L'ingénierie génétique des plastes est une technologie émergente considérée tant pour l'amélioration de certains caractères d'intérêt agronomiques, que pour la production de biomatériaux et de protéines thérapeutiques. Dans la première partie de nos travaux, nous nous sommes intéressés au potentiel de ces organites, d'origine procaryotique, à replier correctement et accumuler une enzyme contenant des ponts disulfures. Nous avons montré qu'à l'inverse du cytoplasme bactérien, le stroma des chloroplastes de tabac permet la formation d'une phosphatase alcaline recombinante dont l'activité et la stabilité dépendent de la présence de ses deux ponts disulfures intramoléculaires. L'adressage de cette enzyme au Iumen des thylacoides via le système Sec résulte en un niveau d'expression plus élevé et une plus grande activité spécifique de la protéine. Des approches complémentaires ont été initiées dans le tabac, avec des protéines chaperonnes impliquées dans la formation des ponts disulfures, et d'une protéine fluorescente verte (GFP) sensible aux variations redox. Ces résultats nous informent sur les propriétés de repliement au sein des chloroplastes et ont des implications biotechnologiques importantes pour la production de nombreuses protéines thérapeutiques dans les plantes. Les chloroplastes recombinants ont la capacité d'accumuler une quantité massive de protéines recombinantes. Pour la seconde partie de nos travaux, nous nous sommes attardés sur les conséquences d'un niveau d'expression extrême. Nous avons analysé les plastes transformés de tabac accumulant la pbosphatase alcaline, une GFP, ainsi qu'une hydroxyphényl pyruvate dioxygénase bactérienne. Ces lignées ont une croissance normale et aucune perturbation significative du transcriptome n'a été observée. En revanche, l'analyse du protéome des feuilles a révélé des différences et en particulier une diminution drastique de l'accumulation de la Rubisco. L'impact de l'accumnlation massive de la protéine recombinante sur le métabolisme de la plante est discuté. / Plastid genome engineering is an emerging technology which is being considered for the improvement of plant agronomic traits as well as for the molecular farming of biomaterials and therapeutic proteins. In the first part of this work, the potential of these organelles of prokaryotic origin to correctly fold and accumulate a disulfide bond containing enzyme has been investigated. Unlike a normal bacterial cytosol, the stroma of tobacco chloroplasts was found to support the formation of a recombinant alkaline phosphatase from Escherichia coli, whose activity and stability depend on the presence of two intra-molecular disulfide bonds. Targeting this enzyme to the thylakoid lumen via the Sec pathway resulted in stronger accumulation levels and higher specific activity. Complementary approaches have been initiated in tobacco using bacterial chaperones involved in the catalysis of disulfide bond formation, and a redox sensitive green fluorescent protein. These findings shed some light on the folding properties within chloroplasts, and have important biotechnological implications for the production in plants of many therapeutic proteins. Recombinant chloroplasts have the capacity to accumulate massive amounts of recombinant protein. The second part of this work focused on the consequences on the plant fitness and physiology of such extreme expression levels. We have analyzed tobacco plastid transformants accumulating alkaline phosphatase, a green fluorescent protein, and a bacterial hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase. These lines exhibited a normal wild-type growth rate, and no significant perturbation of the chloroplast transcriptome was observed. In contrast, a proteomic approach on leaves revealed some differences, in particular a massive drop in the amount of Rubisco. The impact of recombinant protein expression on plant metabolism is discussed.

