Le système sécrétion de type V à deux partenaires ou système TPS est un système dédié à la sécrétion de protéines de grandes tailles souvent impliquées dans la virulence. La protéine sécrétée ou protéine TpsA traverse la membrane externe via son partenaire membranaire spécifique, la protéine TpsB. Ces systèmes TPS sont répartis en deux sous-familles, la sous-famille FHA/FhaC et la sous-famille HMW1A/HMW1B, peu caractérisée structuralement, à laquelle appartient le système HxuA/HxuB dédié à l’acquisition de l’hème extracellulaire chez Haemophilus influenzae. Ma thèse est consacrée à l’étude structurale et fonctionnelle du système HxuA/HxuB. A cette fin, le système de sécrétion HxuA/HxuB a été recréé chez E. coli. Le domaine N-terminal de HxuA, HxuA301, et son partenaire HxuB entier ont été produits respectivement en surnageant de culture et en membrane externe. Après purification de ces protéines, des essais de cristallogenèse ont été réalisés. Des cristaux ont été obtenus pour HxuA301 et HxuB. Seule la structure de HxuA301 a pu être déterminée avec une résolution de 1,5 Å. HxuA301 présente une structure en hélice-β main droite avec un motif extra-hélice constitué de quatre brins-β antiparallèles. Des croisements entre les systèmes HxuA/HxuB et HMW1A/HMW1B ont été réalisées et ont mis en évidence le fait que HxuB n’est pas indispensable au repliement de HxuA301. On a en effet pu résoudre la structure de HxuA301 produite dans E. coli sans HxuB (HxuA301-noB) qui est en tout point identique à celle de HxuA301. Cette observation appuie l’hypothèse selon laquelle le domaine N-terminal des protéines TpsA serve à initier le repliement progressif de la protéine TpsA une fois la surface bactérienne atteinte. / The type V two-partner secretion system or TPS system is a system dedicated to the secretion of large proteins mostly implied in virulence. The secreted protein or TpsA protein crosses the outer membrane thanks to its membrane partner, the TpsB protein. The TPS systems are subdivided into two subfamilies, the FHA/FhaC and HMW1A/HMW1B subfamily, with few structural characterized, in which belongs the system HxuA/HxuB dedicated to the acquisition of extracellular haem in Haemophilus influenzae. My thesis focuses on the structural and functional study of HxuA/HxuB system. In that aim, HxuA/HxuB secretion system has been recreated in E. coli. HxuA N-terminal domain, HxuA301, and full length HxuB membrane partner have been produced respectively in the supernatant and in the outer membrane. After purification of these proteins, crystallogenesis assays have been realized. Crystals have been obtained for HxuA301 and HxuB. Only the HxuA301 structure has been determined with a resolution of 1,5 Å. HxuA301 presents a structure in right-handed β-helix with one extra-helix motif constituted a four antiparallel β-strands. Crossing between HxuA/HxuB and HMW1A/HMW1B systems has been realized and highlighted that HxuB is not necessary for the folding of HxuA301. Indeed, we succeed to solve the structure of HxuA301 produced in E. coli without HxuB (HxuA301-noB) which is strictly identical to the one of HxuA301. This observation supports the hypothesis that N-terminal domain of TpsA could act as a scaffold pour the progressive folding of TpsA protein once the cell surface reached.

