Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2003. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las neuronas son células que permiten la conducción nerviosa mediante potenciales de acción. Para lograr esto, evolucionaron y desarrollaron una proyección altamente especializada llamada axón, en la cual se concentran canales iónicos de membrana que permiten el flujo de iones. Los canales de sodio activados por voltaje (Nav) son los canales iónicos que permiten la generación y propagación de los potenciales de acción. En el caso de los axones mielinizados, estos se concentran en el segmento inicial del axón y en los nodos de Ranvier, constricciones simétricas de la vaina de mielina donde se regenera el potencial de acción. Su abundancia y distribución a lo largo del axón no son fijas, sino que varían durante procesos como desarrollo y regeneración axonal. Se sabe que los axones son capaces de sintetizar proteínas localmente. A la fecha se ha reportado que la síntesis axonal de proteínas se ve aumentada en respuesta a daño axonal. Sin embargo, se desconoce si proteínas de membrana también son sintetizadas y traficadas localmente. En este contexto se ha reportado un aumento de Nav luego de daño axonal. El objetivo de este trabajo es establecer si la síntesis axonal de proteínas y la ruta secretoria local contribuyen a reestablecer los niveles de Nav en nodos de Ranvier luego de daño axonal. Para evaluar esto, se utilizó un modelo de daño axonal generado a partir de la transección de nervio ciático de rata. Se inhibió la síntesis y ruta secretoria axonal mediante la aplicación in vivo de cicloheximida (CHX) y brefeldina A (BFA) respectivamente. Ambos fármacos fueron inyectados independientemente en el nervio transectado. Se evaluó su efecto sobre la abundancia y distribución de Nav mediante inmunofluorescencia y western blot. En primer lugar, se corroboró que el daño axonal produce un aumento de los Nav en los nodos de Ranvier. Esta sobreexpresión de los canales de sodio activados por voltaje producto de daño axonal es bloqueada al inhibir la síntesis y ruta secretoria axonal con herramientas farmacológicas. Estos datos sugieren la existencia de una ruta biosintética y de tráfico axonal capaz de mediar el rápido aumento de Nav en procesos de regeneración axonal / Neurons are highly polarized cells that evolved to transmit nerve impulses. To achieve this function, they developed a process called the axon that concentrates ion channels. Voltage gated sodium channels (Nav) are responsible for generating and propagating action potentials. In myelinated axons, these proteins are concentrated at the axon initial segment (AIS) and at the nodes of Ranvier. Nodes are symmetric constrictions of the myelin sheath where action potentials are regenerated. The availability and distribution of Nav are plastic, meaning they change during developmental stages or regeneration. It is currently known that axonal protein synthesis in enhanced in response to axonal injury. However, it is still unknown whether local protein synthesis controls the abundance of membrane proteins in the axon and if Nav are subject to this regulation. The aim of this work is to study if Nav upregulation after axonal injury is related with axonal protein synthesis and the axonal secretory route. To evaluate this, we used an axonal injury model generated from the transection of the rat sciatic nerve. Local synthesis and the function of the axonal secretory route were inhibited in vivo using cycloheximide (CHX) or brefeldin A (BFA) respectively. Both drugs were injected in the nerve right after transection. The effect on Nav was evaluated by immunofluorescence and western blot. First, we corroborated that axonal injury enhances Nav at nodes of Ranvier. This upregulation disappears when axonal protein synthesis or the local secretory route were inhibited. Our data suggest the existence of an axonal synthetic and trafficking route capable of mediating the fast Nav upregulation during axonal regeneration / ICM, número de proyecto P09-015-F; Fondecyt, 1140617

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Ce mémoire traite de l’organisation anatomique et fonctionnelle de la voie corticosubthalamique chez le singe macaque. Cette projection neuronale, aussi connue sous le nom de voie hyperdirecte, a été étudiée grâce à une méthode de marquage neuronal unitaire. L’injection d’un traceur antérograde, la biotine dextran amine, dans la couche V du cortex moteur primaire de quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis) par microiontophorèse nous a permis de tracer en détails l’arborisation axonale de 28 axones corticofuges composants la voie hyperdirecte. Les principaux résultats de cette étude montrent que la projection corticosubthalamique est essentiellement ipsilatérale et que la population de neurones à l’origine de cette projection est indépendante de celle composant la voie corticostriée. Après avoir quitté le cortex, les axones de fort calibre (jusqu’à 3.7 μm de diamètre) de la voie hyperdirecte voyagent le long de la capsule interne jusqu’au tronc cérébral. À la hauteur du noyau subthalamique, ces axones émettent des collatérales de plus petit diamètre qui innervent non seulement le noyau subthalamique, mais également la zona incerta, le noyau rouge, les noyaux pontiques supérieurs et le noyau réticulaire du thalamus. Dans le noyau subthalamique, les fines collatérales de la voie hyperdirecte s’arborisent profusément au sein du territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus dans le cadre de la présente étude par marquage neuronal unitaire révèlent, pour la toute première fois chez le singe, que la voie « hyperdirecte » est majoritairement « indirecte » puisque celle-ci provient essentiellement de collatérales d’axones principaux qui innervent les