Les lipocalines sont des petites protéines de structure tertiaire simple qui ont l'habileté de lier de petites molécules généralement hydrophobes. De récentes études ont montré que les lipocalines animales jouent un rôle important dans la régulation du développement et sont impliquées dans la tolérance au stress oxydatif. Les plantes possèdent aussi des types variés de lipocalines. Les analyses bioinformatiques ont prédit que certains membres pourraient être localisés dans le chloroplaste, suggérant une fonction dans la protection de l'appareil photosynthétique lors de conditions de stress oxydatif. Ce travail présente la caractérisation fonctionnelle de la lipocaline chloroplastique AtCHL chez Arabidopsis thaliana. Un fractionnement cellulaire a montré qu'AtCHL est une protéine du lumen des thylacoïdes. La sécheresse, les hautes intensités lumineuses, et le traitement au paraquat et à l'acide abscissique induisent l'accumulation du messager et de la protéine AtCHL. Sous des conditions normales de croissance, les lignées de type sauvage, de sous-(KO) et sur-(OEX) expression ne montrent pas de différence au niveau phénotypique même si elles montrent des niveaux d'accumulation d'AtCHL dramatiquement différents. Lors d'un stress de sécheresse ou un stress oxydatif, l'absence d'AtCHL dans les plantes KO mène à plus de dommages alors qu'un haut niveau d'AtCHL permet aux plantes OEX de mieux surmonter les stress. Le niveau d'accumulation d'AtCHL est inversement proportionnel au niveau de lipides peroxydés. Ces résultats montrent qu'AtCHL est vraisemblablement impliquée dans la protection des lipides, localisés du côté luménal des thylacoïdes, contre les espèces réactives d'oxygène générées sous les stress de sécheresse et oxydatif. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chloroplaste, Peroxydation des lipides, Lipocalines, Tolérance aux stress, Stress oxydatif.

Les membranes des chloroplastes sont riches en monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) et digalactosyldiacylglycérol (DGDG), deux galactolipides essentiels pour la biogenèse de ces organites et le fonctionnement de la machinerie photosynthétique. MGD1 est la galactolipide synthase majeure chez Arabidopsis thaliana. C’est une protéine monotopique, localisée dans l’enveloppe interne des membranes des chloroplastes, qui transfère un résidu galactose à partir d’UDP-galactose sur le diacylglycérol (DAG) pour former le MGDG. MGD1 a besoin de lipides anioniques tels que le phosphatidylglycérol (PG) pour être active, mais le mécanisme d’activation reste à ce jour inconnu. Des études antérieures ont permis d’identifier le résidu P189 comme étant potentiellement impliqué dans la liaison au PG, et le résidu H155 comme base catalytique potentielle. Le but de ma thèse a été d’obtenir plus d’informations sur le mécanisme de régulation de la MGD1, enzyme clé de la biogenèse des chloroplastes. Mon étude s’est portée sur la protéine native MGD1 et deux de ses mutants, H155A et P189A. Ces protéines ont été exprimées chez Escherichia coli et purifiées jusqu’à homogénéité. Une nouvelle méthode de dosage de l’activité MGDG synthase, adaptée de la technique de bioluminescence UDP-GloTM de Promega, a été mise au point. Cette méthode présente de nombreux avantages en termes de rapidité et de sensibilité comparée à la technique classiquement utilisée qui nécessite l’utilisation d’un UDP-Galactose radiomarqué. L’étude des propriétés d’association de MGD1 et des mutants à des membranes modèles, à l’aide de la technique des monocouches de Langmuir, a permis de proposer un mécanisme réactionnel inédit, impliquant une dyade catalytique de type PG-His, qui permet d’expliquer le rôle d’activateur du PG. Un nouveau test d’activité, basé sur cette même technique de Langmuir, qui présente l’avantage de pouvoir discriminer la capacité de liaison de MGD1 à la membrane et sa capacité à transférer un galactose sur son accepteur DAG a été mis en place. Il s’agit du premier exemple de synthèse d’un galactolipide sur une membrane biomimétique constituée d’un mélange DAG-PG. / The membranes of chloroplasts are enriched in monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), two essential galactolipids to the biogenesis of these organelles and the functioning of photosynthetic machinery. MGD1 is the major galactolipid synthase in Arabidopsis thaliana. It is a monotopic protein, located in the inner envelope of chloroplast membranes, which transfers a galactosyl residue from UDP-galactose to diacylglycerol (DAG) to form MGDG. MGD1 needs anionic lipids such as phosphatidylglycerol (PG) to be active, but the activation mechanism is still unknown. Previous studies identified the P189 residue as potentially involved in PG binding, and H155 as the putative catalytic base. The aim of my thesis was to progress in our understanding of the regulation of MGD1 activity, a key enzyme in the biogenesis of chloroplasts. My study focused on the native protein MGD1 and two mutants, H155A and P189A. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. A new method for assaying MGDG synthase activity, adapted from the Promega UDP-GloTM bioluminescent technique has been developed. This method has many advantages in terms of speed and sensitivity compared to the conventionally used technique which requires the use of a radiolabeled UDP-Galactose. Furthermore, the study of the association properties of MGD1 and mutants with model membranes, using the Langmuir monolayer technique, led us to propose a novel reaction mechanism, involving a PG-His type catalytic dyad, which may explain the role of PG as activator. A new activity test, based on the Langmuir technique, which has the advantage to discriminate the MGD1 binding capacity to the membrane and its ability to transfer a galactose to its acceptor DAG has been set up. This is the first example of galactolipid synthesis on a biomimetic membrane formed of a DAG-PG mixture.

