Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l’homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l’apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L’expression de ces propriétés est induite par l’environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d’être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides β-amyloïde (Aβ) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d’être à l’origine de l’accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d’Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l’implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l’implication du récepteur « receptor for advanced glycation end-products » (RAGE) dans l’entrée vers le compartiment cérébral des peptides Aβ. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L’implication de pompes d’efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la « breast cancer resistance protein » (BCRP) dans la restriction de l’influx des peptides Aβ a également été mise en évidence. D’autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur « low density lipoprotein receptor-related 1 » (LRP1) n’est pas impliqué dans l’efflux des peptides Aβ. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques. / The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid β (Aβ) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of « receptor for advanced glycation end products » (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae’s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and « breast cancer resistance protein » (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Aβ peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that « low density lipoprotein receptor related-1 » (LRP1) is not involved in the efflux of Aβ peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.

L'utilisation récente des nanoparticules (NPs) comme vecteurs pour l'imagerie et l'adressage d'agents thérapeutiques en nano-médecine nécessite la compréhension de leurs mécanismes d'internalisation et de transport au niveau des barrières biologiques. Dans ce contexte, l'objectif de cette étude est de caractériser l'interaction et la transcytose de NPs de silice fluorescentes en fonction de leur taille (15, 50 et 100 nm) dans un modèle in-vitro de barrière endothéliale pulmonaire humaine. L'internalisation et le transport trans-endothélial des NPs a été analysé quantitativement à l'échelle nanométrique par microscopie électronique à transmission (MET) combinée à de la stéréologie. Un transport trans-endothélial a été observé pour toutes les tailles de NPs. Néanmoins, l'analyse de la distribution intracellulaire révèle une tendance à l'accumulation dans les voies de dégradation cellulaires pour les NPs de 50 et 100 nm. Cette accumulation est moindre pour les NPs de 15 nm. L'internalisation des NPs a également été analysée par cytométrie en flux et MET en présence de différents inhibiteurs de l'endocytose dans le but d'identifier leurs voies d'internalisation. En fonction de la taille des NPs, les mécanismes d'endocytose varient, suggérant une dépendance du transport trans-cellulaire à certains mécanismes d'endocytose. L'internalisation des NPs de 15 nm par la voie d'endocytose cavéole dépendante pourrait ainsi expliquer l'efficacité de leur transport du côté basal. Les méthodologies développées pour l'étude du transport trans-cellulaire des NPs de silice peuvent être appliquées à l'étude de NPs synthétiques plus complexes ou de NPs biologiques, telles que les lipoprotéines de basse-densité, et ce dans un contexte pathologique. / The recent use of nanoparticles (NPs) as carriers for imaging and delivery of therapeutics agents in nanomedecine involves understanding their endocytosis and transcytosis mechanisms at biological barriers. In this context, the aim of this study was to characterize the interaction and transcytosis of fluorescent silica NPs in function of their size (15, 50, and 100 nm) in an in-vitro model of human pulmonary endothelial barrier. NPs internalization and trans-endothelial transport has been quantitatively analyzed at nanometer resolution using transmission electron microscopy (TEM) combined with stereology. Trans-endothelial transport has been observed for each size of NPs. However cellular distribution analysis shows an accumulation in the cellular degradation pathways for 50 nm and 100 nm NPs. Whereas 15 nm NPs are less accumulated. NPs uptake was also analyzed by flow cytometry and TEM in the presence of different inhibitors to decipher NPs internalization pathways. Depending on NPs size, the involved endocytosis pathways were different, suggesting a dependency of trans-cellular transport toward endocytic mechanisms. The specific internalization of 15 nm NPs by the caveolin dependant pathway could explain the efficacy of their release at the basal side. Techniques developed for the study of the trans-cellular transport of silica NPs can also be applied to more complex synthetic NPs or biological NPs, such as low-density lipoproteins, in a pathological context.