étages inférieurs du tronc cérébral. En outre, cette projection ne semble pas exclusive au noyau subthalamique puisque les axones qui la composent ciblent plusieurs autres régions motrices cérébrales. / This thesis deals with the anatomical and functional organization of the corticosubthalamic pathway in macaque monkey. This neuronal projection, which is also known as the hyperdirect pathway, was investigated with the help of a single-cell labeling method. An anterograde tracer, biotin dextran amine, was microiontophoretically delivered in layer V of the primary motor cortex in four cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), allowing us to trace in detail the axonal arborization of 28 corticofugal axons forming the hyperdirect pathway. The main results of this study indicate that the corticosubthalamic pathway is essentially ipsilateral and that the population of neurons at the origin of this projection is distinct from those giving rise to the corticostriatal projection. After leaving the cortex, the large caliber axons (up to 3.7 μm in diameter) that form the hyperdirect pathway travel along the internal capsule, heading toward the brainstem. At the subthalamic nucleus level, these axons emit some small-diameter collaterals that innervate the zona incerta, the red nucleus, the superior pontine nuclei, the thalamic reticular nucleus, and the subthalamic nucleus. In the latter structure, thin collaterals of the corticosubthalamic projection arborize principally within its sensorimotor territory. The results of the present single-axons tracing study reveal, for the very first time in primates, that the so called “hyperdirect” pathway is largely “indirect” since it is mainly composed of collaterals of main axons that travel downward to the brainstem. Moreover, this projection does not seem exclusive to the subthalamic nucleus since it targets several other cerebral motor nuclei.

Les neurones dopaminergiques mésodiencephaliques jouent un rôle central dans la régulation d'un large éventail de fonctions cérébrales allant des mouvements volontaires aux comportements associés. Ces fonctions sont régulées par des sous-types distincts de neurones dopaminergiques situés à la base du cerveau soit l'air tegmentaire ventrale et la substance noire compacte. Ces neurones innervent différentes régions du cerveau en formant les voies nigrostriatales, mésolimbiques et mésocorticales. Les mécanismes moléculaires qui régissent la formation de voies dopaminergiques dans le cerveau sont en grande partie inconnus. L'autophagie est la principale voie de renouvellement cytoplasmatique et s'est révélée importante pour le développement du système nerveux. Nous montrons ici que les protéines nécessaires à l'autophagie sont présentes dans les cônes de croissance des neurones dopaminergiques et qu'elles sont régulées temporellement pendant leur développement. En outre, le niveau d'autophagie change de façon dynamique dans les neurones dopaminergiques en réponse à des signaux de guidage chimio-répulsifs et chimio-attractifs. Pour caractériser le rôle de l'autophagie dans la croissance / guidage des axones dopaminergiques, nous avons utilisé la méthode d'édition du génome CRISPR-Cas9 ainsi qu'une souris knock-out conditionnelle (cKO) pour les gènes essentiels de l'autophagie (Atg12, Atg5) spécifiquement dans les neurones dopaminergiques. Les axones ATG5 cKO présentent des renflements axonaux et une diminution du nombre de ramifications in vitro et in vivo, probablement en raison de la formation de boucles de microtubules aberrantes. De manière frappante, la suppression de gènes liés à l'autophagie a complètement bloqué la réponse des neurones dopaminergiques aux signaux de guidage chimio-répulsifs et chimio-attractifs. Nos données démontrent que l'autophagie joue un rôle central dans la régulation du développement des neurones dopaminergiques et dans l'amélioration de notre compréhension des processus physiologiques régissant la croissance et le guidage axonal. / Mesodiencephalic dopamine neurons play a central role in the regulation of a wide range of brain functions ranging from voluntary movement to reward associated behaviours. These functions are regulated by distinct subtypes of dopamine neurons located in the ventral midbrain substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area that project to different brain regions by forming the nigrostriatal, mesolimbic, and mesocortical pathways. The molecular mechanisms that drive the midbrain dopaminergic trajectory formation are largely unknown. Autophagy is the major cytoplasmatic turnover pathway and has been shown to be important to neural system development. Here we show that autophagy machinery is present in the growth cones of dopaminergic neurons and is temporally regulated during their growth and guidance. Furthermore, autophagy level changes dynamically in dopaminergic neurons in response to both chemo-repulsive and chemo-attractive guidance cues. To characterize the role of autophagy in dopaminergic axon growth/guidance, we used CRISPR-Cas9 gene editing as well as a conditional knock-out mice (cKO) for the essential autophagy genes (Atg12, Atg5) deleted in dopaminergic neurons. ATG5 cKO axons exhibit axonal swellings and decreased branching in vitro and in vivo, likely due to aberrant microtubule looping. Strikingly, deletion of autophagy-related genes blunted completely the response of dopaminergic neurons to chemo-repulsive and chemo-attractive guidance cues. Our data demonstrate that autophagy plays a central role to tightly regulate dopaminergic neurons development and improve our understanding about basic physiological processes orchestrating axonal growth and guidance.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Titre de l'écran-titre (visionné le 12 janvier 2009). Bibliogr.