La stabilité génomique des organelles de plantes suscite un grand intérêt dans le domaine de la biologie végétale. En effet, plusieurs études récentes suggèrent que ce type d’instabilité génomique pourrait mener à l’isolation de traits intéressants en l’agronomie. Plusieurs protéines sont d’ailleurs déjà été identifiés comme étant impliqués dans le maintien de la stabilité de ces génomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protéines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le génome nucléaire d’Arabidopsis thaliana encode trois protéines s’apparentant à la Recombinase A bactérienne et qui sont ciblées à la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gènes partagent une similarité de séquence de 61% avec leur homologue bactérien chez Escherichia coli. Chez les bactéries ces protéines jouent un rôle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Chez Arabidopsis, il a été démontré que RECA2 et RECA3 sont nécessaires au maintien de l’intégrité du génome mitochondriale. Toutefois leur contribution à la stabilité du génome chloroplastique ainsi que le rôle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de déterminer la contribution éventuelle des protéines RECA d’Arabidopsis dans la réparation de l’ADN chloroplastique et plus précisément le rôle du gène RECA1. Nous énonçons l’hypothèse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactériens en étant impliqués dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tenté d’isoler des lignées mutantes pour chacun des gènes RECA d’Arabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignées convenables pour notre étude que dans le cas du gène RECA1. Ces lignées ont été utilisées pour évaluer la contribution de ce gène à la stabilité du génome du chloroplaste. Ensuite, pour étudier la relation épistatique des gènes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des différentes lignées mutantes pour ces gènes a été réalisé. Nous avons ensuite étudié la sensibilité de toutes ces lignées mutantes à la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons testé la présence de réarrangements dans le génome du chloroplaste en condition normal ou en présence de stress génotoxique. Nos résultats démontrent que les protéines Whirly et RECA1 sont impliquées dans deux voies de réparation de l’ADN différentes et que les Whirly sont suffisantes pour s’occuper des bris d’ADN double brin en l’absence de RECA1. Nous démontrons également que l’absence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantité de réarrangements dans le génome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymérase POLIB est impliquée dans la même voie de réparation que RECA1. Finalement nous proposons un modèle pour expliquer nos résultats et impliquons RECA1 dans un mécanisme de réparation d’ADN et aussi un rôle potentiel dans la réplication. / The stability of plant organelles genomes elicits a great interest in the domain of plant biology. In fact, numerous studies suggest that genomic instability can lead to the isolation of interesting traits in the field of agronomy. Some factors such as MSH1, the POLI family, OSB1, the Whirly proteins and the Recombinase A (RECA), have already been identified has being implicated in the maintenance of genome stability. The nuclear genome of Arabidopsis thaliana encodes three proteins, RECA1, RECA2 and RECA3, that shares a high resemblance with bacterial Recombinase A. They are targeted to the mitochondria and/or to the chloroplast. Globally, these genes share a similarity of sequence of 61% with their bacterial homologue in Escherichia coli. In bacteria these proteins play an essential part in homologous recombination and are implicated in DNA repair. In Arabidopsis, RECA2 and RECA3 have been shown as being essential to maintain the integrity of the mitochondrial genome but their contribution to the stability of the chloroplast as well as the role of RECA1 remains obscure. The goal of this project is to establish the eventual contribution of the Arabidopsis RECA proteins in the repair of chloroplast DNA and more precisely the role of the RECA1 gene. We propose the hypothesis that plants RECA act in the same fashion as their bacterial orthologues by being implicated in homologous recombination. Within the framework of this project, we have attempted to isolate mutant lines for each RECA gene of Arabidopsis. In the end, we were able to obtain appropriate lines for our study only for the RECA1 gene. These lines were then used to evaluate the contribution of the gene to chloroplast genome stability. Afterwards, in order to study the epistatic relationship between the RECA1, WHY1 and WHY3 genes, a cross between different mutant lines of these genes was realised. We then studied the sensitivity of all of those mutant lines to ciprofloxacine, an agent causing double stranded breaks exclusively in plant organelles. Finally, we evaluated the presence of rearrangements in the chloroplast genome under normal conditions and under the presence of a genotoxic stress. Our v results show that the Whirly and RECA1 proteins are implicated in two separate pathways of DNA reparation and that the Whirly proteins are sufficient to take in charge DNA double strand breaks generated by the absence of RECA1. We also demonstrate that the absence of Whirly and RECA1 causes an increasein the quantity of rearrangements in the chloroplast genome. Furthermore, we propose that the polymerase POLIB is implicated in the same repair pathway as RECA1. Finally we propose a model to explain our results and implicate RECA1 in a DNA repair mechanism and propose a role for RECA1 in DNA replication.