La Phostine (PSN ; PHOSphate STarvation response INductor) est une petite molécule organique de synthèse, identifiée dans une chimiothèque par son effet inducteur de l’expression du gène PHT1;4 codant un transporteur de phosphate chez Arabidopsis thaliana. Au cours de cette thèse, j’ai caractérisé l’effet de la PSN chez Arabidopsis et montré que cette drogue induit plusieurs réponses typiques de la carence en phosphate : expression de gènes régulés localement ou à longue distance, accumulation d’anthocyanes et d’amidon, activité des phosphatases acides, inhibition de la croissance des racines. De plus, la PSN provoque une accumulation de phosphate soluble dans les racines.L’étude d’analogues structuraux de la PSN m’a permis d’identifier un motif commun (#10) nécessaire à son activité biologique. Il apparaît que la PSN et ses analogues actifs sont instables à pH acide, ce qui libère le motif #10. Nous montrons que le motif #10 pénètre dans la plante essentiellement par les racines et qu’il ne circule pas des racines vers les feuilles, et faiblement des feuilles vers les racines. L’accumulation de #10 dans les racines expliquerait l’ensemble des effets observés de la PSN et de ses analogues actifs. Nous avons isolé un mutant d’Arabidopsis dont la croissance racinaire résiste à la PSN. Chez ce mutant, la PSN ne provoque plus l’accumulation d’anthocyanes et d’amidon dans les feuilles, ni celle de phosphate dans les racines. En absence de PSN, et sur un milieu de culture partiellement appauvri en phosphate, les feuilles et les racines de ce mutant accumulent plus de phosphate que celles du type sauvage. Chez les plantes, l’homéostasie du phosphate est soumise à une régulation complexe, la caractérisation approfondie de ce mutant apportera de nouveaux éléments pour sa compréhension. / The Phostin (PSN ; PHOSphate STarvation response INductor) is a small organic synthetic molecule identified in a chemical library by its induction effect on PHT1;4 expression, a gene encoding a phosphate transporter in Arabidopsis thaliana. During my PhD, I characterized the effects of PSN in Arabidopsis and shown that this drug induces several phosphate starvation responses: expression of locally or systemically regulated genes, anthocyanin and starch accumulation, acid phosphatase activity, primary root growth inhibition. Moreover, PSN induces inorganic soluble phosphate accumulation in roots.Thanks to PSN’s structural analogues, we identified a common motif (motif #10) necessary to its biological activity. PSN and its analogues are unstable in acidic conditions, leading to the release of #10 motif. We have shown that #10 motif enters the plant mostly by the roots and do not circulate from roots to shoots, and weakly from shoots to roots. The accumulation of #10 motif in the roots explains all the PSN and analogues observed effects. We characterized an Arabidopsis mutant resistant to PSN for its root growth. In this mutant, PSN does not induce anthocyanin or starch accumulation in leaves, neither phosphate in roots. When growing without PSN, on partially phosphate depleted medium, the mutant presents higher phosphate content than the wild type. Phosphate homeostasis is a very complex process in plant, the deep characterization of this mutant will bring new elements for the comprehension of this pathway.

Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante.

Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante. / MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol) are the most abundant membrane lipids of the chloroplast. They are synthesized exclusively in the chloroplast envelope by the action of MGDG synthases (MGD1, MGD2 and MGD3) and DGDG synthases (DGD1 and DGD2). Galactolipids are known to be essential for the structure (and function) of the photosystems and for the biogenesis of thylakoids. In phosphate deprivation, galactolipids become a source of lipid for other cell membranes, outside the chloroplast. Based on a high throughput chemical screen, a new molecule called galvestine-1 has been identified and characterized as an inhibitor of MGDG synthases. Galvestine-1 competes with the binding of the diacylglycerol substrate to MGDs. This molecular tool can be used to disturb the system comprising all lipid biosynthesis reactions, conversions, and lipid trafficking, responsible for the membrane lipid steady state observed at the whole cell level, or membrane lipid homeostasis. Perturbation of the system occurs at the level of MGDG synthases. The aim of this thesis is to use the effect of galvestine-1 to identify new actors or new pathways involved in the control of lipid homeostasis in plant cells. To this purpose, I designed and performed a screening of a collection of EMS (ethyl methanesulfonate) mutants, in order to isolate galvestine-1-resistant mutants and to identify mutated genes conferring this resistance. Transcriptomic data (Affymetrix genome array genechip, ATH1) of Arabidopsis thaliana treated in the presence of galvestine-1 had been obtained prior to the PhD project. These data were used to identify genes whose expression varied and possibly involved in lipid homeostasis. Based on a complementary candidate gene approach, I focused on Ala10, a putative flippase, which gene is over-expressed after treatment with galvestine-1 and following phosphate deprivation. The purpose of this second part of this thesis is to understand the relationship between the expression of ALA10 and genes involved in galactolipid synthesis in plants.