HIV est principalement transmis par voie sexuelle. Bien que les stratégies de prévention basées sur les antirétroviraux (TasP et PrEP) soient efficaces, d'autres approches (en particulier vaccinales) restent d' actualité.Dans la première partie de ce travail, nous avons caractérisé le réservoir séminal de HIV chez des patients chroniquement infectés et sous trithérapie antirétrovirale (TARV). Dans le sperme, HIV est présent sous forme libre et/ou associée aux NSMC. Ces deux formes peuvent être transmises. Le TARV réduit la quantité de virus libre dans le sperme, sans éliminer le virus associé aux NSMC. A heure du TasP, comme meilleur outil de prévention de la transmission sexuelle, mieux caractériser l'état de ce virus résiduel (latent, réplicatif, défectif ?) est nécessaire. Dans notre travail, le virus associé aux NSMC n'a pas été réactivé, laissant supposer que le virus résiduel dans les NSMC de patients sous TARV au long cours, peut être défectif. Ces données restent à confirmer dans de plus grandes cohortes.Dans la deuxième partie du travail, nous avons caractérisé sur le plan isotypique et fonctionnel, les anticorps dirigés contre HIV du sperme. L'objectif est de mettre en évidence des anticorps « large spectre » neutralisant HIV, et/ou inhibant la transcytose, et/ou capables d'ADCC et ciblant les souches virales potentiellement transmissibles par voie sexuelle. Nous avons identifié dans le plasma séminal de certains patients des anticorps neutralisant des souches X4 tropiques, alors que les souches majoritairement transmises par voie sexuelle sont R5 tropiques. Nous avons observé la capacité d' anticorps dirigés contre HIV du plasma séminal à traverser un épithélium monocouche. Le rôle protecteur ou facilitateur est à préciser. Des anticorps protecteurs pourraient être utilisés dans des formulations de type microbicides ou en immunothérapie et contribuer également à un développement de vaccin après identification des épitopes cibles. / HIV new infections are mostly related to sexual transmission. Semen contains HIV free particles and cell-associated HIV. Both forms are sexually transmitted. Although PrEP and TasP are efficient to prevent HIV sexual transmission, other strategies like a Vaccine remain needed.In a first part, we studies HIV reservoir in HIV-infected patients receiving combined antiretroviral treatment (cART) in semen. cART reduced HIV viral load in semen, but had a no activity against cell-associated HIV. We tried to reactivate HIV cell reservoir in semen to better characterize its role. We did not observe any reactivation; HIV reservoir in semen might be mostly latent, or defective. This observation should be confirmed in larger cohort of patients.In a second part, we aimed to study the prevalence of anti-HIV antibodies in semen and their role in sexual transmission. Semen of HIV-infected men contains anti-HIV immunoglobulins (Igs), mostly IgG. We observed that unspecific Igs (IgG, IgAl, IgA2) and anti-HIV IgG and IgA were able to transmigrate across an epithelium monolayer mimicking endocervix. This transmigration property may facilitate HIV transcytosis. We also observed a neutralizing activity by Igs purified from semen of 2 chronically infected patients against a X4-tropic viral strain. Seminal anti-HIV may exhibit a dual role (facilitating or limiting) HIV sexual transmission. Protective antibodies purified from semen might be used in preventive strategies like microbicides or serotherapy, and may help to develop vaccine after identification of their epitopes.

La Protéine Prion (PrP) est une glycoprotéine ubiquitaire attachée au feuillet externe de la membrane plasmique par une ancre glycosylphosphatidylinositole (GPI). Cette dernière est l’agent infectieux responsable de la maladie Creutzfeld-Jacob ou « maladie de la vache folle ». Cette protéine existe sous sa forme cellulaire mais également sous sa forme infectieuse, nommée PrPSc (Scrapie). Alors que la fonction de PrPSc est établie au cours de la pathogenèse, la fonction de la protéine cellulaire est beaucoup plus énigmatique notamment chez les mammifères. Il est clairement admis que la forme infectieuse découle d’un changement de conformation de la forme cellulaire. Ainsi afin de mieux appréhender le rôle de la protéine prion dans les cellules saines mais également lors de la pathogenèse il apparaît essentiel d’étudier le trafic de cette protéine. La protéine prion est exprimée dans les cellules neuronales qui sont comme les cellules épithéliales des cellules polarisées. J’ai au cours de ma thèse étudié le trafic de la protéine prion dans les cellules polarisées MDCK. MDCK est la lignée épithéliale sur laquelle nous avons la plus grande connaissance. Dans mon travail j’ai utilisé des cellules MDCK polarisées classiquement en culture bidimensionnelle (2D) mais également en culture tridimensionnelle (3D) où les cellules forment des kystes, structures hautement