Le trafic rétrograde permet le transport des protéines de la membrane plasmique vers le réticulum endoplasmique, via l'appareil de Golgi, évité la dégradation des lysosomes. Des études antérieures ont montré que le transport rétrograde est crucial pour les fonctions cellulaires telles que la signalisation, l'homéostasie ionique, et l'établissement de gradients du morphogène Wnt. Par ailleurs, le transport rétrograde joue un rôle essentiel dans l'internalisation cellulaire des facteurs pathogènes comme les toxines protéiques et les protéines de virus. Toutefois, la liste actuelle des protéines cargos est limitée, et il est probable que de nombreuses fonctions cellulaires du transport rétrograde restent encore à découvrir. De toute évidence, un fort besoin existe pour une caractérisation plus poussée de cette voie de transport. Dans cette étude, quatre différentes approches protéomiques ont été développées visant à identifier les protéines membranaires prenant la route du transport rétrograde: SNAP-tag, sulfatation, la FKBP, et la streptavidine. Parmi ceux-ci, l'approche SNAP-tag s'est avéré être la stratégie la plus efficace pour identifier les candidats du fret de la voie rétrograde. Cette stratégie est basée sur la modification covalente du protéome de la membrane plasmique avec un benzylguanine (BG) dérivés. Seules les protéines membranaires BG-taggées qui sont ensuite transportés par voie rétrograde peuvent coupler covalentement à une protéine de fusion de SNAP-tag localisée dans la TGN. L'approche a été validée, étape par étape, en utilisant une protéine cargo rétrograde bien étudiée, toxine Shiga sous-unité B (STxB). Nous avons pu montrer que les STxB peuvent être capturés et identifiées par l'approche SNAP-tag. Par ailleurs, couplé à la LC-MS, les candidats des nouvelle protéines de la voie rétrograde ont été identifiés. Les trois autres approches ont guidé notre choix vers la stratégie la plus efficace en protéomique, en apportant des possibilités d'expérimentation et de défauts dans les domaines de la chimie organique et en biologie cellulaire. Généralement, ce travail de thèse a permis de développer une nouvelle stratégie protéomique qui pourraient être appliquée pour identifier les nouvelles candidats de la route rétrograde. Nous avons mis au point une approche dynamique en protéomique qui complète la protéomique traditionnelle. Par ailleurs, le concept d'utiliser des outils chimiques pour étudier le transport rétrograde peut également être appliqué à d'autres voies d'endocytose.

L'EGFR est un récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase (TK) qui transduit des signaux de prolifération et de survie cellulaire. Dans les cancers du poumon, son activité est fréquemment dérégulée par surexpression et/ou par mutation au niveau de son domaine TK. Ces mutations sont principalement de deux types (EGFR-L858R et EGFR-Del19) et sont dites activatrices car elles induisent une activation constitutive des signalisations oncogéniques de l'EGFR. Elles sont aussi un facteur prédictif de réponse aux EGFR-TKIs qui inhibent spécifiquement ce récepteur. P14ARF est un suppresseur de tumeur qui restreint la prolifération cellulaire et maintient la stabilité génomique. Nous avons décrit son inactivation dans les cancers du poumon et démontré que son expression freine leur développement. Nos résultats récents montrent que l'expression de p14ARF est inhibée dans une très grande majorité d'adénocarcinomes pulmonaires présentant une mutation activatrice de l'EGFR. Sur la base de ces résultats nous avons émis l'hypothèse que l'inhibition de l'expression de p14ARF contribuerait à l'expansion clonale des tumeurs porteuses d'un EGFR muté. P14ARF pourrait ainsi être un frein à l'activité oncogénique de l'EGFR.Dans différents modèles d'adénocarcinomes pulmonaires exprimant un mutant EGFR-L858R nous montrons que l'expression transitoire de p14ARF active une signalisation pro-apoptotique dépendante de STAT3 et de Bcl2. En retour, l'EGFR inhibe l'expression de p14ARF et bloque ses fonctions pro-apoptotiques. Nous montrons aussi que l'activation de l'EGFR (sauvage ou muté) inhibe l'expression de p14ARF à un niveau transcriptionnel. Ceci implique une translocation nucléaire de l'EGFR contrôlée par les PI3Ks de classe III (Vps34) et la fixation de l'EGFR sur le promoteur de ARF. L'ensemble de ces travaux identifie pour la première fois un lien fonctionnel entre les voies de signalisation de l'EGFR et de p14ARF. Ils mettent en évidence un nouveau mécanisme de progression tumorale par lequel une signalisation nucléaire de l'EGFR inactive le suppresseur de tumeur p14ARF afin de permettre la croissance tumorale. / EGFR is a transmembrane tyrosine kinase (TK) receptor which activates proliferative and survival signals. In lung cancer, its activity is frequently deregulated by overexpression and/or mutation in its TK domain. These mutations are mainly of