Chez les organismes multicellulaires la diversité protéique dans chaque cellule et chaque tissu est obtenue initialement en régulant l’expression d’une partie des gènes d’un génome. Ces gènes sélectionnés peuvent ensuite être soumis à un épissage alternatif de sorte que certains exons sont retenus ou exclus dans l’ARNm final. Nous étudions les détails moléculaires de la protéine MEC-8, un facteur d’épissage tissu spécifique chez Caenorhabditis elegans. Les mutants MEC-8 sont responsables d’un phénotype insensible au touché chez Caenorhabditis elegans. Plus précisément, MEC-8 lie le pré-ARNm de mec-2 un composant des récepteurs mécanosensoriels afin de réguler la production d’un isoforme particulier nécessaire pour la transduction du signal mécanosensoriel. Des études portant sur le motif conservé de reconnaissance à l’ARN (RRM) chez des orthologues des vertébrés (RBPMS) et des insectes (couch potato, CPO) ont démontré la présence d’un motif d’homodimérisation dans le domaine RRM1 de MEC-8. Cependant MEC-8 contient aussi un second domaine RRM dans sa partie C-terminale, domaine qui n’est pas retrouvé dans les protéines RBPMS et CPO. Nous avons donc exprimé chaque domaine RRM de MEC-8 indépendamment ainsi que la protéine entière et ces constructions ont été utilisées pour diverses expériences biophysiques. Nous avons ainsi identifié la séquence de liaison optimale pour les deux domaines RRM1 et RRM2. Ces analyses ont aussi été menées sur les domaines homologues issus des protéines RBPMS et CPO qui présentent une forte affinité pour la même séquence d’ARN. Nous avons donc découvert que malgré des différences de fonction et de localisation les membres de la famille RBPMS lient tous le même motif d’ARN. Les détails atomiques des deux RRM en complexe avec leur motif de liaison ont été obtenus en utilisant de la spectroscopie RMN et de la cristallographique des rayons X. Les deux complexes RRM-ligand de MEC-8 présentent de surprenantes similarités dans leur architecture. / In multicellular organisms, proteomic diversity in each cell and tissue is provided initially by selective expression of gene subsets from the total genome, which are further subjected to alternative splicing, such that a different pattern of exons can be retained or excluded in the final protein coding mRNA. We are investigating the molecular details of the tissue-specific splicing factor protein MEC-8 from the worm Caenorhabditis elegans. The MEC-8 mutant protein is responsible for a touch insensitive phenotype in Caenorhabditis elegans, relating to its role as an alternative splicing factor. More precisely, MEC-8 can bind to the mec-2 pre-mRNA, a component of mechanosensory receptor, to regulate the production of a certain isoform required for transducing the touch signal. Previous studies of the conserved RNA Recognition Motif (RRM) domain in orthologues from vertebrate (RBPMS) and insect (couch potato; CPO) have demonstrated a homodimerization motif in MEC-8 RRM1. However, MEC-8 also contains a second RRM domain in the C-terminus that is not found in the characterized RBPMS and CPO proteins. We have therefore expressed the independent RNA-binding domains of MEC-8 as well as the full-length protein and have used these constructs in a variety of biophysical assays. We identified the optimal RNA binding sequence for both the RRM1 and RRM2, and quantified the penalty of sequence variations. The investigation has also been extended to the homologous domains from human RBPMS and Drosophila CPO, which show a high affinity to the same RNA sequence. We therefore find that despite differences in function and localization, the members of the RBPMS protein family all bind to the same RNA motif. Atomic details of binding have also been obtained by using a combination of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The ligand-bound complexes reveal a surprising similarity in the architecture of the bound ligand for the first and second RRM domains from MEC-8.

Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) CSF-1R et KIT sont médiateurs importants de la signalisation cellulaire. Leur fonction basale est altérée par des mutations associées à divers types de cancer. Ces mutations modifient également leur sensibilité à l’imatinib, utilisé en clinique dans le traitement des cancers. Dans cette thèse, nos objectifs sont (i) étudier les effets structuraux et dynamiques induits par la mutation D802V chez CSF-1R; (ii) caractériser l’affinité de l’imatinib aux formes sauvages (WT) et mutés de KIT (V560G, S628N et D816V) et CSF-1R (D802V). Par simulations de Dynamique Moléculaire (DM), nous avons montré que la mutation D802V interrompt la communication allostérique entre la boucle d’activation et le domaine auto-inhibiteur juxtamembranaire (JMR). Néanmoins, cette rupture n’est pas suffisante pour induire le départ du JMR. L’effet subtil de la mutation chez CSF-1R a été attribué aux différences de séquence primaire entre KIT et CSF-1R dans la région du JMR. L’affinité de l’imatinib aux différentes cibles a été calculée par simulations de docking, DM et calculs d’énergie de liaison. Les interactions électrostatiques constituent la force motrice de la résistance, les mutations D802/816V étant les plus délétères en termes d’énergie. Comme conclusion générale, nous avons établi que la mutation D802V chez CSF-1R n’entraine pas les mêmes effets structuraux provoqués par la mutation D816V chez KIT. En outre, l’étude des deux récepteurs dans leurs formes WT et mutés complexés avec l’imatinib indiquent que le changement structural induit par les mutations associé aux interactions électrostatiques avec le ligand expliqueraient le phénomène de résistance. / The receptors tyrosine kinase (RTKs) CSF-1R and KIT are important mediators of signal transduction. Their normal function is altered by gain-of-function mutations associated with cancer diseases. A secondary effect of the mutations is the alteration of receptors’ sensitivity imatinib, employed in cancer treatment. Our goals in this thesis consist of (i) study the structural and dynamical effects induced by the D802V mutation in CSF-1R; (ii) characterize imatinib’s affinity to the wild-type (WT) and mutant forms of KIT (V560G, S628N and D816V) and CSF-1R (D802V). By means of molecular dynamics (MD) simulations, we have shown that the D802V mutation disrupts the allosteric communication between the activation loop and the auto-inhibitory juxtamembrane (JMR) domain. However, this rupture is not sufficient to induce the JMR’s departure. The subtle effect of this mutation in CSF-1R was associated with differences in the primary sequence between CSF-1R and KIT in the JMR region. The affinity of imatinib to the different targets was estimated by docking, DM and binding energy calculations. The electrostatic interactions showed to be the main force driving the resistance, with mutations D802/816V being the most deleterious in energy contribution. As a general conclusion, we have established that the D802V mutation in CSF-1R does not provoke the same structural effects as its equivalent in KIT. In addition, the study of both receptors in their WT and mutant forms complexed with imatinib indicate that the conformational changes induced by the mutations allied to the electrostatic interactions with the ligand could explain the resistance phenomena.

Pas de résumé / No abstract

La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.

Depuis les premières structures de protéines déterminées dans les années 1950, la cristallographie aux rayons X s’est imposée comme une méthode de choix pour l’obtention de données structurales à l’échelle atomique. Malgré les progrès technologiques qui ont révolutionné cette méthode (sources synchrotron, détecteurs pixel, programmes informatiques performants), l’obtention d’une carte de densité électronique permettant de modéliser la structure d’une macromolécule demeure toujours limitée par deux goulots d’étranglement qui sont, l’obtention de cristaux de la macromolécule d’intérêt et la résolution du problème des phases inhérent à l’enregistrement des données de diffraction.Cette thèse présente un nouveau complexe de lanthanide appelé « crystallophore » (Tb-Xo4). Cette molécule a été développé en collaboration avec Olivier Maury et François Riobé du laboratoire de chimie Matériaux Fonctionnels et Photonique (ENS –Lyon). La conception de ce nouveau complexe est basée sur quinze années de développement dans le domaine de la biologie structurale. Cette thèse présente les effets uniques induits par de Tb-Xo4 sur la cristallisation et sur la détermination des structures de macromolécules biologiques. L’ajout de Tb-Xo4 au cours de la cristallisation permet d’induire un nombre important de conditions de cristallisation exploitables dont certaines sont propres à la présence du crystallophore. L’analyse des structures atomiques de différentes protéines co-cristallisées en présence de Tb-Xo4 a permis à la fois de mettre en avant le pouvoir phasant élevé de Tb-Xo4 mais également de décrire finement l’interaction supramoléculaire du complexe avec la surface des macromolécules. Ce travail a conduit à la mise en place de protocoles de cristallisation et de phasage des macromolécules biologique assistés par Tb-Xo4. Sur la base de la compréhension du mode d’interaction de ce nouveau composé, cette thèse aboutit à la proposition d’un modèle expliquant les propriétés uniques de ce nouveau complexe de lanthanide. / Since the first protein structure determined in the 1950s, X-ray crystallography emerged as a method of choice to obtain structural data at atomic resolution. Despite technological advances such as new synchrotron sources, hybrid pixel detectors, and high-performance softwares, obtaining an electron density map of a biological macromolecule is always limited by two major bottlenecks namely, producing high quality single crystals and solving the phase problem.This thesis presents a new lanthanide complex called “Crystallophore” (Tb-Xo4). This compound has been developed in collaboration with Olivier Maury and François Riobé of the Laboratoire de chimie Matériaux Fonctionnels et Photonique (ENS –Lyon). The design of this new complex is based on fifteen years of development in the field of structural biology. This thesis highlights the effects of Tb-Xo4 on the crystallisation and the structure determination of biological macromolecules. Indeed, the addition of Tb-Xo4 to a protein solution induces a large number of new and unique crystallization conditions. The analysis of the structures of several proteins co-crystallized with Tb-Xo4 allowed both, to highlight the high phasing power of Tb-Xo4 but also to describe finely the supramolecular interaction of the complex with the macromolecules. This work led to protocols dedicated to crystallization and phasing assisted with Tb-Xo4. Finally, this thesis leads to a model explaining the unique properties of this new lanthanide complex.