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'un des phénomènes les plus importants survenus pendant la maturation du fruit de tomate est le changement de couleur du vert au rouge. Ce changement a lieu dans les plastes et correspond à la différenciation des plastes photosynthétiques, les chloroplastes, en plastes non-photosynthétiques qui accumulent des caroténoïdes, les chromoplastes. Dans cette thèse, nous présentons d'abord une introduction bibliographique sur le domaine de la transition chloroplaste-chromoplaste, en décrivant les modifications structurales et physiologiques qui se produisent pendant la transition. Puis, dans le premier chapitre, nous présentons des observations microscopiques de plastes isolés à trois stades de mûrissement, puis des enregistrements en temps réel de la fluorescence des pigments sur les tranches de fruits de tomate. Il a été possible de montrer que la transition chloroplaste-chromoplaste était synchrone pour tous les plastes d'une seule cellule et que tous les chromoplastes proviennent de chloroplastes préexistants. Dans le deuxième chapitre, une approche protéomique quantitative de la transition chloroplaste-chromoplaste est présentée, pour identifier les protéines différentiellement exprimées. Le traitement des données a identifié 1932 protéines parmi lesquelles 1529 ont été quantifiées par spectrométrie de masse. Les procédures de quantification ont ensuite été validées par WESTERN blot de certaines protéines. La chromoplastogénèse comprend les changements métaboliques suivants : diminution de l'abondance des protéines de réaction à la lumière et du métabolisme des glucide, et l'augmentation de la biosynthèse des terpénoïdes et des protéines de stress. Ces changements sont couplés à la rupture de la biogenèse des thylakoïdes, des photosystèmes et des composants de production d'énergie, et l'arrêt de la division des plastes. Dans le dernier chapitre nous avons utilisé la lincomycine, un inhibiteur spécifique de la traduction à l'intérieur des plastes, afin d'étudier les effets sur la maturation des fruits et sur l'expression de gènes nucléaires impliqués dans la maturation. Les résultats préliminaires indiquent que l'inhibition de la traduction des protéines dans les plastes affecte la maturation du fruit en réduisant l'accumulation de caroténoides. L'expression de plusieurs gènes nucléaires a été modifiée mais une relation claire avec le phénotype altéré de maturation n'a pas pu être établie. Au total, notre travail donne de nouveaux aperçus sur le processus de différenciation chromoplaste et fournit des données nouvelles ressources sur le protéome plaste / One of the most important phenomenons occurring during tomato fruit ripening is the color change from green to red. This change takes place in the plastids and corresponds to the differentiation of photosynthetic plastids, chloroplasts, into non photosynthetic plastids that accumulate carotenoids, chromoplasts. In this thesis we first present a bibliographic introduction reviewing the state of the art in the field of chloroplast to chromoplast transition and describing the structural and physiological changes occurring during the transition. Then, in the first chapter we present an in situ real-time recording of pigment fluorescence on live tomato fruit slices at three ripening stages. By viewing individual plastids it was possible to show that the chloroplast to chromoplast transition was synchronous for all plastids of a single cell and that all chromoplasts derived from pre-existing chloroplasts. In chapter two, a quantitative proteomic approach of the chloroplast-to-chromoplast transition is presented that identifies differentially expressed proteins. Stringent curation and processing of the data identified 1932 proteins among which 1529 were quantified by spectral counting. The quantification procedures have been subsequently validated by immune-blot evaluation of some proteins. Chromoplastogenesis appears to comprise major metabolic shifts (decrease in abundance of proteins of light reactions and carbohydrate metabolism and increase in terpenoid biosynthesis and stress-related protein) that are coupled to the disruption