Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 75-88. Publié aussi en version électronique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 78-85. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 62-66. Publié aussi en version électronique.

Introduction : Le cancer du poumon est la néoplasie la plus mortelle au Canada. La majorité des patients reçoivent leur diagnostic à un stade avancé pour lequel il n'existait que peu d'options thérapeutiques efficaces jusqu'à récemment. L'immunothérapie, sous forme de molécules ciblant un point de contrôle du système immunitaire, soit les anti-PD-1 et PD-L1, a révolutionné le traitement des patients atteints d'un cancer pulmonaire de stade avancé. En effet, ces traitements améliorent significativement leur survie tout en ayant un profil d'effets secondaires acceptable. À ce jour, le seul biomarqueur prédictif de réponse à l'immunothérapie approuvé pour l'utilisation clinique est l'immunohistochimie pour le PD-L1. Cependant, vu l'absence de données empiriques dans certaines situations cliniques, les recommandations entourant l'implantation de ce biomarqueur dans les laboratoires de pathologie se sont accompagnées de plusieurs zones grises et de contraintes. Cela avait pour effet de limiter l'accès au test de ce biomarqueur pour les échantillons contenant moins de 100 cellules tumorales et ayant plus de 3 ans ainsi qu'aux prélèvements cytologiques. De plus, l'impact de la présence d'une hétérogénéité intratumorale du marquage de PD-L1 lorsque testé sur de petits spécimens n'avait pas non plus été considéré. Objectifs : L'objectif général de cette thèse est de résoudre certaines problématiques touchant l'utilisation de l'immunohistochimie pour le PD-L1 afin d'améliorer la prise en charge du patient et d'élargir le nombre d'échantillons éligibles pour l'évaluation de ce biomarqueur par le pathologiste. Les objectifs spécifiques de ces travaux sont (1) de déterminer le résultat de l'immunohistochimie pour le PD-L1 sur des spécimens avec des caractéristiques non validées (2), de comparer le résultat entre des spécimens cytologiques et tissulaires et (3) de quantifier l'hétérogénéité du marquage de PD-L1 ainsi que son impact clinique, lorsqu'effectué sur une petite biopsie. Méthodes : 1) Une cohorte rétrospective de 1438 patients consécutifs avec un NSCLC testés pour PD-L1 a servi à mesurer la présence d'une association entre PD-L1 et les caractéristiques du spécimen; 2) 46 patients ayant des échantillons cytologiques, biopsiques et chirurgicaux appariés ont été sélectionnés pour comparer l'expression de PD-L1 entre les spécimens d'un même patient afin d'en évaluer la fiabilité sur des spécimens cytologiques. La faisabilité de l'évaluation en cytologie a été appréciée en calculant le degré d'accord intra et interobservateur avec quatre pathologistes et en estimant le degré de difficulté de lecture de chaque lame; 3) Afin de mesurer l'hétérogénéité de marquage de PD-L1, des micromatrices tissulaires ont été construites à partir d'adénocarcinomes pulmonaires de 241 patients afin de simuler la prise de multiples biopsies dans une même tumeur. L'hétérogénéité de PD-L1, définie comme un patient ayant une carotte tissulaire positive et une négative, a été quantifiée. L'impact clinique de cette hétérogénéité a été évalué en calculant le nombre de patients pouvant avoir reçu un résultat faussement négatif. Résultats : 1) 35,5 % des patients avaient un échantillon avec au moins une caractéristique non validée. Les échantillons contenant moins de 100 cellules tumorales et âgés de plus de 3 ans étaient significativement associés à des résultats négatifs pour PD-L1. L'expression de PD-L1 n'était pas différente entre les patients avec un échantillon cytologique et ceux avec un échantillon tissulaire dans cette cohorte. 2) Ces résultats pour les échantillons cytologiques ont été confirmés dans une seconde étude où le degré d'accord entre l'expression de PD-L1 obtenue sur des échantillons cytologiques et tissulaires était modéré à substantiel. Le degré d'accord interobservateur était substantiel et l'accord intraobservateur presque parfait. L'évaluation de PD-L1 en cytologie n'était pas plus difficile que sur les échantillons tissulaires. 3) 22,4 % des patients présentaient un marquage hétérogène pour PD-L1. Parmi les patients avec au moins une carotte tissulaire négative, 26,5 % avaient aussi une carotte positive et auraient pu avoir reçu un résultat faussement négatif basé sur une seule biopsie. Conclusion : Les travaux inclus dans cette thèse permettent de mieux comprendre l'impact d'évaluer l'expression de PD-L1 sur des échantillons non validés lorsqu'il n'est pas possible d'obtenir plus de matériel tumoral chez un patient. La seconde étude a contribué à élargir significativement le nombre de patients pouvant avoir accès à l'évaluation de ce biomarqueur et à potentiellement recevoir de l'immunothérapie en démontrant la fiabilité et la faisabilité de la lecture de PD-L1 en cytologie. Finalement, la troisième étude a permis de quantifier l'hétérogénéité de marquage et son impact clinique. / Introduction: Lung cancer is the deadliest cancer in Canada. The majority of patients are diagnosed with an advanced stage disease for which there was traditionally a few effective therapeutic options. Recently, immunotherapy and immune checkpoint inhibitors revolutionized the treatment of patients with advanced stage non-small cell lung cancer by significantly improving overall survival. As of now, the only predictive biomarker approved for clinical use is immunohistochemistry for PD-L1. However, given the lack of empirical data, several problems regarding the implantation of this biomarker in pathology laboratories have been reported. According to current recommendations, access to PD-L1 testing should be limited to samples containing more than 100 tumor cells and recent samples that are less than three years old. Moreover, cytology samples should not be used for PD-L1 testing. In addition, the impact of the heterogeneity of intra-tumoral PD-L1 staining when it is evaluated on small samples was not considered. Objectives: The general objective of this thesis is to address clinically relevant issues regarding the use of PD-L1 immunohistochemistry in order to improve patient management by the pathologist and to expand the number of eligible samples. The specific objectives of this work are (1) to determine the result of PD-L1 immunohistochemistry on specimens with non-validated characteristics (2), to compare PD-L1 testing results obtained on cytological and tissue specimens and (3) to quantify the heterogeneity of PD-L1 as well as its clinical impact when performed on a small biopsy. Methods: 1) A retrospective cohort of 1438 consecutive patients with NSCLC tested for PD-L1 was used to assess the presence of an association between PD-L1 and specimen characteristics; 2) 46 patients with paired cytology cell blocks, biopsy and surgical specimens were selected to compare PD-L1 expression between samples from the same patient to assess reliability of cytologic specimens. The feasibility of PD-L1 testing on cytology samples was also assessed by calculating the intra- and inter-observer agreement of four pathologists' evaluation and by estimating the degree of difficulty in reading each slide; 3) To estimate PD-L1 heterogeneity, tissue microarrays were constructed using pulmonary adenocarcinomas from 241 patients to simulate multiple biopsies sampled from the same tumor. PD-L1 heterogeneity defined as a patient with a positive and a negative core was quantified. The clinical impact of this heterogeneity was assessed by evaluating the number of patients who may have received a false negative result. Results: 1) 35.5% of patients had a sample with at least one non-validated characteristic. Samples with fewer than 100 tumor cells and specimens older than 3 years were significantly associated with negative PD-L1 staining. PD-L1 expression was not different between patients with a cytology sample and those with a tissue sample in this cohort; 2) The agreement between PD-L1 expression obtained in cytological and tissue samples was moderate to substantial. The degree of inter-observer agreement was substantial, and the intra-observer agreement was almost perfect. PD-L1 assessment in cytology was no more difficult than in tissue samples. 3) 22.4% of patients presented heterogeneous staining for PD-L1. Among patients with at least one negative core, 26.5% also had a positive core and could have received a false negative result based on a single biopsy. Conclusion: The findings included in this thesis provide a better understanding of the impact of evaluating PD-L1 expression on non-validated samples when it is not possible to obtain more tumor material from a patient. The second project contributed to expanding the number of patients who could have access to PD-L1 testing by demonstrating the reliability and feasibility of cytology samples. Finally, the third study quantified the heterogeneity of PD-L1 staining and estimated its clinical impact.