Ma thèse comporte deux volets: d’une part, le développement de ligands ciblant les protéines antiapoptotiques et d’autre part, l’étude par RMN des protéines CGC impliquées dans la biosynthèse de la congocidine, métabolite secondaire chez Streptomyces.La famille de protéines Bcl-2 est impliquée dans un des processus clé de la mort cellulaire programmée, appelée l’apoptose mitochondriale. Elle se divise en membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) et pro-apoptotiques (Bak, Bax et les «BH3»).Ces molécules vont réguler l’apoptose en maintenant ou non l’intégrité de la membrane mitochondriale. En réponse à un signal de stress, les «BH3» neutralisent les antiapoptotiques et activent les pro-morts, leur permettant de former des pores sur la membrane mitochondriale. Ce phénomène aboutit au relargage du cytochrome c dans le cytosol et à l’activation de la cascade des caspases dont la finalité est la destruction de la celluleLa pertinence de l’étude des Bcl-2 s’observe de manière croissante depuis les années 1990. En effet, une surexpression des membres pro-survie de cette famille (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BFL1 etc...) a été observée dans de nombreux cancers. Suite à ce constat, cibler ces molécules est devenue une piste prometteuse en cancérologie par le développement d’inhibiteurs des protéines pro-survie, l’objectif étant de restaurer l’apoptose dans les cellules tumorales.Dans cette perspective, différentes stratégies thérapeutiques ont été imaginées:(i) la thérapie génique avec l’Oblimersen, un ADN antisens développé par Genta, qui inhibe l’expression de la Bcl-2. Néanmoins, les résultats précliniques sont décevants.(ii) l’utilisation de peptides (ou peptidomimétiques) imitant les sentinelles «BH3» comme antagonistes de l’interaction Bcl-xL/Bak. Il faut souligner le concept des «stappled peptides», permettant la stabilisation des hélices par cyclisation des chaînes latérales. Si certaines de ces molécules synthétisées semblent très actives, aucune n’est encore en étude clinique.(iii) le développement de petites molécules non peptidiques, issues d’un criblage systématique in vitro ou in silico et se caractérisant par une grande variété structurale. Parmi ces molécules, certaines sont synthétiques comme l’ABT-737 et l’ABT-263 élaborés par les laboratoires Abbott, grâce à la méthode d’assemblage des fragments (fragment-based drug design) aidée par des études SAR by NMR (structure activity relationship). D’autres sont issues de produits naturels comme le (R)-Gossypol, le TW-37, la sanguinarine ou l’Obatoclax. En 2008, 11 composés étaient en phase préclinique ou clinique et les résultats pour certains d’entres eux semblaient plus prometteurs que pour l’Oblimersen.Ces stratégies ont permis de mettre au point un certain nombre de composés ciblant les protéines anti-apoptototiques. Si certains de ces composés sont actuellement en phase de tests cliniques, les plus prometteurs (ABT) ont démontré une efficacité uniquement vers certains des protéines anti-apoptotiques laissant place à un phénomène d’échappement des cellules cancéreuses.Un criblage réalisé à l’ICSN par l’équipe de F. Guéritte (Pôle Substances Naturelles Plantes) a permis d’identifier une nouvelle classe de molécules ayant une affinité de l’ordre du μM pour Bcl-xL. Parmi ces composés, deux présentent une attractivité d’un point de vue structural qui rend faisable leur synthèse chimique:(i) la meiogynine A, un sesquiterpène dimère de structure originale isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie.(ii) le drimane, un sesquiterpène isolé en grandes quantités du genre zygogynum, une espècede Nouvelle-Calédonie.Ainsi, des collaborations ont été établies au sein de l’ICSN, réunissant diverses expertises (chimie, biologie, physicochimie et modélisation) afin de dégager les synergies souhaitables.Dans la perspective de la conception rationnelle d’analogues aux propriétés améliorées ciblant l’ensemble des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, ma contribution est de choisir les cibles biologiques (Bcl-xL et Mcl-1), de les obtenir pures et marquées en isotopes stables afin de réaliser par RMN et modélisation moléculaire une étude structurale des complexes protéines/ligands et de définir un modèle d’interaction.Le deuxième volet de ma thèse, à dominante