L’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage haut débit (ChIP-seq) est une technique permettant de visualiser les interactions entre l’ADN et les protéines. Toutefois, en pratique, la résolution de cette technique laisse à désirer. En étudiant les gènes de l’ARN ribosomique (ADNr), nous avons observé que le facteur majeur limitant la résolution découle du recouvrement inégal des séquences de chaque locus. Cette inégalité est superposée à la distribution réelle de la séquence d’ADN immunoprécipitée entrainant un profil de liaison protéique aberrant. Un logiciel de déconvolution a été développé afin de corriger la couverture inégale des données ChIP-seq en les normalisant par rapport aux données de l’input (Whole Cell Extract). Lorsqu’appliqué sur les données de l’ADNr, cet outil s’est avéré très utile en fournissant un profil de liaison détaillé de la chromatine et des facteurs de transcription le long de ce gène. D’autre part, des études de localisation des sites d’interactions protéiques d’UBF, un facteur de transcription associé à l’ADNr, à la grandeur du génome couplé à des expériences de DNase-seq et de microarray ont permis de mettre en lumière les rôles potentiels d’UBF dans les régions non ribosomiques. En conclusion, nous avons développé un outil permettant la normalisation par déconvolution de données de séquençage haut-débit qui permet d’augmenter la résolution du profil de liaison protéique sur l’ADNr en plus d’identifier les rôles potentiels d’UBF à l’échelle du génome. / Chromatin immunoprecipitation followed by massively parallel sequencing (ChIP-seq) is a technique that allows to visualize interactions between DNA and proteins. However in practice, the resolution of this technique leaves much to be desired. During our studies of the ribosomal RNA genes (rDNA), we observed that one major factor limiting resolution results from the unequal recovery of sequence data across any given locus. This inequality is superimposed on the actual distribution of immunoprecipitated DNA sequences resulting in aberrant protein binding profiles. A software was developed to correct the unequal coverage of ChIP-seq data by normalizing to the input (Whole Cell Extract) with a deconvolution protocol. When applied on the rDNA, this approach has been especially useful in providing a detailed map of chromatin and transcription factor distribution across the gene. On the other hand, genome-wide localization of protein interaction sites for UBF, a transcription factor associated to rDNA, coupled with DNase-seq and microarray experiments shed light on the potential roles of UBF in non-ribosomal regions. In conclusion, we developed a tool allowing the normalization by deconvolution of high-throughput sequencing data that allows to increase the resolution of protein binding profiles on the rDNA. In addition we identified the potential roles of UBF at genome scale.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Selon l’université Johns Hopkins, plus de 600 millions de cas de coronavirus 2019 (COVID - 19) infectés par le SRAS-CoV-2 ont été signalés dans le monde depuis décembre 2019. La COVID-19 a causé une catastrophe énorme dans le monde, tuant plus de six millions de personnes. Il est donc essentiel de trouver des médicaments ou des vaccins efficaces. L'ARN polymérase ARN - dépendante (RdRp) joue un rôle clé dans la réplication du virus SARS-CoV-2. Nous avons constaté que la RdRp du SRAS-CoV-2 présentait 98,1% de similitude avec la RdRp du SRAS-CoV, alors que la similitude génomique de virus n'était que de 80%. Les alignements de séquences des coronavirus ont montré une homologie plus élevée entre les RdRps (60% - 98%) et une homologie plus faible entre les protéines Spike (24% - 77%). Les structures 3D de la RdRp et de la nucléotide transférase (NiRAN) ont été rapidement déterminées par modélisation à partir des structures correspondantes du SRAS. Dans le nouveau coronavirus, trois substitutions apparaissent dans le motif RdRp, ainsi qu'une liaison hydrogène supplémentaire, mais la structure des régions des doigts et du pouce est légèrement modifiée. La structure NiRAN est très conservatrice dans le COV. Les homologies de séquence et de structure entre RdRp et NiRAN sont donc supposées être des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement du COV émergent. La protéase principale (Mpro), également connue sous le nom de protéase 3-chymotrypsine-like (protéase 3CL), joue un rôle