Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante.

Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante. / MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol) are the most abundant membrane lipids of the chloroplast. They are synthesized exclusively in the chloroplast envelope by the action of MGDG synthases (MGD1, MGD2 and MGD3) and DGDG synthases (DGD1 and DGD2). Galactolipids are known to be essential for the structure (and function) of the photosystems and for the biogenesis of thylakoids. In phosphate deprivation, galactolipids become a source of lipid for other cell membranes, outside the chloroplast. Based on a high throughput chemical screen, a new molecule called galvestine-1 has been identified and characterized as an inhibitor of MGDG synthases. Galvestine-1 competes with the binding of the diacylglycerol substrate to MGDs. This molecular tool can be used to disturb the system comprising all lipid biosynthesis reactions, conversions, and lipid trafficking, responsible for the membrane lipid steady state observed at the whole cell level, or membrane lipid homeostasis. Perturbation of the system occurs at the level of MGDG synthases. The aim of this thesis is to use the effect of galvestine-1 to identify new actors or new pathways involved in the control of lipid homeostasis in plant cells. To this purpose, I designed and performed a screening of a collection of EMS (ethyl methanesulfonate) mutants, in order to isolate galvestine-1-resistant mutants and to identify mutated genes conferring this resistance. Transcriptomic data (Affymetrix genome array genechip, ATH1) of Arabidopsis thaliana treated in the presence of galvestine-1 had been obtained prior to the PhD project. These data were used to identify genes whose expression varied and possibly involved in lipid homeostasis. Based on a complementary candidate gene approach, I focused on Ala10, a putative flippase, which gene is over-expressed after treatment with galvestine-1 and following phosphate deprivation. The purpose of this second part of this thesis is to understand the relationship between the expression of ALA10 and genes involved in galactolipid synthesis in plants.

Le cycle glycérolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie métabolique clé qui relie le métabolisme du glucose et des acides gras et il est composé de deux processus métaboliques appelés lipogenèse et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycérides, génère diverses molécules de signalisation pour réguler la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta pancréatiques et la thermogenèse non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spécifiquement de la lipolyse impliqués dans ce processus sont mal connus. L’hydrolyse des triglycérides dans les cellules β est réalisée par les actions successives de la triglycéride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycérol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycérol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relâche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bêta, la MAGL classique est très peu exprimée et cette étude a démontré que l’hydrolyse de MAG dans les cellules β est principalement réalisée par l'α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifiée. L’inhibition d’ABHD6 par son inhibiteur spécifique WWL70, conduit à une accumulation des 1-MAG à longues chaines saturées à l'intérieur des cellules, accompagnée d’une augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la lignée cellulaire bêta INS832/13 réduit la GSIS, tandis qu’une augmentation des niveaux de MAG par le « knockdown » d’ABHD6 améliore la GSIS. L'exposition aiguë des monoacylglycérols exogènes stimule la sécrétion d'insuline de manière dose-dépendante et restaure la GSIS supprimée par un inhibiteur de lipases appelé orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gène ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gène ABHD6 spécifiquement dans la cellule β présentent une GSIS stimulée, et leurs îlots montrent une augmentation de la production de monoacylglycérol et de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. L’inhibition d’ABHD6 chez les souris diabétiques (modèle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et améliore la tolérance au glucose. De plus, les résultats montrent que les MAGs non seulement améliorent la GSIS, mais potentialisent également la sécrétion d’insuline induite par les acides gras libres ainsi que la sécrétion d’insuline induite par divers agents et hormones, sans altération de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons démontré que le MAG se lie à la protéine d’amorçage des vésicules appelée Munc13-1 et l’active, induisant ainsi l’exocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG à chaines saturées agit comme facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur négatif de la sécrétion d'insuline. En plus de son rôle dans les cellules bêta, ABHD6 est également fortement exprimé dans les adipocytes et son niveau est augmenté avec l'obésité. Les souris dépourvues globalement d’ABHD6 et nourris avec une diète riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycémie à jeun et une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline et ont une activité locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dépense énergétique et de la thermogenèse induite par le froid. En conformité avec ceci, ces souris présentent des niveaux élevés d’UCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phénotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manière chronique avec WWL70 (inhibiteur d’ABHD6) ou des oligonucléotides anti-sense ciblant l’ABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isolés de souris ABHD6-KO montrent des niveaux