fondamentale, a pour objectif de caractériser par RMN les médiateurs enzymatiques d’une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire, la congocidine issue des bactéries Streptomyces Ambofaciens.La congocidine présente des propriétés antivirales et anticancéreuses de par sa capacité à se fixer à l’ADN. Cependant, du fait de sa forte toxicité, cette molécule ne peut pas être utilisée directement à des fins thérapeutiques.L’analyse des groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse de la congocidine a mis en évidence 24 gènes. Seuls certains intermédiaires réactionnels ont été identifiés. Cependant, le rôle précis des produits de ces gènes n’est pas encore bien défini.Ainsi, en collaboration avec l’équipe de JL Pernodet à l’Université d’Orsay, nous nous sommes intéressés à deux enzymes en particulier intervenant dans la synthèse de la congocidine, les protéines CGC-10 et CGC-19.L’objectif de cette collaboration est d’utiliser la spectroscopie RMN couplée à la modélisation moléculaire sous contraintes expérimentales afin de déterminer la structure de ces deux protéines. Nous souhaitons apporter des informations sur l’éventuelle présence de motifs structuraux au sein de ces protéines afin de mieux comprendre leur fonction et de définir à quel moment de la voie de biosynthèse elles interviennent.Concernant la protéine CGC-10, nous avons conçu un plasmide optimisé que nous avons fait synthétiser. Le gène obtenu a été cloné dans un vecteur d’expression choisi par nos collaborateurs (pQE30).Concernant la protéine CGC-19, nous allons en décrire les étapes d’expression et de purification qui nous ont permis d’enregistrer l’ensemble des expériences 3D-triple résonnance nécessaires à la détermination de la structure de la protéine. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une modification post-traductionnelle de type phosphopanthéténylation au sein de cette protéine. Nous avons produit l’enzyme responsable de cette modification, la sfp, afin de pouvoir effectuer la réaction et suivre l’effet de la modification sur les spectres RMN de la protéine et donc sur la structure.Ce projet, qui s’inscrit dans une perspective de recherche à plus long terme, a pour objectif de caractériser précisément le mécanisme de production de la congocidine. A travers cette démarche, il s’agit de combiner la biologie moléculaire (modification en amont les gènes) à la chimie afin d’obtenir des molécules différentes aux propriétés améliorées et non toxiques. / My PhD thesis contains two parts: development of ligands against anti-apoptotic proteins and structural study of CGC proteins involved in the biosynthesis of congocidine, a Streptomyces Ambofaciens secondary metabolite.The first project concerns the NMR study of the interactions between the anti-apoptotic proteins and two potential ligand candidates, the Meiogynine and the Drimane. These two terpenoïds, identified from ICSN’s chemical library screening against the Bcl-xL protein, have shown a significant inhibiting activity, thus opening promising perspectives for the treatment of cancer cells overexpressing anti-apoptotic proteins. In fact, as these compounds are considerably smaller than the binding site, our objective is to introduce modifications (such as elongation of their structure, functionalization with hydrophilic groups etc.) that may improve their binding properties as well as their delivery and bioavailability.Following to the successful recombinant expression and purification, necessary to obtain labelled targets (15N/13C), our preliminary NMR studies suggested a rather universal action of our candidates, capable to bind not only to Bcl-xL but also to the other major anti-apoptotic protein, Mcl-1. Titration experiments revealed significant perturbations of the HSQC protein NMR spectra with the progressive disappearance of several protein HN and ligand signals, confirming dissociation constants at the µM region for both targets. However, the intermediate chemical exchange NMR regime observed, associated with the weak ligand solubility, poses severe difficulties for the structural elucidation of the complexes by classical NMR methods.In this work alternative approaches for the localisation of the ligands in the hydrophobic cleft of both target proteins will be presented.Oligopyrroles are secondary