Au cours de la reproduction sexuée chez les plantes supérieures, les grains de pollen adhérent aux stigmates, se réhydratent et produisent des tubes polliniques qui se développent à travers le tissu de transmission femelle afin d’assurer la fécondation. Les tubes polliniques sont des cellules dont la croissance est rapide et polarisée à l’apex du tube. Ils représentent de bons modèles pour étudier la dynamique de la croissance cellulaire. Les tubes polliniques sont aussi capables de percevoir des signaux de guidage et d’adhérer à la matrice extracellulaire du tissu femelle. Afin de comprendre le mécanisme cellulaire de la croissance et de l'adhésion du tube pollinique, deux approches différentes ont été utilisées. Premièrement, un criblage de 258 molécules a permis d’isoler deux composés qui perturbent in vitro la croissance des tubes polliniques de tabac, de tomate et d' Arabidopsis thaliana. Les effets d’un inhibiteur des monogalactosyldiacylglycérol synthases, la galvestine-1, ont également été étudiés sur la croissance des tubes. Nous avons montré que ces trois composés réduisent la longueur du tube pollinique et induisent des phénotypes anormaux de façon dose-dépendante. La germination du pollen était réduite avec les deux composés isolés du criblage. Ils ont également affecté la distribution des polymères de la paroi des tubes polliniques. Les composés ont perturbé la production de ROS, ont désorganisé la dynamique des filaments d'actine et de la protéine RIC4 suggérant qu'ils pourraient perturber le trafic de vésicules à l'extrémité du tube pollinique. Dans un second temps, nous avons mis au point une approche de déconstruction enzymatique d’une matrice enrichie en polysaccharides afin d’étudier les phénomènes d’adhésion in vitro des tubes polliniques. Ce test a été développé sur des plaques 96 puits pour les tubes polliniques d'A. thaliana, en utilisant différents extraits de parois cellulaires de fleurs et de feuilles d'A. thaliana comme matrice ou des pectines commerciales de citron avec différents degrés de méthylestérification. Les traitements avec une polygalacturonase et une endo-galactanase des pectines commerciales et de l'extrait de paroi cellulaire de feuilles ont totalement ou partiellement perturbé l'adhésion des tubes polliniques. Ces résultats montrent que les tubes polliniques d’A. thaliana sont capables d'adhérer à des pectines d'origines diverses (espèces et organes) et suggèrent que les chaînes d’homogalacturonanes, les chaînes latérales du rhamnogalacturonane-I, en particulier les galactanes, avec un poids moléculaire minimum seraient nécessaires à l'adhésion des tubes polliniques. / During plant sexual reproduction pollen grains land on the stigma, rehydrate and produce pollen tubes that grow through the female transmitting-tract tissue to assure a proper fertilization. Pollen tubes are fast tip-growing cells and represent a good model to study growth dynamics. Pollen tubes are able to perceive female guidance signals and to adhere to the extracellular matrix of the female transmitting tract. In order to improve our knowledge on the cell mechanisms implicated during pollen tube growth and adhesion, two different approaches have been used. First, 258 compounds were screened and two small compounds were isolated. They disrupted in vitro pollen tube growth of tobacco, tomato and Arabidopsis thaliana. The effects of an inhibitor of monogalactosyldiacylglycerol synthases, galvestine-1, on pollen tube growth were also studied. We showed that these 3 compounds reduced pollen tube length and induced abnormal phenotypes in a dose dependent manner. Pollen germination was significantly reduced with the two compounds isolated from the screen. They also affected cell wall material arrangement in pollen tube cell wall. The compounds modified ROS production and were able to disorganized actin filaments as well as the dynamic changes of the protein RIC4 suggesting that they might perturb vesicle trafficking at the pollen tube tip. Secondly, using a plant-made adhesion matrix in 96 –well plates, we studied the in vitro adhesion of A. thaliana pollen tubes. Different cell wall extracts from A. thaliana flowers and leaves or commercial lemon pectins with different degree of methylesterification were tested and the adhesive fractions were deconstructed by enzymatic treatments. Polygalacturonase or endo-galactanase treatments of commercial pectins and pectin-enriched cell wall extracts totally or partially disrupted pollen tube adhesion. Our results pointed out that A. thaliana pollen tubes are capable of adhering on pectins from diverse origins (species and organs) and suggested that homogalacturonan, the side chains of rhamnogalacturonana-I, especially galactans, as well as a minimum molecular weight may be necessary for pollen tube adhesion.

