La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00908534 |
| Date | 25 March 2010 |
| Creators | Marcoux, Julien |
| Publisher | Université de Grenoble |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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