metabolites synthesized by Streptomyces bacteria. This family of natural products, composed by one or more pyrrole-2-carboxamide groups is characterized by a variety of biological activities such as antiviral, antitumor and antibiotic functions.One of the best-known metabolites is the congocidine, extensively studied due to its capacity to bind into the minor groove of the DNA double helix, with strong sequence specificity. However, because of its strong toxicity, this molecule cannot be directly used for therapeutic purposes.The analysis of the groups of genes involved in congocidine biosynthesis brought to light 24 genes, but their precise role is not yet well defined. We were particularly interested in two enzymes: the proteins called CGC-10 and CGC-19. For the recombinant expression of the first one, we designed an optimized insert which was cloned in an expression vector pQE30.Concerning CGC-19, the stages of expression and purification, which allowed us to obtain doubly-labeled protein, as well as the 3D NMR experiments for spectral assignment and structure elucidation, will be discussed.Furthermore, we were interested in the holo- state of this protein obtained through a post-traductional modification (phosphopanthéténylation). To this, we produced the enzyme responsible for this modification, Sfp, carry out the reaction in vitro and follow the effect of the modification at the NMR spectra.

Les ARNs long non codants (ARNlnc) jouent un rôle clé dans les processus cellulaires vitaux, notamment le remodelage de la chromatine, la réparation de l'ADN et la traduction. Cependant, la taille et la complexité des ARNlnc présentent des défis sans précédent pour les études moléculaires mécanistiques, de sorte qu'il s'est avéré difficile jusqu'à présent de relier l'information structurelle à la fonction biologique pour les ARNlnc.Le gène 3 humain exprimé maternellement (de l’anglais "maternally expressed gene 3", MEG3), est un ARNlnc abondant, soumis à empreinte parentale et épissé alternativement. Pendant l'embryogenèse, MEG3 contrôle les protéines Polycomb, régulant la différenciation cellulaire, et dans les cellules adultes, MEG3 contrôle p53, régulant la réponse cellulaire aux stress environnementaux. Dans les cellules cancéreuses, MEG3 est régulé négativement, mais la surexpression ectopique de MEG3 réduit la prolifération incontrôlée, ce qui prouve que MEG3 agit comme un suppresseur de tumeur. Les données suggèrent que les fonctions de MEG3 pourraient être régulées par la structure de MEG3. Par exemple, on pense que MEG3 se lie directement aux protéines p53 et Polycomb. De plus, les différents variants d'épissage de MEG3, qui comprennent différents exons et possèdent ainsi des structures potentiellement différentes, présentent des fonctions différentes. Enfin, la mutagenèse par délétion, basée sur une structure de MEG3 prédit in silico, a permis d’identifier un motif MEG3 supposé structuré impliqué dans l'activation de p53. Cependant, au début de mes travaux, la structure expérimentale de MEG3 était inconnue.Pour comprendre la structure et la fonction de MEG3, j'ai utilisé des sondes chimiques in vitro et in vivo pour déterminer la structure secondaire de deux variants humains de MEG3 qui diffèrent par leurs niveaux d'activation de p53. À l'aide d'essais fonctionnels dans les cellules et de mutagenèse, j'ai systématiquement analysé la structure de MEG3 et identifié le noyau activant p53 dans deux domaines (D2 et D3) qui sont conservés structuralement dans les variants humains et conservés dans l’évolution chez les mammifères. Dans D2-D3, les régions structurales les plus importantes sont les hélices H11 et H27, car dans ces régions, j’ai pu supprimer l'activation de p53 grâce à des mutations ponctuelles, un degré de précision jamais atteint pour les autres ARNlnc jusqu’ici. J'ai découvert de manière surprenante que H11 et H27 sont reliés par des boucles connectées l’une à l’autre (de l’anglais "kissing loops") et j'ai confirmé l'importance fonctionnelle de ces interactions de structure tertiaire à longue distance par mutagenèse compensatoire. Allant au-delà de l’état de l’art, j'ai donc essayé de visualiser la structure 3D d’une isoforme de MEG3 longue de 1595 nucléotides, par diffusion de rayons X à petit angle (SAXS), microscopie électronique (EM) et microscopie à