polarisées, physiologiquement proches de l’épithélium in vivo. Il apparaît que dans les cellules MDCK polarisées sur filtre (en 2D) la localisation de la PrP est controversée. Nous avons trouvé que, contrairement à la majorité des protéines à ancre GPI, la PrP suit la voie de transcytose. La PrP qui se retrouve à la membrane basolatérale est transcytosée vers la membrane apicale. De plus la PrP envoyée à la surface apicale est clivée (clivage alpha) générant deux fragments distincts : le fragment C1, pourvu de l’ancre GPI qui reste associé à la surface apicale et le fragment soluble N1 qui est sécrété dans le milieu de culture des cellules MDCK cultivées en 2D ou dans le lumen des cellules MDCK cultivées en 3D. Mon travail permet de mieux comprendre les études réalisées auparavant mais surtout révèle l’existence d’un mécanisme de transcytose de la protéine prion dans les cellules épithéliales. Cette information est essentielle et nous permet de supposer que ce mécanisme pourrait être également utilisé par les cellules neuronales. / The Prion Protein (PrP) is a ubiquitously expressed glycosylated membrane protein attached to the external leaflet of the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol anchor (GPI). While the misfolded PrPSc scrapie isoform is the infectious agent of “prion diseases” the cellular isoform (PrPC) is an enigmatic protein with unclear function. Prion protein has received considerable attention due to its central role in the development of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) known as “prion diseases”, in animals and humans. Understanding the trafficking, the processing and degradation of PrP is of fundamental importance in order to unravel the mechanism of PrPSc mediated pathogenesis, its spreading and cytotoxicity. The available data regarding PrP trafficking are contradictory. To investigate PrP trafficking and sorting we used polarized MDCK cells (two-dimensional and tree-dimensional cultures) where the intracellular traffic of GPI-anchored proteins (GPI-APs) is well characterized. GPI-APs that are sorted in the Trans Golgi Network follow a direct route from the Golgi apparatus to the apical plasma membrane. The exception to direct apical sorting of native GPI-APs in MDCK cells is represented by the Prion Protein. Of interest, PrP localization in polarized MDCK cells is highly controversial and its mechanism of trafficking is not clear. We found that full-length PrP and its cleavage fragments are segregated in different domains of the plasma membrane in polarized cells in both 2D and 3D cultures and that the C1/PrP full-length ratio increases upon MDCK polarization. We revealed that differently from other GPI-APs, PrP undergoes basolateral-to-apical transcytosis in fully polarized MDCK cells and is α-cleaved during its transport to the apical surface. This study not only reconciles and explains the different findings in the previous literature but also provides a better picture of PrP trafficking and processing, which has been shown to have major implications for its role in prion disease.

La distribution de principes actifs dans le système nerveux central (SNC) est entravée par la présence d'une barrière physiologique, la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'endothélium cérébral est pourvu d'un large éventail de systèmes de transport, parmi lesquels la trancytose récepteur-dépendante, qui peut être mise à profit pour vectoriser toute une gamme d'agents thérapeutiques vers le SNC de manière non invasive. Dans le cadre de cette approche, le LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), exprimé à la surface de la BHE, est une cible particulièrement intéressante. L'objectif de ce travail est le développement de nouveaux ligands du LDLR en tant que vecteurs potentiels de la BHE. Le criblage d'une librairie de peptides aléatoires dirigée contre le LDLR a permis l'identification d'un peptide 15-mer cyclique ayant une haute affinité in vitro. Une étude des relations structure/activité a ensuite été menée afin d'améliorer l'affinité pour le LDLR et d'augmenter la stabilité plasmatique de ce peptide. Cette étude a abouti à l'identification d'un nouveau peptide « lead » qui a été conjugué à des molécules actives afin d'évaluer la capacité du peptide à vectoriser un principe actif à travers la BHE après administration in vivo chez la souris. / Drug delivery to the central nervous system (CNS) is hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB). The brain endothelium is endowed with a series of transport systems, including receptor-mediated transcytosis. This system can also be used to transport therapeutics into the brain as a non-invasive manner. Among receptors expressed on the BBB, the low density lipoprotein receptor (LDLR) is relevant as a drug delivery system. This project is dedicated to the development of new peptide-based ligands of LDLR as potential BBB-vectors. The screening of a random peptide library directed to the LDLR led to the identification of hits such as a cyclic 15-mer peptide with high in vitro affinity. A structure/activity relationship study was then carried out in order to improve its affinity towards the LDLR and to increase its plasmatic stability. This study led to the identification of a new lead peptide which was conjugated to bioactive compounds in order to assess the ability of our peptide to shuttle a drug across the BBB following in vivo administration in mice.