two types (L858R and Del19) and are called « driver mutations » because they induce constitutive activation of EGFR oncogenic signaling. They also represent a predictive responsive factor to EGFR TKIs that specifically inhibit this receptor. P14ARF is a tumor suppressor that restricts cellular proliferation and maintains genomic stability. We described its inactivation in lung cancer and demonstrated that its expression inhibits their development. Our recent results show that the expression of p14ARF is inhibited in a majority of lung adenocarcinomas expressing an activating EGFR mutation. Based on these results we hypothesized that inhibition of p14ARF expression contributes to clonal expansion of mutated EGFR-bearing tumor. P14ARF could be a break to EGFR oncogenic activity.In different models of lung adenocarcinoma expressing a L858R EGFR mutant we show that transient expression of p14ARF activates a pro-apoptotic STAT3/Bcl-2-dependent signaling pathway. In turn, EGFR inhibits the expression of p14ARF and blocks its pro-apoptotic function. We also show that EGFR (wild type or mutated) activation inhibits the expression of p14ARF at the transcriptional level. This implies a nuclear translocation of EGFR controlled by Class III PI3K (Vps34) and its fixation to the ARF promoter. This work identifies for the first time a functional link between EGFR and p14ARF signaling pathways. They highlight a new mechanism of tumor progression by which a nuclear EGFR signaling inactivates the tumor suppressor p14ARF to allow tumor growth.

Chez la levure et les mammifères le complexe rétromère est impliqué dans différentes étapes de trafic intracellulaire qui modulent divers processus cellulaires et développementaux. Chez les mammifères, le rétromère se compose des protéines Vacuolar Protein Sorting (VPS) 35, VPS26, VPS29 et d’un dimere de Sorting Nexins (SNX). Les composants du rétromère sont conservés chez les plantes et sont localisés dans le même endosome de tri. Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme d’assemblage et de recrutement du complexe à la membrane et analysé le rôle du rétromère dans le développement d’Arabidopsis. Nos resultsts montrent que chez les plantes, contrairement aux mammifères, VPS35 recrute le sous-complexe VPS à la membrane, indépendamment des SNXs. Ceci nous a permis de proposer un modèle d’assemblage du rétromère très original. L’analyse de mutants perte de fonction pour le rétromère révèle que VPS26, VPS29 et VPS35 n’ont pas de fonctions indépendantes, mais agissent ensemble dans la régulation de processus développementaux. De plus, par un crible double hybride chez la levure, nous avons isolé un interacteur de VPS35 : Ethylene Insensitive 2 (EIN2). EIN2 est une protéine localisée au Réticulum Endoplasmique et impliquée dans la voie de signalisation d’une hormone végétale : l’éthylène. Nous montrons que des mutants perte de fonction pour le rétromère présentent des défauts dans la réponse à l’éthylène, indiquant un rôle du rétromère dans la perception de cette hormone par les plantes. Ces résultats, combinés avec nos données antérieures montrant que le rétromère est impliqué dans la voie de signalisation de l’auxine, révèlent un lien entre signalisation de l’auxine et de l’éthylènevia le complexe rétromère. / In yeast and mammals, the retromer complex mediates various steps of intracellular trafficking and regulates a variety of cellular and developmental processes. In mammals, it is composed of Vacuolar Protein Sorting (VPS) 35, VPS26, VPS29 and a dimer of Sorting Nexins (SNX). Retromer components are conserved in plants and we showed that they colocalize to the same sorting endosome. In this work, we have investigated the mechanism of assembly and recruitment of the retromer to the endosomal membrane and studied its function in Arabidopsis development. We report that, unlike animals, plant VPS35 recruits the other VPS retromer components to the membrane of endosomes, independently of SNXs. This data allowed us to propose an original model of assembly of the plant retromer complex. By analyzing a series of retromer loss-of-function mutants, we show that VPS26, VPS29 and VPS35 always act together in modulating developmental processes. To identify retromer partners, we carried out a Yeast-2-Hybrid (Y2H) screen using VPS35 as a bait. We found that VPS35 can bind, among other proteins, Ethylene Insensitive 2 (EIN2). EIN2 is an Endoplasmic Reticulum-located protein involved in the signaling pathway of a plant hormone: ethylene. We demonstrate that retromer mutants are affected in ethylene signaling, which indicates that the retromer complex participates in a proper perception of ethylene by plants. Combined with our previous data in which we showed that the retromer is involved in the auxin signalling pathway, our present work reveals a link between auxin and ethylene signaling through the retromer complex.