force atomique (AFM). Alors que le SAXS et l’EM sont limités par des défis techniques actuellement insurmontables, l’imagerie par AFM m’a permis d’obtenir la première structure 3D à basse résolution de MEG3 et de révéler son échafaudage tertiaire compact et globulaire. Plus remarquable encore, les mêmes mutations qui perturbent la connexion entre les «boucles» H11-H27 et qui inhibent la fonction de MEG3, perturbent aussi la structure 3D de cet ARNlnc, fournissant ainsi le premier lien direct entre la structure 3D et la fonction biologique pour un ARNlnc.Sur la base de mes découvertes, je peux donc proposer un mécanisme de l’activation de p53 basé sur la structure de MEG3, avec des implications importantes pour la compréhension de la cancérogenèse. Plus généralement, mes travaux prouvent que les relations structure-fonction des ARNlnc peuvent être disséquées avec une grande précision et ouvrent la voie à des études analogues visant à obtenir des informations mécanistes pour de nombreux autres ARNlnc d’importance médicale. / Long non-coding RNAs (lncRNAs) are key players in vital cellular processes, including chromatin remodelling, DNA repair and translation. However, the size and complexity of lncRNAs present unprecedented challenges for mechanistic molecular studies, so that connecting structural information with biological function for lncRNAs has proven difficult so far.Human maternally expressed gene 3 (MEG3) is an abundant, imprinted, alternatively-spliced lncRNA. During embryogenesis MEG3 controls Polycomb proteins, regulating cell differentiation, and in adult cells MEG3 controls p53, regulating the cellular response to environmental stresses. In cancerous cells, MEG3 is downregulated, but ectopic overexpression of MEG3 reduces uncontrolled proliferation, proving that MEG3 acts as a tumour suppressor. Evidence suggests that MEG3 functions may be regulated by the MEG3 structure. For instance, MEG3 is thought to bind p53 and Polycomb proteins directly. Moreover, different MEG3 splice variants, which comprise different exons and thus possess potentially different structures, display different functions. Finally, deletion mutagenesis based on a MEG3 structure predicted in silico identified a putatively-structured MEG3 motif involved in p53 activation. However, at the beginning of my work, the experimental structure of MEG3 was unknown.To understand the MEG3 structure and function, I used chemical probing in vitro and in vivo to determine the secondary structure maps of two human MEG3 variants that differ in their p53 activation levels. Using functional assays in cells and mutagenesis, I systematically scanned the MEG3 structure and identified the p53-activating core in two domains (D2 and D3) that are structurally conserved across human variants and evolutionarily conserved across mammals. In D2-D3, the most important structural regions are helices H11 and H27, because in these regions I could tune p53 activation even by point mutations, a degree of precision never achieved for any other lncRNA to date. I surprisingly discovered that H11 and H27 are connected by “kissing loops”, and I confirmed the functional importance of these long-range tertiary structure interactions by compensatory mutagenesis. Going beyond state-of-the-art, I thus attempted to visualize the 3D structure of a 1595-nucleotide long MEG3 isoform by small angle X-ray scattering (SAXS), electron microscopy (EM), and atomic force microscopy (AFM). While SAXS and EM are limited by currently-insurmountable technical challenges, single particle imaging by AFM allowed me to obtain the first low resolution 3D structure of MEG3 and reveal its compact, globular tertiary scaffold. Most remarkably, functionally-disrupting mutations that break the H11-H27 “kissing loops” disrupt such MEG3 scaffold, providing the first direct connection between 3D structure and biological function for an lncRNA.Based on my discoveries, I can therefore propose a structure-based mechanism for p53 activation by human MEG3, with important implications in understanding carcinogenesis. More broadly, my work serves as proof-of-concept that lncRNA structure-function relationships can be dissected with high precision and opens the field to analogous studies aimed to gain mechanistic insights into many other medically-relevant lncRNAs.

