Lors de son jaunissement, une feuille subit aussi bien des modifications morphologiques que métaboliques. Ce processus est appelé « sénescence ». Une meilleure compréhension des mécanismes de la sénescence représente un challenge très important non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi pour de futures applications en biotechnologie. La thèse présentée ici porte sur d’importants aspects relatifs aux mécanismes cellulaires et métaboliques rencontrés lors de la sénescence foliaire et ce, en apportant une attention particulière à l’implication des mitochondries lors de ce processus. Dans un premier temps, nous avons développé deux méthodes pour isoler, à partir de feuilles d’Arabidopsis, soit des mitochondries conservant leurs fonctionnalités, soit des mitochondries hautement purifiées. Ces méthodes furent utilisées afin d’étudier le rôle des mitochondries dans l’équilibre redox des cellules mais aussi dans le but de déterminer les capacités mitochondriales lors de la sénescence foliaire. Plus précisément, nous avons comparé l’induction de la sénescence foliaire grâce à différents traitements à l’obscurité. Cette comparaison entre des feuilles individuellement placées à l’obscurité et des feuilles provenant d’une plante entièrement disposée à l’obscurité révéla des stratégies métaboliques très différentes. En intégrant des mesures de l’activité photosynthétique, de la respiration et de microscopie laser confocale avec des analyses de transcriptomique et de métabolomique, nous suggérons que le métabolisme d’une feuille provenant d’une plante placée longuement à l’obscurité entre dans un état de « veille » dans le but de maintenir la machinerie photosynthétique fonctionnelle le plus longtemps possible; dans ce cas, les capacités mitochondriales diminuent. A contrario, les mitochondries issues de feuilles individuellement soumises à l’obscurité sont beaucoup plus actives et peuvent par conséquent fournir l’énergie et les squelettes carbonés nécessaires à la dégradation des constituants cellulaires facilitant ainsi la remobilisation des nutriments. Par ailleurs, nous avons aussi mené des investigations sur la dynamique du cytosquelette lors d’une sénescence induite par l’obscurité. La mobilité mitochondriale fut affectée dans les feuilles individuellement soumises à l’obscurité par la dégradation précoce des microtubules ce qui ne fut pas le cas dans les feuilles issues d’une plante entièrement placée à l’obscurité. De plus, un certain nombre de MAPS (microtubules-associated proteins) semblent être impliquées dans l’agrégation des microtubules autour des chloroplastes. Dans son ensemble, cette thèse apporte d’importantes informations quant aux ajustements métaboliques ainsi qu’aux mécanismes cellulaires prenant place lorsque des feuilles d’Arabidopsis sont soumises à une obscurité prolongée. En particulier, nous pensons que les mitochondries ont un rôle prépondérant lors de la sénescence foliaire et que selon le statut métabolique de la plante, les régulations mitochondriales peuvent apparaître divergentes. / When switching from green to yellow, a leaf undergoes both morphological and metabolic changes. This process is known as senescence and improved understanding of its mechanisms is important both from a fundamental scientific perspective but also for biotechnological applications. The present thesis reports on several important aspects regarding the cellular and metabolic mechanisms occurring during leaf senescence with an emphasis on the mitochondrial contribution to this process. As a first step, we developed methods to isolate either highly functional crude mitochondria or highly purified mitochondria from leaves of Arabidopsis thaliana. These methods were further used to study mitochondrial contributions to cellular redox homeostasis and to estimate the mitochondrial capacities in leaves undergoing senescence. In particular, we compared the induction of senescence by different dark treatments in Arabidopsis. The comparison between individually darkened leaves and leaves from whole darkened plants revealed different metabolic strategies in response to darkness. Integrating data from measurements of photosynthesis, respiration and confocal laser microscopy with transcriptomic and metabolomic profiling, we suggested that metabolism in leaves of the whole darkened plants enter a “stand-by mode” with low mitochondrial activity in order to maintain the photosynthetic machinery for as long as possible. In contrast, mitochondria from individually darkened leaves are more active and may provide energy and carbon skeletons for the degradation of cell constituents, facilitating the retrieval of nutrients. We also investigated the dynamics of the microtubular cytoskeleton during dark-induced senescence. Mitochondrial mobility was affected by an early disruption of the microtubules in individually darkened leaves but not in whole darkened plants. In addition, several microtubules associated proteins (MAPs) seemed to be involved in the bundling of the microtubules around the chloroplasts. Altogether, the work presented in this thesis highlights several important steps regarding the metabolic adjustments and the cellular mechanisms in Arabidopsis leaves submitted to prolonged darkness. In particular, we suggest the mitochondria to fulfill specific and important functions during leaf senescence since the role of mitochondria in leaves experiencing prolonged darkness appears very dependant on the whole metabolic status of the plant.