très élevés de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogène in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou délétion génétique d’ABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre évidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPARα et PPARγ et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogène est aboli par les antagonistes de PPARα et PPARγ. L’administration in vivo de l’antagoniste de PPARα GW6471 à des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causés par l’inactivation du gène ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit l’augmentation de la thermogenèse, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. L’ensemble de ces observations indique que ABHD6 régule non seulement l’homéostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homéostasie énergétique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bêta, mais régule aussi le brunissement des adipocytes blancs et améliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPARα et PPARγ. Ces résultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le développement de thérapies contre l'obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique. / The glycerolipid/ free fatty acid (GL/FFA) cycle is a key metabolic pathway that links glucose and fatty acid metabolism and it consists of lipogenesis and lipolysis. GL/FFA cycling, especially in its lipolysis arm, generates various lipid signaling molecules to regulate insulin secretion in pancreatic ß-cells and non-shivering thermogenesis in adipocytes. Currently, the lipolysis-derived lipid signals involved in this process are uncertain. Triglyceride hydrolysis in mammalian cells is accomplished by the sequential actions of adipose triglyceride lipase to produce diacylglycerol, by hormone sensitive lipase to produce monoacylglycerol (MAG) and by MAG lipase (MAGL) that releases free fatty acid and glycerol. Our work shows that in pancreatic ß-cell, the classical MAGL is poorly expressed and that MAG hydrolysis is mainly conducted by the newly identified α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6). Inhibition of ABHD6 by its specific inhibitor WWL70, leads to long-chain saturated 1-MAG accumulation inside the cells, accompanied by enhanced glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Decreasing the MAG levels by overexpression of ABHD6 in the ß-cell line INS832/13 reduces GSIS, while increasing MAG levels by ABHD6 knockdown enhances GSIS. Acute exposure of INS832/13 cells to various MAG species dose-dependently stimulates insulin secretion and restores GSIS suppressed by the pan-lipase inhibitor orlistat. Also, various biochemical and pharmacological experiments show that saturated 1-MAG levels species rather than unsaturated or 2-MAG species best correlate with insulin secretion. Furthermore, whole-body and β-cell-specific ABHD6-KO mice exhibit enhanced GSIS in vivo, and their isolated islets show elevated MAG production and GSIS. Inhibition of ABHD6 in low dose streptozotocin diabetic mice restores GSIS and improves glucose tolerance. Results further show that ABHD6-accessible MAGs not only enhance GSIS, but also potentiate fatty acid and non-fuel-induced insulin secretion without alteration in glucose oxidation and utilization as well as fatty acid oxidation. We have identified that MAG binds and activates the vesicle priming protein Munc13-1, thereby inducing insulin exocytosis. Based on all these observations, we propose that lipolysis-derived saturated 1-MAG acts as a metabolic coupling factor to regulate insulin secretion and ABHD6 is a negative modulator of insulin secretion. Besides its role in ß-cells, ABHD6 is also highly expressed in adipocytes and its level is increased with obesity. Mice globally lacking ABHD6 on high fat diet (HFD) show modestly reduced food intake, decreased body weight gain, insulinemia and fasting glycemia and improved glucose tolerance and insulin sensitivity and enhanced locomotor activity. In addition, ABHD6-KO mice display increased energy expenditure and cold-induced thermogenesis. In accordance with this, these mice show elevated UCP1 level in white and brown adipocytes, indicating browning of white adipocytes. The browning phenotype is reproduced in the mice either chronically treated with the ABHD6 inhibitor WWL70 or an antisense oligonucleotides targeting ABHD6. White and brown adipose tissues isolated from whole body ABHD6 KO mice show greatly elevated levels of 1-MAG, but not 2-MAG. Increasing MAG levels by either exogenous administration of 1-MAG or ABHD6 inhibition or genetic deletion induces browning of white adipocytes in a cell-autonomous manner. Further evidence indicates that 1-MAGs can transactivate PPARα and PPARγ and the browning effect induced by WWL70 or exogenous MAG is abolished by PPARα and PPARγ antagonists. In vivo administration of the PPARα antagonist GW6471 to ABHD6 KO mice partially reversed the ABHD6-KO effects on body weight gain, and abolishes the enhanced thermogenesis, white adipose browning and fatty acid oxidation in brown adipose tissue. All these observations indicate that ABHD6 regulates not only insulin and glucose homeostasis but also energy homeostasis and adipose tissue function. Thus, ABHD6-accessible 1-MAG not only acts as a metabolic coupling factor to regulate fuel and non-fuel induced insulin secretion by activating Munc13-1 in beta cells, but also regulates glucose, insulin and energy homeostasis. The latter effects are mediated at least in part via browning of white adipocytes and enhanced brown fat function through the activation of PPARα and PPARγ. Collectively these findings suggest that ABHD6 is a promising target for developing therapeutics against obesity, type 2 diabetes and metabolic syndrome.