Les toxines Shiga (Stx) sont produites par Shigella dysenteriae et certaines espèces d’E. coli transmisent aux humains par la consommation d'aliments contaminés et causant des maladies graves. La toxine Stx est libérée par les bactéries dans l'intestin et par la suite, traverse les vaisseaux sanguins en aval pour atteindre leurs principaux organes cibles, notamment les reins. Les dommages causés aux reins peuvent entraîner des complications graves notamment Le syndrome hémolytique urémique (SHU). A ce jour, il n’existe aucun traitement disponible contre le SHU. Les toxines Stx usent du transport rétrograde intracellulaire pour infester les cellules endothéliales rénales et atteindre leur cible cytosolique, l'ARN ribosomal 28S. Via un screening à haut débit, il a été démontré que le composé Rétro-2 bloque le trafic rétrograde de Stx à l'interface Endosome-TGN, sans affecter la morphologie des organites cellulaires et le trafic des protéines endogènes. Au cours de cette thèse, une analyse des relations structure fonction du composé Retro-2 nous a permis d’identifier les régions de l'inhibiteur qui sont critiques pour l'activité de protection. Nous avons identifié un dérivé dihydroquinazolinone nommé Rétro-2.1 qui est à ce jour l'inhibiteur le plus puissant contre les toxines Stx. Afin d’identifier la cible moléculaire de Retro-2.1, nous avons développé des sondes photo-activables bio-actives. En outre, les données de diffraction des rayons X ont révélé que de l'activité antitoxine réside principalement dans l’énantiomère S. (S) -Retro-2.1 est 500 fois plus puissant contre Stx (50 nM) que la molécule initiale. Cette étude peut donner lieu à un nouveau concept thérapeutique ciblant la voie de transport rétrograde de la toxine à l'intérieur de la cellule hôte. Une telle stratégie thérapeutique pourrait donc être étendue à d'autres agents pathogènes qui usent également du trafic rétrograde pour une intoxication des cellules hôtes. Ce nouveau concept thérapeutique qui permet de cibler les cellules hôtes et non l'agent pathogène représente une véritable percée dans la découverte de médicaments à large spectre et réduit le risque de développement d’une résistance chez l’agent pathogène. / Shiga toxins (Stx) are produced by Shigella dysenteriae and certain species of E. coli that can be transmitted to humans primarily through consumption of contaminated foods and may cause severe disease. Stx is released by the bacteria in the intestine and subsequently, could cross the downstream blood vessels to reach their main target organs such as kidney. Damage to the kidney can result in serious life-threatening complication hemolytic uremic syndrome, for which there is no proven safe treatment available other than supportive care. Stx invades renal endothelial cells in a retrograde manner from cell surface to the endoplasmic reticulum in order to gain access to its cytosolic target, 28S rRNA. By using HTS, it was previously demonstrated that the compound Retro-2 blocks retrograde trafficking of Stx at the early endosome-TGN interface, without affecting the morphology of cellular organelles and trafficking of other endogenous proteins. In this work, different regions of the lead inhibitor Retro-2 that are critical for the protective activity have been determined by systematic structure-activity relationship studies. It allowed us to identify a dihydroquinazolinone derivative, named Retro-2.1 that is the most potent inhibitor of Stx to date and also to develop bio-active photo-activatable probes with the aim of identifying the molecular target of Retro-2 derivatives. Further, crystal X-ray diffraction data revealed that the antitoxin activity resides mainly in the S-enantiomer. (S)-Retro-2.1 has displayed 500 fold more potency (50 nM) than parent molecule against Stx cytotoxicity. This study may result in a new therapeutic concept - targeting the retrograde transport route of toxin inside host cell - for the treatment of Stx-producing E. coli infections and could therefore be extended to other pathogens that also traffic via the retrograde transport. Such a new therapeutic concept that target the host cells and not the pathogen itself would represent a real breakthrough in drug discovery leading to broad spectrum drugs.

