La thérapie génique utilisant les vecteurs viraux est une des approches thérapeutiques possible pour le développement d’une thérapie pour les maladies génétiques mono-géniques dont l’ataxie de Friedreich (FRDA). Dans le but de vérifier l’efficacité des virus adéno-associés (AAV) à transférer la copie normale du transgène dans les tissus qu’ils infectent, nous avons insérer le gène codant pour la forme améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP) dans les AAV sérotype 9 (AAV9). Ces AAV recombinants (AAVr) ont été ensuite administrés aux souris femelles gestantes par voie intraveineuse et intra-péritonéale. Les résultats obtenus montrent que le transgène a été transféré à la fois dans les tissus des souris femelles ainsi que dans ceux des souriceaux. / Gene therapy using viral vectors is one of the therapeutic approaches possible for the development of genetic therapies for monogenic diseases including Friedriech's Ataxia (FRDA). In order to verify the effectiveness of adeno-associated virus (AAV) to transfer a transgene in the tissues they infect, we inserted the gene encoding the enhanced form of the green fluorescent protein (eGFP) in AAV Serotype 9 (AAV9). These recombinant AAV (rAAV) were then administered by intravenous and intraperitoneal to pregnant female mice. The results obtained show that the transgene was transferred in both in the female’ mouse tissues and in those of young mice.

L'origine et la fonction des cellules immunitaires du système nerveux central (SNC), connues sous le nom de microglies, sont controversées. Les objectifs de cette thèse étaient de déterminer si les cellules souches de la moelle osseuse peuvent infiltrer le SNC et se différencier en cellules microgliales, et d'élaborer plus précisément si les microglies sont bénéfiques ou dommageables aux neurones lors des maladies neurodégénératives. Premièrement, nous établissons que les cellules de la moelle osseuse peuvent en effet infiltrer différentes régions du SNC, et qu'elles se différencient en microglies périvasculaires et parenchymateuses. De plus, les microglies originaires de la moelle osseuse expriment fortement la protéine CD1 le, suggérant qu'elles sont de meilleures cellules présentatrices d'antigène que les microglies parenchymateuses déjà présentes dans le SNC. Il est alors possible que les microglies infiltrantes jouent un rôle important dans le maintien du bon fonctionnement du SNC, surtout durant les infections cérébrales et les maladies neurodégénératives. Nous démontrons ensuite que la réponse immunitaire microgliale protège les neurones contre l'excitotoxicité aiguë par un mécanisme qui dépend de la voie de signalisation MyD88/NF-icB. De plus, les cellules de la moelle osseuse sont fortement attirées vers les régions affectées par la mort neuronale, mais que ces cellules ne sont pas critiques à la protection neuronale dans les stages initiaux de l'excitotoxicité. Au contraire, dans ce model neurodégénératif aiguë, ce sont les microglies résidentes du cerveau qui sont bénéfiques. Nous avons ensuite étudié le rôle des microglies infiltrantes dans un modèle animal de la maladie neurodégénérative chronique d'Alzheimer. Ces cellules microgliales sont attirées en grand nombre par la P-amyloïde, se dirigent vers les plaques séniles et les infiltrent. Nous confirmons aussi qu'une réponse immunitaire spécifique est engendrée par la Pamyloïde. Finalement, nous démontrons que les microglies provenant de la moelle osseuse restreignent la formation des plaques séniles en phagocytant la p-amyloïde. En conclusion, les résultats de cette thèse démontrent qu'il y a en effet deux populations de microglies et que le rôle de ces cellules varie en fonction du processus neurodégénératif aigu ou chronique. Il serait possible d'utiliser les cellules souches hématopoiétiques comme véhicule thérapeutique, surtout pour contrôler la cascade amyloïde et le déficit cognitif.