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), produites par C. botulinum, sont responsables du botulisme humain et animal. Dans sa forme naturelle, le botulisme résulte le plus souvent d’une absorption des toxines botuliques à partir du tube digestif après ingestion d’aliments contaminés par la toxine et C. botulinum. L’intoxination peut être divisée en 4 grandes étapes : production de toxine par la bactérie, ingestion d’aliments contenant la toxine préformée, passage de la neurotoxine à travers la barrière intestinale et action protéolytique aux terminaisons nerveuses. La régulation de la production des toxines et le passage des neurotoxines botuliques à travers la barrière intestinale sont mal compris. BoNT s’associe à des protéines non toxiques (NAPs) pour former des complexes de différentes tailles. Les gènes codant les BoNTs et NAPs sont regroupés sur le locus botulique et leur expression est contrôlée positivement par le facteur sigma alternatif BoTR/A. La toxinogénèse chez C. botulinum est contrôlée par un réseau complexe de régulateurs incluant au moins 3 systèmes à deux composants (TCS), identifiés pas la méthode d’ARN antisens, qui régulent positivement la production de complexe botulique indépendamment de BoTR/A. D’autre part, l’entrée de BoNT/B dans la barrière intestinale a été suivie à l’aide du fragment HcB marqué en fluorescence dans une anse intestinale ligaturée de souris. Des analyses en microscopie à fluorescence, immunohistochimie et microscopie électronique ont permis de mettre en évidence que HcB transcytose à travers les entérocytes par une voie d’endocytose dépendante de la dynamine. HcB cible les terminaisons nerveuses acétylcholinergiques de la lamina propia des villosités et gagne les neurones acétylcholinergiques et sérotoninergiques de la sous-muqueuse et de la musculeuse en seulement 10 minutes. Une étude in vitro réalisée sur cellules intestinales (m-ICcl2) montre que l’entrée de HcB est dépendante de récepteurs gangliosidiques GD1b/GT1b présents à la surface des cellules mais pas de la synaptotagmine II qui est requise pour l’entrée de BoNT/B dans les cellules neuronales. / Botulinum neurotoxins (BoNTs), produced by C. botulinum, are responsible for animal and human botulism. In its natural form, botulism is mostly acquired after absorption of BoNTs in the digestive tract after ingestion of food contaminated with C. botulinum and its toxins. The intoxination can be divided in 4 major steps: toxin production, ingestion of food contaminated with BoNTs, passage of BoNTs through the intestinal barrier, and proteolytic activity on nerve endings. Regulation of toxin production and passage of BoNTs through the intestinal barrier are poorly understood. BoNT associates with non toxic protein (NAPs) to form complexes of various sizes. The BoNTs and NAPs genes are clustered in the botulinum locus and are positively regulated by an alternative sigma factor BotR/A. Toxinogenesis in C. botulinum is regulated by a complex regulatory network containing at least 3 two components systems (TCS), identified by antisens RNA strategy, which regulate the production of botulinum complex independently of BotR/A. On the other hand, BoNT/B entry was monitored with fluorescent HcB fragment in ligatureted mouse intestinal loop. Fluorescent imaging analysis, immunohistochemistry and electron microscopy, have evidence that HcB is transcytosed through enterocytes cells by an endocytosis dynamin dependant. HcB targets acetylcholinergic nerves localized in lamina propria of villi then reaches serotoninergic and acetylcholinergic nerve endings in the submucosa and musculosa within 10 minutes. In vitro experiments performed on intestinal cell line (m-ICcl2) shows that the endocytosis of HcB is dependent on the GD1b/GT1b gangliosidic receptors on the cell surface but not on the synaptotagmine II protein which is recquiered HcB entry in neuronal cells