of the thylakoid and photosystems biogenesis machinery, elevated energy production components and loss of plastid division machinery. In the last chapter, we have used lincomycin, a specific inhibitor of protein translation within the plastids, in order to study the effects on fruit ripening and on the expression of some ripening-related nuclear genes. Preliminary results indicate that inhibiting protein translation in the plastids affects fruit ripening by reducing the accumulation of carotenoids. The expression of several nuclear genes has been affected but a clear relationship with the altered ripening phenotype could not be established. Altogether, our work gives new insights on the chromoplast differentiation process and provides novel resource data on the plastid proteome

Le chloroplaste est un organite totalement intégré dans le métabolisme de la cellule végétale. Il possède des voies métaboliques qui lui sont propres comme la photosynthèse, la synthèse d'acides gras, la synthèse d'acides aminés. Le chloroplaste est limité par l'enveloppe, constituée de deux membranes distinctes et d'un espace intermembranaire. Par sa localisation, l'enveloppe du chloroplaste constitue un site privilégié de transport de métabolites, d'ions, de protéines et d'informations entre le stroma du chloroplaste et le cytosol de la cellule végétale. Ainsi, l'enveloppe doit renfermer de nombreux systèmes de transport permettant ces échanges. Malgré l'importance de ces transporteurs, très peu d'entre eux ont été totalement caractérisés. La limitation principale provient de la très faible représentation de ces protéines et de leur hydrophobicité. Afin de caractériser de nouveaux systèmes de transport, nous avons développé une nouvelle approche qui nous a permis d'identifier de nouvelles protéines. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation fonctionnelle de ces protéines.<br />L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.<br />Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.<br />Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.<br />L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.

Chez les eucaryotes, la photosynthèse a lieu dans le chloroplaste, un organite spécifique de la cellule végétale et caractérisé par différents compartiments : (i) l'enveloppe, la double membrane qui délimite le chloroplaste ; (ii) le stroma, phase aqueuse principalement composée de protéines solubles et (iii) un système membranaire interne, les thylacoïdes, qui contiennent les complexes photosynthétiques. Les thylakoïdes forment un réseau tridimensionnel continu et sont différenciés en deux domaines physiques distincts : des empilements de vésicules de membrane (appelés granas ou BBY) et des extensions de membrane simple (lamelles stromales). Les complexes majeurs de la photosynthèse ne sont pas distribués de manière égale dans cette membrane à cause de contraintes électrostatiques et stériques. Ainsi, le photosystème I et l'ATP-synthétase sont enrichis dans les granas, le photosystème II dans les lamelles stromales alors que d'autres complexes, comme le cytochrome b6f, auraient une répartition équivalente entre granas et lamelles stromales. Pour faire face aux variations environnementales de lumière (en qualité et quantité), les plantes ont développé des processus pour moduler leur capacité d'absorption et d'utilisation de la lumière par les photosystèmes, processus regroupés sous le terme de « quenching non photosynthétique ou NPQ ». Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressé à deux composants du NPQ, les états de transition et la dissipation sous forme de chaleur (partie qE).Le premier objectif de ma thèse a été d'identifier de nouveaux acteurs impliqués dans les transitions d'état et ceci en étudiant la relocalisation de protéines au sein des sous-compartiments des thylacoïdes par une approche protéomique. En effet, il a été montré que certaines antennes collectrices de lumière sont réorganisées dans les membranes photosynthétiques lors des transitions d'état. Jusqu'à présent, aucune description exhaustive de la composition et distribution des protéines dans les sous-compartiments de thylacoïdes n'avait été réalisée. J'ai donc dans un premier temps développé des protocoles de purification des sous-compartiments des thylakoïdes (granas et lamelles stromales) à partir de chloroplastes de plantes sauvage d'Arabidopsis thaliana. Ensuite, grâce à une approche d'analyse protéomique semi-quantitative, nous avons pu déterminer la localisation d'environ 300 protéines des thylacoïdes. Les résultats suggèrent que la localisation de complexes photosynthétiques est beaucoup plus dynamique que celle jusqu'à lors proposée. En effet, même s'ils sont préférentiellement identifiés dans un sous-compartiment, certains complexes photosynthétiques présentent une double localisation qui était inattendue. De plus, la composition en sous-unités de