Les protéines fluorescentes (PF) homologues d’AvGFP (Green Fluorescent Protein de la méduse Aequorea victoria) sont des outils incontournables de l’imagerie des processus de la cellule vivante. Leurs performances conditionnent la précision de l’analyse quantitative des signaux de fluorescence. Le développement de nouvelles PF demande donc à la fois de parvenir à une forte brillance tout en contrôlant la réponse de la protéine aux variations des paramètres physico-chimiques de la cellule en fonction de la question biologique étudiée. A ce jour, les PF jaunes disponibles montrent une forte sensibilité au pH. Afin d’élaborer des mutants moins sensibles, deux approches ont été considérées : une première consiste à mieux appréhender l’incidence de la dynamique du réseau de liaisons hydrogène entourant le chromophore sur son équilibre acido-basique. La seconde vise à identifier les facteurs structuraux à l’origine de la brillance particulièrement élevée de nouvelles PF jaunes et jaune-vert provenant d’un ver marin, Branchiostoma lanceolatum.J’ai d’abord mis au point un algorithme recherchant l’ensemble des liaisons hydrogène présentes au sein d’une protéine et qui étudie leur dynamique au cours de simulations par dynamique moléculaire. Il permet leur agrégation en réseaux, l’identification des réseaux connectés à un atome d’intérêt ainsi que le suivi de leur dynamique. Pour validation, cet algorithme a été appliqué à la recherche des réseaux de liaisons hydrogène présents au sein de différents mutants d’AvGFP pour lesquels un transfert de proton à l'état excité a été étudié expérimentalement. Cet algorithme pourra également servir à comprendre de façon dynamique le mécanisme d’autres systèmes biologiques dont la fonction repose sur le transfert de protons.D’autre part, j’ai résolu la structure de la protéine fluorescente jaune naturelle lanYFP de Branchiostoma lanceolatum, particulièrement brillante mais à la structure quaternaire tétramérique. Cette protéine a été rendue monomérique par évolution dirigée, ce qui a donné la protéine mNeonGreen à la fluorescence jaune-vert, protéine désormais étalon dans cette gamme spectrale, et dont j’ai également résolu la structure. Mon étude a permis de rationaliser a postériori l’ensemble des mutations introduites au cours de l’évolution. Enfin, j’ai réalisé une étude du dégât d’irradiation spécifique des rayons X permettant de comprendre le changement remarquable de couleur observé sur les cristaux de mNeonGreen après collecte de données de diffraction.L’ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse permet de proposer un cadre de compréhension à la fois théorique et expérimental des déterminants contrôlant les propriétés de fluorescence des PF jaunes. / Fluorescent Proteins (FPs) homologous to AvGFP (Green Fluorescent Protein from the jellyfish Aequoria victoria) are versatile tools used in live cell imaging. The amount of information that can be derived from the fluorescence signals depends on the spectroscopic performances of the FP. The development of new FPs should focus on both brightness increase and control of the protein response to physicochemical parameter variations within the cell. Current yellow FPs exhibit a strong sensitivity to pH. In order to engineer less sensitive variants, two complementary approaches have been used: the first one consists in studying the influence of the hydrogen bond network dynamics around the chromophore on its protonation state. In the second one, I have sought to identify the structural determinants of the particularly high brightness of newly discovered yellow FPs from a sea worm, Branchiostoma lanceolatum.First, I wrote an algorithm that can identify all hydrogen bonds within a protein and analyse their dynamics along molecular dynamics simulations. It allows for their clustering in networks, the identification of networks connected to a given atom and the monitoring of their dynamics. The method was validated by using the algorithm on various AvGFP mutants for which excited state proton transfer has been experimentally studied. This algorithm should also be useful for the study of other biological systems whose function is based on proton transfer.Besides, I solved the structure of the natural yellow FP lanYFP from Branchiostoma lanceolatum, which is particularly bright, but presents a tetrameric arrangement. This protein was monomerized by directed evolution, which led to the yellow-green FP mNeonGreen, now a benchmark in this spectral range. I also solved the structure of mNeonGreen, which allowed me to rationalize a posteriori the mutations that have been introduced during the evolution process. Finally, I performed a specific radiation damage study in order to explain the remarkable change in colour of mNeonGreen crystals upon X-ray data collection. Altogether, the results of my PhD work provides a theoretical and experimental framework of the determinants that drive the fluorescence properties of yellow FPs.

Le développement d'une médecine personnalisée nécessite la mise au point de sondes permettant la détection des marqueurs d'une pathologie au stade le plus précoce possible. Ce mémoire décrit la synthèse et l'évaluation de sondes ciblées permettant de réaliser des images en IRM ou en scintigraphie. Ces sondes sont construites par fonctionnalisation d'un châssis moléculaire préparé par une réaction à trois composants. La propargylamine résultante possède plusieurs points d'ancrage pour introduire les ligands destinés au ciblage et deux groupes chélatants pour l'imagerie. Ce châssis possède aussi en position terminale un groupement réactif pour le fixer sur des petites molécules polyfonctionnelles, des dendrimères ou des protéines. Une technique de criblage à flux rapide, basée sur l'utilisation des puces à petites molécules, a été utilisée pour la détection des ligands. Les molécules déposées sur la puce proviennent soit des C-glycosides complexes préparés selon le concept de la synthèse orientée vers la diversité, soit de la chimiothèque du laboratoire. Ces puces ont permis l'identification de ligands de plusieurs protéines comme la protéine VPR de la capside du virus du sida. Un criblage secondaire par RMN a confirmé l'interaction protéine-petite molécule. Les sondes portant un flavonoïde pour cibler les cellules tumorales de l'endothélium ont été traitées par une solution de sel de gadolinium puis leurs propriétés ont été évaluées par IRM. Les premiers résultats indiquent que ces composés offrent un contraste de 2 à 4 fois supérieurs aux agents de contraste usuellement utilisés. Leur évaluation biologique sera réalisée prochainement.