important dans le clivage des polyprotéines virales pour former des complexes de réplication fonctionnelle. Mpro est donc une cible pharmaceutique prometteuse pour le traitement de la COVID-19. Grâce à la modélisation moléculaire, à l'amarrage et à la détermination de l'activité protéasique, nous avons trouvé quatre nouveaux inhibiteurs ciblant le Mpro avec une affinité de liaison révélée par la moitié de la concentration maximale inhibitrice (IC50) et des constantes de dissociation (KD). Nos nouveaux inhibiteurs CB-21, CB-25, CP-1 et LC24-20 ont des CI50s de 14,88 µM (IC à 95%: 10,35 µM à 20,48 µM), 22,74 µM (IC à 95%: 13,01 µM à 38,16 µM), 18,54 µM (IC à 95%: 6,54 µM à 36,30 µM) et 32,87 µM (IC à 95%: 18,37 µM à 54,80 µM), respectivement. L'évaluation des interactions a montré que chaque inhibiteur avait des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes avec des résidus importants, y compris les résidus catalytiques les plus importants: his41 et Cys145. La dose létale à 50% (DL50) des quatre inhibiteurs est beaucoup plus élevée que celle de l'inhibiteur bien connu de la Mpro, GC376, ce qui indique une faible toxicité. Ces quatre inhibiteurs peuvent servir de médicaments potentiels pour d'autres études in vitro et in vivo contre la COVID-19. Dans l'ensemble, pour RdRp et Mpro, nos résultats fournissent des informations utiles pour la recherche et le traitement de la COVID-19. / According to the data from Johns Hopkins University, more than 600 million Coronavirus Virus Disease 2019 (COVID-19) cases infected by SARS-CoV-2 has been reported worldwide since December 2019. COVID-19 brought huge disaster to the world with more than 6 million death cases. Therefore, finding efficient drugs or vaccines is of vital importance. RNA-dependent-RNA-polymerase (RdRp) plays a key role in SARS-CoV-2 viral replication. We found that SARS-COV-2 RdRp shares 98.1% of similarity with SARS-CoV RdRp while the genome similarity is only 80%. Sequence alignment of coronaviruses demonstrated higher identity among RdRps (60% – 98%) and lower identity among Spike proteins (24% – 77%). The RdRp and nucleotide-transferase (NiRAN) 3D-structures were quickly determined by modelling starting from the SARS counterpart structures. In COVID-19, three substitutions appeared in RdRp motifs with an additional hydrogen-bonding, but slight structural change shown in the finger and thumb domains. The NiRAN structure is well conserved in CoV. The sequence and structural homology among RdRp and NiRAN thus postulate them as potential drug targets to treat emerging CoVs. Main protease (Mpro), also called 3-chymotrypsin-like protease (3CL protease), plays an essential role in cleaving virus polyproteins for the functional replication complex. Therefore, Mpro is a promising drug target for COVID-19 therapy. Through molecular modelling, docking and a protease activity assay, we found four novel inhibitors targeting Mpro with the half maximal inhibitory concentration (IC50) and their binding affinities shown by the dissociation constants (KDs). Our new inhibitors CB-21, CB-25, CP-1 and LC24-20 have IC50s at 14.88 µM (95% Confidence Interval (95% CI): 10.35 µM to 20.48 µM), 22.74 µM (95% CI: 13.01 µM to 38.16 µM), 18.54µM (95% CI: 6.54 µM to 36.30 µM) and 32.87µM (95% CI: 18.37 µM to 54.80 µM)), respectively. The evaluation of interactions suggested that each inhibitor has a hydrogen bond or hydrophobic interactions with important residues, including the most essential catalytic residues: His41 and Cys145. All the r inhibitors have a much higher 50% lethal dose (LD50) compared with the wellknown Mpro inhibitor GC376, demonstrating its low toxicity. These four inhibitors can be potential drug candidates for further in vitro and in vivo studies against COVID-19.Overall, targeting RdRp and Mpro, our findings provide useful information for the research and treatment of COVID-19.