Les traitements et l’imagerie des tumeurs cérébrales malignes se sont avérés jusqu’à présent très peu efficaces, en raison de la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui freine le passage des molécules thérapeutiques mais aussi diagnostiques vers les tissus du système nerveux central (SNC). Le développement de vecteurs nanométriques chargés en agents thérapeutiques et capables de traverser la BHE pourrait être une alternative pour améliorer la bio-distribution de principes actifs et d’agent d’imagerie au cerveau. Parmi les différents types de vecteurs proposés, les nanoparticules polymériques (NP) constituées de polymères dibloc comportant un bloc de poly (éthylène glycol) (PEG) pourrait présenter une solution prometteuse pour transporter des actifs à travers la BHE. La PEGylation de la surface des NPs améliore la stabilité colloïdale des NPs. De plus, elle diminue l'adsorption non spécifique des protéines à la surface de NPs (appelée aussi opsonisation). La vitesse de clairance des NPs est ainsi ralentie et les NPs circulent plus longtemps dans le sang. Malgré l’effet bénéfique de la couche de PEG à la surface des NPs, le rôle exact des propriétés de surface liées à la longueur de la chaîne PEG sur l'interaction des NPs avec les cellules endothéliales vasculaires est mal compris. Dans une première partie de ce travail, le rôle de la longueur de PEG sur l'endocytose et la transcytose des NPs a été étudié sur des monocouches de cellules bEnd.3, un modèle in vitro de BHE. Les mécanismes de transport des NPs ont été évalués en utilisant différents inhibiteurs de l'endocytose. La quantification du taux d'endocytose et de transcytose a révélé que l'endocytose et la transcytose des NPs augmentaient avec la longueur de la chaîne de PEG. Les taux d'endocytose et de transcytose les plus élevés ont été observés pour les NPs de PLA-PEG5000 et de PLA-PEG10000. Les résultats de l’étude mécanistique démontrent que la longueur de la chaîne de PEG influence la voie d'endocytose empruntée par les NPs PEGylées à travers un modèle in vitro de BHE. Dans une seconde partie de ce travail, l'effet de la longueur du PEG sur la toxicité des NPs et les processus inflammatoires a été étudié sur deux modèles de monocouche de cellules endothéliales vasculaires, soit les cellules bEnd.3 et HUVEC. L'effet de la longueur des chaînes de PEG sur l'expression des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire aux NPs PEGylées a été évalué par qPCR. De plus, le potentiel de génération de dérivés réactifs de l'oxygène (DRO ou ROS) par les NPs a été évalué en utilisant le test cellulaire basé sur l'oxydation de la DCFH-DA. Les résultats démontrent que les NPs PEGylées induisent une augmentation légère et transitoire de l’expression des gènes des cytokines et des chimiokines inflammatoires. Cependant, la longueur des chaînes de PEG ne présente pas un effet significatif sur l'expression des gènes des cytokines et des chimiokines. De plus, nos résultats ne montrent pas l’induction de la génération de ROS par les NPs PEGylées. En résumé, la longueur de chaine de PEG influence le taux d’endocytose et de transcytose. La voie d’endocytose impliquée dans l’internalisation et la transcytose est influencée par la longueur des chaines de PEG. En revanche, les différences de longueur des chaines de PEG ne modulent pas significativement l’expression des cytokines et de chimiokines inflammatoires. Ces résultats devraient contribuer à développer des nanoformulations qui traversent plus efficacement la BHE, tout en minimisant les effets toxiques, notamment inflammatoires sur les cellules endothéliales vasculaires de la BHE. Ces perspectives devront toutefois être confirmées sur des modèles in vivo. / To date, imaging and treatment of brain tumors are proved to be very inefficient due to the presence of the blood-brain barrier (BBB). The (BBB) is a semipermeable barrier which prevents or restrains most therapeutic and diagnostic molecules reach the central nervous system (CNS). Polymeric nanoparticles (NPs) loaded by therapeutics molecules and diagnostic agents could represent a promising solution to help active ingredients to cross the BBB and as a consequence, their biodistribution to the brain could be improved. Polymeric NPs composed of di-block copolymers, such as poly (ethylene glycol) blocks (PEG) that bind to polyester hydrophobic chains, are considered one of the most versatile nanocarriers for transporting therapeutic molecules across the BBB. PEG on the surface of NPs improves the NPs colloidal stability. Furthermore, PEG surface coating decreases the non-specific adsorption of proteins on the surface of NPs (also called opsonization); therefore, the clearance rate of the NPs is slowed down and NPs circulation times in blood is extended. Despite the beneficial effect of the PEG coating on the surface of NPs, the exact role of the surface properties related to the PEG chain length on NPs interactions with the vascular endothelial cells is poorly understood. In first article, the role of PEG chain length on brain vascular endothelial cells endocytosis and transcytosis is investigated on monolayers of bend.3 cells as an in vitro BBB model. The NPs transport mechanisms were then investigated by using different endocytosis inhibitory processes. Our results revealed that NPs endocytosis and transcytosis rates increased with PEG chain length. Higher