Une précision à l’échelle de la milliseconde dans le transfert d'informations entre les neurones est essentielle pour la synchronisation et la plasticité des circuits neuronaux dans le cerveau. Les axones sont des prolongements neuronaux qui assurent la communication via des impulsions électriques ou des potentiels d’action (PA). A cause du manque de myéline et de leur diamètre très fin, les axones de l'hippocampe propagent les PA lentement et ainsi générer des délais de conduction très long (jusqu’à 100 ms) qui sont traditionnellement considérés comme invariants. Cependant, plusieurs études ont montré que l'activité change la morphologie des axones et module le temps de latence de la transmission. Il convient donc de se demander si le diamètre des axones varie en fonction de l'activité pouvant influencer lapropagation des PA.Les diamètres des axones non-myélinisés de l’hippocampe (compris entre 100-350 nm) sont généralement trop petits pour être résolu par la microscopie photonique conventionnelle. Le développement récent de l’imagerie super résolution STED permet désormais l'observation de la dynamique de leur morphologie détaillée dans le tissu vivant. En combinant la microscopie STED, l’électrophysiologie avec enregistrements en champs et patch-clamp dans des tranches de cerveau de souris et des simulations informatiques, nous avons découvert que les axones du CA3 subissent un élargissement de leur diamètre après l'induction de la potentialisation à long terme (PLT). Nous démontrons que cet élargissementde diamètre augmente la vitesse de conduction des PA. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que les axones peuvent réguler leur diamètre de manière dynamique changeant le délai de conduction des PA, ce qui modifie le timing du transfert d’information dans les circuits neuronaux. Cette étude suggère l’existence d’un nouveau type de mécanisme structurel dans le compartiment axonal jouant un rôle pour la plasticité neuronale. / Millisecond timing precision in the transfer of information between neurons is essential for the synchrony and plasticity of neural circuits in the brain. Axons are neuronal extensions that ensure the communication via brief electrical impulses called action potentials (AP). Because they are unmyelinated and are extremely thin, hippocampal axons propagate APsslowly and thus generate long delays of conduction (up to 100 ms) that are traditionally considered invariant. However, recent studies have shown that activity changes the morphology of axons and modulate the latency of transmission, thus raising the question whether axons undergo activity-dependent structural changes that could influence the propagation of APs. The diameter of hippocampal axons (ranging between 100-350 nm) are usually too thin to be properly resolved by conventional light microscopy. However, the development of super resolution STED imaging now enables the observation of their detailed morphological dynamics in living tissue. Using a novel combination of STED microscopy, field recordings, patch-clamp electrophysiology in mouse brain slices and computer simulations we discovered that CA3 axons undergo long-lasting enlargement in their diameter after the induction of long term potentiation (LTP). We provide strong evidence that this diameter enlargement increases AP conduction velocity. Taken together, our findings indicate that axons can dynamically tune AP propagation delays by changing their diameters, thereby altering the timing of information transfer in neural circuits. This study suggests a novel and powerful structural mechanism for neural plasticity.

Encore aujourd'hui, les lésions de la moelle épinière représentent un défi colossal pour la science et la médecine. La découverte d'un traitement efficace nécessitera un approfondissement des connaissances sur les processus cellulaires et moléculaires qui sont déclenchés à la suite de la lésion, notamment concernant la réponse inflammatoire et la dégénérescence wallérienne puisque ces deux réponses pourraient influencer la régénérescence d'axones lésés. À ce sujet, nous avons récemment démontré qu'il est possible d'induire une déplétion importante des cellules myéloïdes CD Il b + chez des souris transgéniques exprimant une forme mutée du gène suicide HSV -TKmt 30 sous le contrôle du promoteur CD Il b, un promoteur spécifique aux macrophages et aux granulocytes. Nos résultats indiquent que les cellules CD Il b + sont essentielles à la régénérescence d'axones périphériques et centraux en favorisant l'élimination des débris de myéline et des inhibiteurs de croissance axonale associés à ceux-ci de même que via la synthèse de facteurs neurotrophiques et pro-angiogéniques.