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Les ectonucléotidases sont des familles d’enzymes présentes au niveau de la membrane cellulaire et ayant pour rôle d’hydrolyser les nucléotides en nucléosides. L’objectif principal de cette étude était d’abord de caractériser des anticorps produits dans le laboratoire contre les ectonucléotidases afin de les utiliser pour définir l’expression de ces enzymes dans le cordon ombilical et dans le rein humain par immunohistochimie. Les ectonucléotidases qui nous ont intéressées dans ce travail sont les Nucléosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) de la membrane cytoplasmique, soient les NTPDase1, -2, -3, -8, ainsi que l’ecto-5'-Nucléotidase (CD73). Nous avons aussi localisé ces enzymes dans ces tissus par histochimie enzymatique pour vérifier l’immunolocalisation obtenue et aussi pour vérifier si ces enzymes sont bel et bien actives dans les structures détectées par immunohistochimie. Nos résultats suggèrent que, dans le cordon ombilical, les NTPDase1, -2, -3, et l’ecto-5'-Nucleotidase sont localisées au niveau de l’endothélium des artères et de la veine et au niveau de la gelée de Wharton. Au niveau du rein, la NTPDase1 est localisée dans les vaisseaux sanguins, la NTPDase2 est localisée sur la face apicale des tubules rénaux, la NTPDase3 ainsi que la NTPDase8 sont localisées dans les tubules rénaux. L'identification de la localisation cellulaire de ces enzymes dans le cordon ombilical et dans le rein humain pourra nous aider à définir le rôle de ces enzymes dans ces organes et par extension pourra nous informer sur le rôle potentiel des nucléotides extracellulaires dans ces tissus. / Ectonucleotidases are families of enzymes present in the cell membrane and whose role is to hydrolyse the nucleotides into nucleosides. The main objective of this study was to characterize antibodies produced in the laboratory against ectonucleotidases and then to evaluate the expression of these enzymes in the umbilical cord and in the kidney by immunohistochemistry. The ectonucleotidases that we have selected for this work were the Nucleosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) of the cytoplasmic membrane, namely NTPDase1, -2, -3, -8, as well as ecto-5'-Nucleotidase (CD73). In addition, we have performed enzymatic histochemistry to verify the immunolocalization obtained and also to verify if these enzymes are active in the structures detected by immunohistochemistry. Our results suggest that, in the umbilical cord, NTPDase1, -2, -3, and ecto-5'-Nucleotidase are located at the endothelium of the arteries and vein and in Wharton frost. In the kidney, NTPDase1 is located in the blood vessels, NTPDase2 is located on the apical surface of the renal tubules, NTPDase3 as well as NTPDase8 are located in the renal tubules. The current identification of these enzymes at the protein and activity level in the umbilical cord and in the kidney is a prerequisite with the goal to define the role of these enzymes and in extension of extracellular nucleotides in these tissues.

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