Le développement d'une médecine personnalisée nécessite la mise au point de sondes permettant la détection des marqueurs d'une pathologie au stade le plus précoce possible. Ce mémoire décrit la synthèse et l'évaluation de sondes ciblées permettant de réaliser des images en IRM ou en scintigraphie. Ces sondes sont construites par fonctionnalisation d'un châssis moléculaire préparé par une réaction à trois composants. La propargylamine résultante possède plusieurs points d'ancrage pour introduire les ligands destinés au ciblage et deux groupes chélatants pour l'imagerie. Ce châssis possède aussi en position terminale un groupement réactif pour le fixer sur des petites molécules polyfonctionnelles, des dendrimères ou des protéines. Une technique de criblage à flux rapide, basée sur l'utilisation des puces à petites molécules, a été utilisée pour la détection des ligands. Les molécules déposées sur la puce proviennent soit des C-glycosides complexes préparés selon le concept de la synthèse orientée vers la diversité, soit de la chimiothèque du laboratoire. Ces puces ont permis l'identification de ligands de plusieurs protéines comme la protéine VPR de la capside du virus du sida. Un criblage secondaire par RMN a confirmé l'interaction protéine-petite molécule. Les sondes portant un flavonoïde pour cibler les cellules tumorales de l'endothélium ont été traitées par une solution de sel de gadolinium puis leurs propriétés ont été évaluées par IRM. Les premiers résultats indiquent que ces composés offrent un contraste de 2 à 4 fois supérieurs aux agents de contraste usuellement utilisés. Leur évaluation biologique sera réalisée prochainement.

Dans l'introduction, diverses voies de trafic intracellulaire et endocytose seront discutées. Je familiarise le lecteur avec des protéines inactivant les ribosomes, en mettant l'accent sur la structure, l'endocytose, et le trafic intracellulaire de la toxine bactérienne Shiga toxin (STX). STx et la ricine suivent la voie rétrograde pour exercer leur effet toxique sur les cellules. Ils sont respectivement, une menace maladie infectieuse pour la santé humaine et des outils potentiels pour le bioterrorisme pour lequel aucun antidote n’existe actuellement. D'un criblage à haut débit, Retro-1 et Retro-2 avaient déjà été identifiés comme de puissants inhibiteurs de la voie rétrograde à l'interface des endosomes précoces-TGN, et Retro-2 a été démontré pour protéger les souris contre la ricine. Parmi les facteurs de trafic analysés, seule la protéine SNARE syntaxine-5 a été ré- localisée dans les cellules traitées avec Rétro - 2. / In the introduction, various endocytic and intracellular trafficking pathways will be discussed. I acquaint the reader with ribosome-inactivating proteins, with emphasis on the structure, endocytosis, and intracellular trafficking of the bacterial toxin Shiga toxin (STx). STx and ricin follow the retrograde route to exert their toxic effect on cells. They are respectively, an infectious disease threat to human health and potential tools for bioterrorism for which no antidote currently exists. From a high throughput screening, Retro-1 and Retro-2 had previously been identified as potent inhibitors of the retrograde route at the early endosomes-TGN interface, and Retro-2 was demonstrated to protect mice against ricin. Of the trafficking factors analyzed, only the SNARE protein syntaxin-5 was re-localized in Retro-2 treated cells. Yet, whether syntaxin-5 is the direct target of Retro-2 and whether its re-localization was directly responsible for retrograde transport inhibition remained to be established.