OBJECTIFS: La libération de dopamine par les afférences à sérotonine (5-HT) du striatum constitue un déterminant pré-synaptique important des dyskinésies induites par la L-Dopa (DILs), un effet délétère du traitement pharmacologique de la maladie de Parkinson. En effet, les axones 5-HT seraient en mesure de libérer de façon non-physiologique de la dopamine lorsque la L-Dopa est administrée au patient, contribuant ainsi à l’expression des DILs. Certaines afférences striatales 5-HT contiennent un transporteur vésiculaire du glutamate (VGluT3) et nous croyons que sa présence puisse avoir un effet synergique sur la libération de dopamine. L’objectif général de ce mémoire est donc d’évaluer la quantité de VGluT3 présent au sein des axones 5-HT et de mesurer son implication dans l’expression des DILs. MÉTHODES : Dix-huit souris C57/Bl6 ont été séparées en trois groupes expérimentaux. Douze souris ont reçu une injection intracérébrale de 6- hydroxydopamine (6-OHDA) dans le faisceau prosencéphalique médian afin de léser les afférences dopaminergiques du striatum. Six souris lésées ont reçu des injections systémiques de L-Dopa (12 jours, 1 fois/jour). Six autres souris ont reçu une injection intracérébrale du véhicule afin de servir de contrôle. La sévérité des mouvements involontaires anormaux induits par la L-Dopa (équivalent des dyskinésies) a été quantifiée selon une échelle reconnue. Un double marquage en immunofluorescence pour le transporteur membranaire de la 5-HT (SERT) et le VGluT3 a permis d’évaluer la densité des varicosités SERT+ et SERT+/VGluT3+ dans le striatum dorsal et de comparer ces données entre les trois groupes expérimentaux. RÉSULTATS: Chez les trois groupes de souris, un faible pourcentage des varicosités axonales 5-HT sont également VGluT3+. Ces varicosités doublement marquées sont souvent retrouvées sur une même branche axonale. Aucune différence significative n’a été observée entre les trois groupes expérimentaux en ce qui a trait à la proportion de varicosités SERT+ qui contiennent le VGluT3+. CONCLUSION: Nos données expérimentales ne nous permettent pas de conclure que la densité des varicosités axonales SERT+ ou SERT+/VGluT3+ au sein du striatum dorsal varie en fonction de la sévérité des mouvements involontaires anormaux induits par l’administration de L-Dopa. / Objectives: The release of dopamine by serotonin (5-HT) afferent projections of the striatum is known to be a major pre-synaptic determinant of L-Dopa-induced dyskinesia, a debilitating side effect of the pharmacological treatment of the Parkinson’s disease. The fact that 5-HT axons are able to release dopamine in a nonphysiological manner following the administration of L-Dopa might lead to the expression of dyskinesias. Some striatal 5-HT axons are known to contain VGluT3 and we hypothesize that this vesicular glutamate transporter has a synergic effect on dopamine packaging into synaptic vesicles and its release. The main goal of this research project is to measure VGluT3 in 5-HT striatal afferent projections and to evaluate its role in the expression of dyskinesias. Methods: Eighteen C57Bl6 mice were divided in 3 experimental groups. Twelve mice received intracerebral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in the medial forebrain bundle to lesion the striatal dopaminergic afferent projections. Systematic daily injections of L-Dopa (during 12 days) were administrated in 6 of these 6-OHDA-lesioned mice. The other 6 mice received injections of the vehicle only and served as controls. The abnormal involuntary movements (the equivalent of dyskinesias in primates) were scored using a well-known and widely used motor scale. Double immunofluorescence for the 5-HT membrane transporter (SERT) and VGluT3 was performed to evaluate the density of immunolabeled axon varicosities and assess statistical differences between the 3 experimental groups. Results: Among the 3 groups, only a small percentage of 5-HT axonal varicosities express VGluT3 and these doubly labeled varicosities often occur along the same axonal branch. There is no significant difference between the 3 experimental groups regarding the density of SERT or SERT/VGluT3 axon varicosities in the dorsal striatum. Conclusion: Our data indicate that the density of SERT or SERT/VGluT3 immunolabeled axon varicosities in the dorsal striatum is not correlated with the severity or the expression of abnormal involuntary movement following L-Dopa administration