Les algues unicellulaires de la classe Chlorophyceae sont particulièrement étudiées pour leur potentiel économique dans la production de biocarburant. La première taxonomie de cette classe a été faite avec l'avènement de la microscopie électronique et par la suite avec des phylogénies moléculaires. Cette lignée se divise en deux groupes : OCC (Oedogoniales + Chaetophorales + Chaetopeltidales) et CS (Chlamydomonadales + Sphaeropleales). Il existe de profondes incertitudes sur les positions phylogénétiques des organismes à la base du groupe CS. Afin de renforcer la phylogénie de ces organismes, les génomes chloroplastiques de cinq algues basales ont été séquencés à l'aide de la technologie de nouvelle génération 454 et assemblés de novo. Une analyse phylogénétique de 69 séquences de protéines a permis de montrer que trois des cinq organismes classés dans l'ordre Chlamydomonadales par la littérature actuelle sont en fait basaux dans l'ordre Sphaeropleales. Ce reclassement phylogénétique implique de nouvelles hypothèses sur l'évolution des corps flagellaires. / The unicellular algae class Chlorophyceae is notably studied for its economic potential for biofuel production. The first taxonomy of this class was made with the advent of electron microscopy and subsequently with molecular phylogenies. This lineage is divided into two groups: OCC (Oedogoniales + Chaetophorales + Chaetopeltidales) and CS (Chlamydomonadales + Sphaeropleales). There are deep uncertainties about the phylogenetic positions of the organisms at the base of the CS group. To strengthen the phylogeny of these organisms, the chloroplast genomes sequences of five basal algae were obtained by Roche 454 pyrosequencing . A phylogenetic analysis of sixty-nine chloroplast protein sequences revealed that three of these five organisms, listed in the order Chlamydomonadales by the current literature, are in fact basal in the order Sphaeropleales. This phylogenetic reclassification involves a new hypothesis on the evolution of flagellar bodies.

Les algues vertes et les plantes terrestres sont des organismes photosynthétiques qui se regroupent dans le sous-règne des Viridiplantae. Ce règne se divise en deux lignées évolutives que sont les Streptophyta (plantes terrestres et algues vertes de la classe des Charophytes) et les Chlorophyta (algues vertes appartenant aux classes : Prasinophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae et Trebouxiophyceae). L’embranchement des ordres composant la classe Trebouxiophyceae est encore mal connu. En étudiant les génomes chloroplastiques d’au moins un représentant de chaque ordre, il sera possible de reconstruire une phylogénie juste et de mieux comprendre l’évolution moléculaire de cette classe. La famille Trebouxiophyceae comptent 4 ordres : Trebouxiales, Microthamniales, Chlorellales et Prasiolales. Pour chacun de ces ordres, excepté les Prasiolales, un génome chloroplastique d’une algue verte a été séquencé. Le séquençage du génome chloroplastique de Pabia signiensis, aussi appelé Planophila sp et appartenant aux Prasiolales, vient compléter cet échantillonnage. Selon les analyses phylogénétiques du gène codant pour l’ARNr 18S, P. signiensis aurait divergé relativement tôt durant l’évolution de la classe des Trebouxiophyceae et formerait avec Chlorella ellipsoidea (Prasiolales) le groupe soeur de Chlorella vulgaris (Chlorellales). Le génome chloroplastique de P. signiensis est, avec ses 236,463 pb, un des plus grands génomes séquencés dans la classe des Trebouxiophyceae. La présence de régions inversées répétées, lui confère la structure quadripartite caractéristique de la plupart des génomes chloroplastiques. Sur les 111 gènes trouvés, seul le gène ycf47 est propre au génome chloroplastique de P. signiensis. Les principaux regroupements de gènes ancestraux chez les génomes chloroplastiques d’algues vertes sont présents et 13 d’entre eux sont entièrement conservés. Aucun intron n’a été mis en évidence. L’ordre des gènes et leur répartition dans le génome sont peu réarrangés par rapport aux génomes ancestraux de la classe Prasinophyceae. Seules les longues régions inversées répétées (27.3 kb) dérobent à la règle, puisque celles-ci possèdent les gènes psbA et trnS(gcu) en plus de contenir un opéron rrn brisé en deux segments qui sont inversés l’un par rapport à l’autre et un taux élevé de SDRs. Bien que plusieurs des caractéristiques mentionnées ci-dessus se retrouvent dans les génomes chloroplastiques des Trebouxiophyceae, le grand nombre de caractères ancestraux présents dans le génome de P. signiensis semble confirmer la position basale de cette algue verte et appuie l’hypothèse selon laquelle les Trebouxiophytes seraient à la base du clade UTC (Ulvophyceae-Trebouxiophyceae-Chlorophyceae).