La transcription par l’ARN polymérase II (ARNP II) est un mécanisme promiscuitaire à l’origine d’évènements transcriptionnels hasardeux, qui génèrent continuellement des transcrits aberrants dans la cellule. L’organisation précise du matériel génétique sous forme de chromatine est cruciale pour améliorer la précision de l’ARNP II en orientant sa fonction pour limiter ses erreurs et empêcher cette transcription cryptique. La structure chromatinienne est très dynamique et plusieurs mécanismes moléculaires coopèrent afin de déstabiliser les nucléosomes en amont de l’ARNP II, pour autoriser la lecture de l’ADN, et de les reconstituer dans son sillage, pour maintenir l’organisation chromatinienne du génome. De façon intéressante, une fonction potentielle de la caséine kinase 2 (CK2) dans la dynamique de la chromatine est suggérée dans la littérature. CK2 est une protéine kinase essentielle, conservée chez les eucaryotes, et impliquée dans des processus cellulaires variés. Dans notre étude, nous explorons le rôle de CK2 dans les modulations de la chromatine associées à la transcription. Nous avons démontré que CK2 phosphoryle le chaperon d’histones Spt6, régulant ainsi sa stabilité et sa fonction d’organisateur chromatinien. L’inactivation de cette voie de régulation conduit à l’accumulation considérable de transcrits cryptiques provenant d’initiations opportunistes intragéniques sens et antisens. La phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise le recyclage des histones H3/H4 en 3’ des régions codantes et participe ainsi à la conservation de la structure de la chromatine lors de la transcription et à la suppression de la transcription cryptique. Notre étude suggère en outre que les fonctions de CK2 dans la modulation de la chromatine et la précision transcriptionnelle pourraient s’étendre au-delà de la régulation de Spt6, via la modulation de facteurs tels que les complexes PAF ou FACT. Enfin, nous proposons que la suppression de la transcription cryptique par CK2 contribue à optimiser la transcription afin d’améliorer la réponse transcriptionnelle à des stress extérieurs. L’ensemble de notre étude montre que CK2 stimule la précision transcriptionnelle en régulant directement Spt6 et probablement d’autres facteurs impliqués dans le maintien co-transcriptionnel de la chromatine. Ce mécanisme est crucial pour préserver le programme d’expression du génome et favorise la plasticité et l’efficacité de la réponse transcriptionnelle aux signaux de stress, nécessaires à l’adaptation de la cellule à son environnement. / Transcription by RNA polymerase II (RNAPII) is pervasive and aberrant transcripts are permanently generated within cells. Precise and controlled genomic organization in chromatin structure is essential to improve RNAPII accuracy and prevent cryptic transcripts accumulation. Chromatin structure is highly dynamic during transcription, unfolded to give access to DNA and refolded back in the wake of RNAPII to prevent spurious transcription. Multiple mechanisms act together to make this process highly efficient. Casein Kinase 2 (CK2) is a protein kinase ubiquitously present among eukaryotes and implicated in various important cellular processes. Interestingly, a potential function of this kinase in chromatin dynamics through the regulation of chromatin factors has previously been suggested. In this study, we address the role of CK2 in chromatin modulations associated with transcription. We found that CK2 depletion from yeast cells results in an increase of histone turnover in 3’ of transcribed regions and spurious transcription from cryptic promoters. Interestingly, we demonstrate that CK2 modulates directly Spt6 histone chaperone stability and function. This regulation promotes histone recycling during transcription elongation and maintain chromatin organization within coding regions, thereby inhibiting cryptic intragenic and antisense transcription. Our study also suggests that CK2 suppression of spurious transcription extend beyond Spt6 regulation. Indeed, we describe that additional role of CK2 with respect to spurious transcription could be related to its regulation of RNAP II activity through CTD Ser2 phosphorylation. Chromatin regulators such as PAF complex and FACT could also be involved in this regulation process. Finally, we propose that CK2 suppression of spurious transcription is essential for transcriptional optimal and efficient responses to environmental signals. Altogether, our data highlights CK2 signaling pathway as a regulator of transcription accuracy by affecting the essential histone chaperone Spt6, and probably other factors directly involved in the transcriptional process. This mechanism is important to the suppression of cryptic transcription in steady state conditions but also seems to contribute to the fitness of an optimal cellular response to stress signals.