La connaissance des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques est indispensable pour mieux comprendre leur rôle et pour la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. Les techniques utilisées actuellement offrent une grande variété d'approches qui utilisent à la fois des informations spécifiques à la protéine étudiée et des informations génériques communes { l'ensemble des protéines. Il est possible de classer ces méthodes en fonction de la quantité d'information utilisée dans chacune de ces deux catégories avec d'un côté des méthodes utilisant le plus possible de données spécifiques { la protéine étudiée et de l'autre les méthodes utilisant le plus possibles de données génériques présentes dans les bases de données. Le travail présenté dans cette thèse aborde deux utilisations de techniques mixtes, présentant une autre combinaison entre données spécifiques et données génériques. En particulier nous avons cherché à obtenir la structure de protéines composée d'un ou deux domaines en ne disposant que d'un nombre restreint de données spécifiques. Pour déterminer la structure d'une protéine de grande taille composée de deux domaines { l'aide de données de diffusion des rayons X et de modèles obtenus par de la modélisation par homologie, nous avons adapté puis optimisé un programme récemment développé au laboratoire. Nous avons ensuite modélisé la structure d'un domaine d'une protéine de virus en incorporant un faible nombre de contraintes issues des données obtenues par RMN dans une méthode de prédiction de structure " ab initio ". Enfin, nous avons étudié l'intérêt d'intégrer les courants de cycle, une composante du déplacement chimique, dans un programme d'arrimage moléculaire pour la résolution de complexes protéine-ADN.

L'association échanges hydrogène/deutérium et spectrométrie de masse (HDX/MS) est devenue un outil analytique de choix pour l'étude de la structure et dynamique des protéines. L'approche classique "bottom-up" repose sur la digestion à la pepsine de la protéine deutérée et analyse des peptides protéolytiques par MS. Malheureusement, cette approche souffre de deux limitations majeures : (1) la résolution limitée par la taille des peptides après digestion et (2) l'échange inverse en solution avant l'analyse par MS. La MS en tandem classique ne peut pas être utilisée pour améliorer la résolution depuis que des expériences CID (Collision Induced Dissociation) sur des peptides deutérés ont montré une migration intramoléculaire des deutériums avant dissociation ("scrambling"). Par conséquent, il y a un grand intérêt à développer des approches HDX/MS alternatives pour améliorer les problèmes d'échange inverse, scrambling et résolution. Ce travail a donc consisté à mettre au point une méthode top-down HDX/MS robuste. Un nouveau système d'introduction des protéines deutérées dans le spectromètre de masse, appelé "cryosource", a été développé et les techniques d'activation basées sur la capture/transfert d'électron ont été utilisées. Il a récemment été montré que les méthodes ECD/ETD réduisaient le scrambling dans des conditions contrôlées avec une résolution à l'acide aminé près. L'utilisation de la cryosource a permis de diminuer l'échange inverse pendant des temps longs et avec des débits faibles. L'optimisation de tous les paramètres a été réalisée sur des peptides/protéine modèles. Notre objectif final était que notre approche soit applicable à l'analyse structurale du complexe aIF2.