Th.--Sci. phys.--Paris 11--Orsay, 1983. N°: 2684. / Rés. en fr. et en angl.

Un enjeu actuel en biotechnologie est d'obtenir des plantes haploïdes doublées par la technique de la culture de microspores isolées (CMI). Pourtant, la CMI génère parfois une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains cultivars. Des travaux antérieurs ont indiqué que des remaniements du génome chloroplastique seraient à l'origine de cet albinisme. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l'albinisme, nous avons entrepris d'étudier l'intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d'orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle. L'ADN total extrait de microspores à un stade précoce de la CMI, d'une feuille de la plante-mère (témoin), et de feuilles albinos, a été séquencé et les séquences chloroplastiques ont été analysées. Ceci nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude de variations structurales a démontré un abaissement généralisé de la quantité de génomes chloroplastiques chez les microspores. Enfin, d'importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés de forme linéaire.

Les interactions entre chloroplastes et mitochondries restent encore mal connues, notamment en réponse à des conditions de stress. Dans ces conditions, il est suggéré que les voies de transfert d'électrons liées à des protéines découplantes AOX ou pUCP (mitochondriales) et PTOX (plastidiale) pourraient limiter la formation de ROS afin d'atténuer les dommages oxydatifs dans ces organites. Dans le cadre de notre travail, nous avons retenu deux cultivars de Vigna unguiculata, cv 1183 et cv EPACE. Les deux cultivars n'ont pas montré de réelles différences de sensibilité à la sécheresse. Par contre le cultivar EPACE s'est montré plus tolérant à l'O3 sur la base du développement des nécroses et plusieurs paramètres physiologiques (Fv/Fm, [phi]PSII) et biochimiques (glutathion). Pour les profils d'expression des gènes codant pour l'AOX, la pUCP et la PTOX deux réponses ont été clairement identifiées chez le cultivar EPACE. Sur un court terme l'expression de ces protéines est généralement stimulée. Sur un plus long terme (14 jours), la réponse diffère en fonction de la contrainte. Sous O3, la plus forte expression des protéines mitochondriales est maintenue alors que le gène codant pour la PTOX est sousrégulé. Sous sécheresse seule la protéine plastidiale (PTOX) reste sur-régulée. Dans des conditions de combinaison de contrainte, la sécheresse a peu d'effet sur l'influx d'O3 dans les feuilles, et les gènes VuPTOX et VuUCP1b sont sur-régulés après 3 et 7 jours de contrainte. Cette sur-régulation, déjà observée en réponse à la sécheresse seule, pourrait jouer un rôle déterminant pour prévenir la formation de ROS à la fois dans la mitochondrie et dans le chloroplaste / Possible interactions between chloroplast and mitochondria remain poorly known, particularly in response to stress conditions. Under these conditions, it is suggested that the electron transfer pathways linked to AOX or pUCP (mitochondrial uncoupling proteins) and PTOX (plastidial uncoupling protein) could limit the formation of ROS to reduce oxidative damage in cellular organelles. In our work, we selected two cultivars of Vigna unguiculata, cv 1183 and cv EPACE. Under our experimental conditions, both cultivars showed no real differences in sensitivity to drought. However cv EPACE was more tolerant to O3 based on the development of necrosis and several physiological parameters (Fv/Fm, [phi]PSII) and biochemical (glutathione content). For the expression profiles of genes encoding AOX, PUCP and PTOX two responses were clearly identified in the cultivar EPACE. On a shortterm, expression of these proteins is generally stimulated. On a longer term (14 days), the answer differs depending on the treatment. Under O3, the strongest expression of mitochondrial proteins is maintained while the gene encoding the PTOX is down-regulated. Under drought only the plastid protein (PTOX) is upregulated. Under conditions of stress combination, drought has little effect on the influx of O3 in the leaves, and the VuPTOX and VuUCP1b genes are up-regulated after 3 and 7 days of stress. This over-regulation, already observed in response to drought alone could play a role in preventing the formation of ROS in both mitochondria and chloroplasts