ces complexes diffère selon leur localisation, dans les granas et dans les lamelles stromales, suggérant l'existence de processus de régulation de la photosynthèse jusqu'à lors insoupçonnés. Cette approche a ensuite été appliquée sur des plantes mutantes d'Arabidopsis affectées dans les transitions d'état afin d'identifier des protéines pouvant être impliquées dans ce processus d'adaptation. En parallèle, je me suis intéressé au qE . L'activation de ce mécanisme n'est pas constitutive et nécessite la formation d'un gradient de pH entre le stroma et le lumen des thylacoïdes (ΔpH). L'objectif de l'étude a été d'identifier des acteurs pouvant contrôler la formation de ce gradient de pH. Pour cela, nous nous somme focalisés sur le rôle d'un transporteur de potassium récemment caractérisé, TPK3. Grâce à des approches biophysiques et biochimiques, nous avons démontré que TPK3 est impliqué, in vivo, dans la modulation des deux composantes de la force proton motrice (pmf), le gradient de pH (ΔpH) et la différence de potentiel (Δψ). En contrôlant la répartition de la force proton motrice,TPK3, permet une utilisation correcte de la lumière en dissipant l'excès d'énergie. / Within higher plants and algae, photosynthesis is carried out in the chloroplast. Structurally, chloroplasts are organized in (i) the envelope, a double membrane system surrounding the chloroplast (ii) the stroma, the aqueous space which mainly contains soluble proteins and the (iii) thylakoids, a three-dimensional membrane network where photosynthetic electron transport reactions occur. Thylakoids are non-homogeneously folded, and comprise two major domains: (i) the grana-BBY, which are stacks of thylakoids particularly enriched in photosystem II, LHCII (the antenna-protein complex responsible for light harvesting) and (ii) the stroma lamellae, which are unstacked thylakoids connecting grana stacks enriched in photosystem I and ATP synthase. Plants can respond to changes in the environmental light conditions by several means as those which are collectively called non-photochemical quenching or NPQ. During my thesis, I mainly focused on two components of the NPQ: state transition (qT) and high-energy state quenching (qE).State transitions is the process by which PSII-antenna proteins are re-organized between stroma-lamellae and grana-BBY following changes in ambient light both of intensity and spectral composition. State transitions play a key role in the plant adaptation but many aspects of this process remain unclear. The main objective of my thesis was to study the thylakoid protein re-localization between stroma-lamellae and grana-BBY during state transitions using a proteomic-based approach. At this aim I firstly focused on the sub-thylakoid protein localization in Arabidopsis WT and I developed different protocols for the purification of the two sub-compartments (stroma-lamellae and grana-BBY) starting from intact chloroplasts. Later, thanks to a semi-quantitative proteomic approach, I determined the precise localization of around 300 thylakoid proteins in Arabidopsis WT. Results suggested that the localization of the different photosynthetic complexes is much more dynamics than previously hypothesized. In fact, even if characterized by a preferential localization, some photosynthetic complexes displayed an unexpected double localization. Moreover the subunit composition of these complexes was found to vary according to their localization (BBY or stroma-lamellae) suggesting the existence of mechanisms of regulation which have never been evidenced before. Later, we used the same mass-spectrometry-based approach on two different Arabidopsis mutants unable to perform state transitions. The objective was to highlight the involvement of other proteins (other than LHCII) which could possibly be re-localized within the photosynthetic membrane during state transitions. In the second part of my thesis, I focused on the high-energy state quenching component of the NPQ. qE allows the plant to dissipate excessive light energy as heat. This process it's not constitutive but need to be activated by the formation of a difference in the pH between the stroma and the thylakoid lumen (ΔpH). The objective of the study was to identify new possible actors in the regulation of the ΔpH formation. At this purpose I focused on a recently characterized potassium channel, TPK3. Thanks to a biophysical and biochemical approach, we demonstrated that TPK3 is involved, in vivo, in the modulation of the two components of the proton motive force (pmf), the ΔpH and the difference in the electric field Δψ. By controlling the repartition of the pmf, TPK3, controls also the formation of the NPQ and directly affects light utilization and dissipation in vivo. This avoids serious damages to the photosynthetic chain when plants are exposed to high-light conditions

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