S. aureus sécrète de nombreux facteurs de virulence qui lui permettent de lutter efficacement contre le système immunitaire, afin de favoriser la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte. Parmi ces molécules, les leucotoxines ciblent principalement les cellules myéloïdes comme les neutrophiles, les macrophages ou encore les monocytes, et sont formées par deux sous-unités : une de classe S et une de classe F. La Leucodine de Panton et Valentine (LPV) et l’Hémolysine γ HlgC/HlgB sont deux leucotoxines dont le composant de classe S se fixe sur l’un des récepteurs du système du complément, le C5aR. Naturellement activé par l’anaphylatoxine C5a, le C5aR voit son activité modifiée lors d’une interaction avec la LPV ou HlgC/HlgB, tout du moins pour la libération du calcium intracellulaire. Ces deux leucotoxines, à l’instar du C5a, sont internalisées dans le neutrophile humain et utilisent le transport rétrograde pour atteindre l’appareil de Golgi. Elles peuvent rester dans la cellule jusqu’à 3h sans susciter la mort pour le neutrophile. Plus tard, à 6h, seule la LPV induit de l’apoptose et de la NETose. / S. aureus secretes many virulent factors which allow to efficiently fight the immune system, in a way to promote the bacterial spreading inside the host. Among these molecules, the leukotoxins target myeloid cells such as neutrophils, macrophages and monocytes, and are composed of two subunits: one of class S and one of class F. Panton and Valentine Leukocidin (PVL) and γ-Haemolysin HlgC/HlgB are two leukotoxins whose S-component binds to the C5aR, one of the complement system receptors. Naturally activated by the C5a anaphylatoxin, the activity of the C5aR is modified by the PVL and HlgC/HlgB interaction, for the intracellular calcium release. These two leukotoxins, as C5a, are internalised inside the human neutrophils and use the retrograde transport to reach the Golgi apparatus. These can rest inside the cells until 3h without neutrophil dead. Later, at 6h, only PVL induces apoptosis and NETosis.

Dans l'introduction, diverses voies de trafic intracellulaire et endocytose seront discutées. Je familiarise le lecteur avec des protéines inactivant les ribosomes, en mettant l'accent sur la structure, l'endocytose, et le trafic intracellulaire de la toxine bactérienne Shiga toxin (STX). STx et la ricine suivent la voie rétrograde pour exercer leur effet toxique sur les cellules. Ils sont respectivement, une menace maladie infectieuse pour la santé humaine et des outils potentiels pour le bioterrorisme pour lequel aucun antidote n’existe actuellement. D'un criblage à haut débit, Retro-1 et Retro-2 avaient déjà été identifiés comme de puissants inhibiteurs de la voie rétrograde à l'interface des endosomes précoces-TGN, et Retro-2 a été démontré pour protéger les souris contre la ricine. Parmi les facteurs de trafic analysés, seule la protéine SNARE syntaxine-5 a été ré- localisée dans les cellules traitées avec Rétro - 2. / In the introduction, various endocytic and intracellular trafficking pathways will be discussed. I acquaint the reader with ribosome-inactivating proteins, with emphasis on the structure, endocytosis, and intracellular trafficking of the bacterial toxin Shiga toxin (STx). STx and ricin follow the retrograde route to exert their toxic effect on cells. They are respectively, an infectious disease threat to human health and potential tools for bioterrorism for which no antidote currently exists. From a high throughput screening, Retro-1 and Retro-2 had previously been identified as potent inhibitors of the retrograde route at the early endosomes-TGN interface, and Retro-2 was demonstrated to protect mice against ricin. Of the trafficking factors analyzed, only the SNARE protein syntaxin-5 was re-localized in Retro-2 treated cells. Yet, whether syntaxin-5 is the direct target of Retro-2 and whether its re-localization was directly responsible for retrograde transport inhibition remained to be established.