endocytosis and transcytosis rates were observed for PLA-PEG5000 and PLA-PEG10000 NPs. Moreover, the mechanistic studies demonstrated that the PEG chain length influenced the endocytosis pathway taken by PEGylated NPs through an in vitro model of BBB. In second article, the effect of PEG length on NPs cytotoxicity and inflammatory processes has been investigated in two vascular endothelial cell lines (bEnd.3 and HUVEC). The effect of PEG chain length coating on gene expression that are involved in the inflammation response was investigated by qPCR. Moreover, the potential Reactive Oxygen Species (ROS) generation was evaluated with DCFH-DA probe. The results showed that PEGylated NPs induce a mild and transient activation of inflammatory cytokine and chemokine genes. However, the length of the PEG chains did not modulate significantly gene expression of inflammatory cytokines and chemokines. Furthermore, our results showed that PEGylated NPs did not induce ROS generation. In summary, the chain length of PEG influences the endocytosis and transcytosis rate. The pathway of endocytosis involved in internalization and transcytosis is influenced by the length of PEG chains. In contrast, differences in the length of PEG chains did not significantly modulate the expression of cytokines and inflammatory chemokines. These results contribute to develop nanoformulations that cross the BBB more efficiently while keeping the toxic and inflammatory effects minimal, particularly on the vascular endothelial cells of the BBB. Nevertheless, these perspectives have to be confirmed on in vivo models.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) des fluctuations plasmatiques des molécules endogènes, mais aussi exogènes, et notamment des molécules à potentiel thérapeutique. L’imperméabilité de la BHE est compensée par la présence de mécanismes qui assurent le transport transendothélial des nutriments nécessaires au tissu nerveux, parmi lesquels la transcytose relayée par différents récepteurs. Dans le but d’améliorer le transfert d’agents thérapeutiques à travers la BHE, nous développons des « vecteurs » qui se lient à certains de ces récepteurs. Au cours de notre thèse, nous avons développé et optimisé des modèles in vitro de BHE et barrière sang-moelle épinière (BSME) syngéniques de rats et souris, basés sur la co-culture de cellules endothéliales microvasculaires (CEMs) cérébrales (CEMCs) ou spinales (CEMSs) et d'astrocytes. Parmi les récepteurs étudiés, nous montrons que le LDLR est exprimé à la membrane plasmique apicale des CEMCs et qu’il est impliqué dans la transcytose du LDL tout en évitant le compartiment lysosomal, confirmant l’intérêt de son ciblage dans nos approches. Nous montrons que nos vecteurs, conjugués à une molécule organique ou à un cargo protéique, sont endocytés par les CEMCs de façon LDLR-dépendante, évitent le compartiment lysosomal et franchissent la monocouche de CEMCs. Nous avons également mis en place des modèles in vitro de BHE et BSME enflammés, sachant que l’inflammation des CEMs est associée à de nombreuses pathologies du SNC. Ces modèles seront utiles pour évaluer des stratégies de vectorisation ciblant préférentiellement les structures du SNC en situation pathologique. / The blood-brain barrier (BBB) protects the central nervous system (CNS) from plasma fluctuations of endogenous, but also exogenous molecules, including therapeutic molecules. The BBB’s restrictive properties are compensated by the presence of different mechanisms that provide transport of nutrients across the BBB, including transcytosis of endogenous ligands mediated by receptors. Our objective is to improve drug delivery across the BBB and we developed “vectors” that target different recpetors. During our thesis we developed and optimized cellular tools and approaches, in particular syngeneic in vitro models of the BBB and blood-spinal cord barrier (BSCB) from both rat and mouse, based on the co-culture of brain (BMECs) or spinal cord (SCMECs) microvascular endothelial cells (MECs) and astrocytes. Among the receptors we studied, we show that the LDL receptor (LDLR) is expressed at the apical plasma membrane of BMECs and confirmed that it is involved in transcytosis of LDL through the vesicular compartment, while avoiding the lysosomal compartment, further establishing its interest as a target receptor. We show that our vectors conjugated to an organic molecule or to a protein cargo are endocytosed by BMECs in a LDLR-dependent manner, avoid the lysosomal compartment and cross the BMEC monolayers. Finally, we developed BBB and BSCB in vitro models in inflammatory conditions, considering that MECs inflammation is associated with many CNS lesions and pathologies. These models will be useful to better understand the inflammatory processes of CNS endothelial cells and to evaluate vectorization strategies preferentially targeting CNS structures in pathological condition.