Les ARN polymérases de type phagique, codées dans le noyau (NEP ; Nuclear Encoded RNA Polymerase), assurent une partie de la transcription du génome plastidial des végétaux supérieurs. Ces travaux mettent en évidence l'existence d'une nouvelle famille de protéines d'A. thaliana susceptibles d'interagir avec les NEP des plantes dicotylédones : les protéines NIP (NEP Interacting Protein). Les protéines NIP sont retrouvées uniquement dans les végétaux supérieurs et leur synthèse est dépendante de la lumière. Elles présentent un domaine d'interaction protéine-protéine RING finger en C-terminal. Nous avons montré pour la première fois par immunodétection que ces protéines sont intégrées aux membranes thylacoïdiennes et qu'elles retiennent probablement les NEP plastidiales à la surface de la membrane. Cette interaction avec les membranes pourrait apporter une nouvelle vision du fonctionnement des NEP dans le chloroplaste des plantes dicotylédones.

La division des chloroplastes des cellules végétales fait intervener des protéines d'origine procaryotique et eucaryotique. Parmi les protéines d'origine procaryotique on trouve la protéine FtsZ, l'ancêtre de la tubiline. Alors que les bactéries n'utilisent qu'une protein FtsZ pour se diviser, les chloroplastes de plantes supérieures possedent deux familles de protéines FtsZ: FtsZ1 et FtsZ2. La caractérisation des mutants FtsZ d'Arabidopsis thaliana montre que les protéines FtsZ en plus d'être impliquées dans la division des plastes ont acquis de nouvelles fonctions au cours de l'évolution. La localization des protéines FtsZ avec les thylacoïdes au cours du développement suggère un rôle des protéines FtsZ dans la biogenèse des chloroplastes au cours du développement des feuilles. Le nombre et la taille des grains d'amidon dans les mutants d'Arabidopsis, ainsi que l'expression des protéines FtsZ au cours de la transition proplastes-amyloplastes dans les cellules BY2 de tabac, suggèrent une fonction de ces protéines dans le metabolisme du grain d'amidon.

Si les gymnospermes, les mousses, ou encore les algues vertes sont capables de verdir à l'obscurité, ce n'est pas le cas des angiospermes. Chez ces derniers, la voie de biosynthèse de la chlorophylle est bloquée au niveau de la pénultième étape qui correspond à la réduction de la protochlorophyllide en chlorophyllide. Cette réaction est catalysée par la NADPH : protochlorophyllide oxydoréductase (POR) dont l'activité est strictement dépendante de la lumière. Chez Arabidopsis thaliana, trois isoformes, PORA, PORB et PORC, ont été identifiées. Nous avons décidé d'étudier de façon systématique l'expression de ces gènes au cours du développement d'Arabidopsis thaliana. Nos résultats confirment que l'expression des gènes POR est soumise à un contrôle par la lumière. Alors que les protéines PORA et PORB sont principalement exprimées à l'obscurité, PORB et PORC sont les formes majoritaires dans les tissus photosynthétiques à la lumière. Cependant un taux faible mais non nul de transcrit PORA ainsi que de la protéine correspondante a été détecté à la lumière au cours du développement de la plante. Cette donnée pose donc la question du rôle éventuel de la protéine PORA au delà de la skotomorphogenèse.Nous avons entrepris la caractérisation de mutants porA, le rôle de cette protéine n'ayant été déduit qu'à partir d'études indirectes jusqu'à ce jour. Un allèle nul a été identifié qui présente un phénotype complexe. Nous avons cherché à caractériser les anomalies photosynthétiques dont il est l'objet. Par ailleurs, nous avons construit un double mutant porA porB. Son étude parallèlement à celle du simple mutant porA, nous a permis de confirmer la redondance fonctionnelle des protéines PORA et PORB dans l'établissement des corps prolamellaires des cotylédons de la plante étiolée. Ces études suggèrent également un rôle photoprotecteur pour la protéine PORA.

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