est accrue par rapport au contrôle. Ces résultats préliminaires suggèrent que des outils diagnostics et/ou des stratégies vaccinales nouveaux, basés sur la reconnaissance de l'antigène digalactolipidique de surface des parasites Apicomplexes, pourraient être envisagés. Les perspectives de ces travaux incluent une poursuite du développement des inhibiteurs des MGDG synthases pour d'une part des recherches fondamentales par des approches de génétique chimique (invalidation chimique, utilisation de dérivés couplés à la biotine), et d'autre part des applications éventuelles en tant que candidat herbicides et / ou antiparasitaires. L'étude du rôle et de la synthèse des galactolipides chez T. gondii nécessitera la résolution de la structure du DGLE et la recherche des enzymes impliquées dans sa synthèse. Les effets remarquables du serum anti- DGDG mesuré in vitro devront être approfondis sur modèle animal.
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Analyse de l'homéostasie des lipides membranaires d'Arabidopsis thaliana par une stratégie de génétique chimique exploitant une nouvelle classe d'analogues du diacylglycérolBoudière, Laurence 20 December 2013 (has links) (PDF)
Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante.
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Analyse de l'homéostasie des lipides membranaires d'Arabidopsis thaliana par une stratégie de génétique chimique exploitant une nouvelle classe d'analogues du diacylglycérol / Analysis of membrane glycerolipid metabolism in Arabidopsis based on a chemical genetic strategy using inhibitors of galactolipid biosynthesisBoudière, Laurence 20 December 2013 (has links)
Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante. / MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol) are the most abundant membrane lipids of the chloroplast. They are synthesized exclusively in the chloroplast envelope by the action of MGDG synthases (MGD1, MGD2 and MGD3) and DGDG synthases (DGD1 and DGD2). Galactolipids are known to be essential for the structure (and function) of the photosystems and for the biogenesis of thylakoids. In phosphate deprivation, galactolipids become a source of lipid for other cell membranes, outside the chloroplast. Based on a high throughput chemical screen, a new molecule called galvestine-1 has been identified and characterized as an inhibitor of MGDG synthases. Galvestine-1 competes with the binding of the diacylglycerol substrate to MGDs. This molecular tool can be used to disturb the system comprising all lipid biosynthesis reactions, conversions, and lipid trafficking, responsible for the membrane lipid steady state observed at the whole cell level, or membrane lipid homeostasis. Perturbation of the system occurs at the level of MGDG synthases. The aim of this thesis is to use the effect of galvestine-1 to identify new actors or new pathways involved in the control of lipid homeostasis in plant cells. To this purpose, I designed and performed a screening of a collection of EMS (ethyl methanesulfonate) mutants, in order to isolate galvestine-1-resistant mutants and to identify mutated genes conferring this resistance. Transcriptomic data (Affymetrix genome array genechip, ATH1) of Arabidopsis thaliana treated in the presence of galvestine-1 had been obtained prior to the PhD project. These data were used to identify genes whose expression varied and possibly involved in lipid homeostasis. Based on a complementary candidate gene approach, I focused on Ala10, a putative flippase, which gene is over-expressed after treatment with galvestine-1 and following phosphate deprivation. The purpose of this second part of this thesis is to understand the relationship between the expression of ALA10 and genes involved in galactolipid synthesis in plants.
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