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les suppresseurs de tumeurs Rb, p53, INK4a et ARF sont essentiels et ils sont partie intégrante d'un réseau complexe qui régule le cycle cellulaire ainsi que la réponse aux stress oncogéniques. La biogénèse des ribosomes, donc la synthèse et l'assemblage des ribosomes, est une activité essentielle pour la prolifération cellulaire et est fortement affectée par les changements environnementaux ainsi que différentes formes de stress. Il est donc peu surprenant d'apprendre que plusieurs suppresseurs de tumeurs et oncogenes, dont Rb, ARF, p53 et MDM2 travaillent de concert ou en opposition afin de maintenir le niveau de la production de ribosomes à un niveau optimal pour répondre à la demande cellulaire. ARF, un des produits du gène CDKN2A, est reconnu pour causer la stabilisation de p53 en inhibant son ubiquitine ligase MDM2 et ainsi induire l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. ARF peut aussi être un suppresseur de tumeurs en l'absence de p53/TP53, car il peut causer un arrêt de prolifération en inhibant, en partie, la synthèse des ARN ribosomiques (ARNrs) dans des cellules p53-/-. ARF cause l'ubiquitination et la dégradation de la chaperonne NPM/B23 qui est impliquée dans la maturation de l'ARNr 28S, cependant ARF inhibe aussi la production de l'ARNr 18S ainsi que l'ARNr précurseur (47S). L'effet de ARF sur NPM n'explique pas l'ensemble des effets de ARF sur la production et la maturation des ARNrs. Nous avons démontré que ARF contrôle la localisation sub-nucléaire du Facteur de Terminaison de la Transcription de la Polymerase I, TTF-I. TTF-I est dynamique et se déplace entre le nucléoplasme et le nucléole avec l'aide de NPM et d'un signal de localisation nucléolaire dans son domaine de régulation en N-terminal. ARF inhibe la localisation nucléolaire de TTF-I en interagissant avec le signal de localisation nucléolaire causant son accumulation dans le nucléoplasme. La réduction de TTF-I récapitule les effets de ARF sur la synthèse et la maturation des ARNrs et le phénotype est récupéré par l'introduction d'un transgène de TTF-I. La surexpression de TTF-I affecte, de façon similaire à une réduction, la biogénèse des ribosomes et le niveau cellulaire de TTF-I est critique et régulé par l'ubiquitine ligase MDM2. ARF inhibe l'interaction de MDM2 avec TTF-I ainsi que son ubiquitination. De plus, ARF et Senp3 régulent la sumoylation de TTF-I. Nos résultats montrent comment ARF, NPM et MDM2 peuvent réguler et limiter la synthèse des ARNrs.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 mars 2024) / La biogenèse des ribosomes est un processus cellulaire important qui se produise dans le nucléole et qui nécessite la participation des trois ARN polymérases nucléaires. L'étape initiale et limitante de ce processus est la transcription de l'ARN ribosomal précurseur (pré-ARNr/47S) contenant les ARN 28S, 18S et 5,8S par l'ARN polymérase I (RPI, également connue sous le nom de Pol1 et POLR1). RPI dispose d'un ensemble dédié de facteurs basaux responsables pour son action : le facteur architectural UBF ou UBTF, le facteur SL1, le facteur d'initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l'ARN ribosomal est étroitement régulée et représente 40 % de la transcription totale des gènes. Le déséquilibre de la synthèse de l'ARN ribosomal a été observé dans de nombreuses maladies comme le cancer. Par conséquent, ce processus est lié à la croissance, la transformation, la prolifération cellulaire et aux actions des suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. Par conséquent, l'étude de la régulation transcriptionnelle des ARN ribosomiques revêt une importance cruciale dans la compréhension et le traitement ultérieur de ces maladies. Le génome haploïde humain et murin contient environ 200 copies des gènes de l'ARN ribosomal, l'ADN ribosomal (ADNr). Ces copies d'ADN ribosomique sont disposées en répétitions sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. Il est intéressant de noter que seule une fraction des copies d'ADNr est active et qu'un nombre important est épigénétiquement silencieux et hétérochromatique. Cependant, les mécanismes à l'origine de la reconnaissance et de l'inactivation du promoteur de gène de l'ARN ribosomal ne sont pas encore bien compris. Cette thèse propose un modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur de l'ARN polymérase I et présente les rôles du facteur de terminaison de la transcription I dans la régulation du gène ribosomal. Nous montrons que la coopération entre SL1 et le variant d'épissage UBTF1 génère la spécificité requise pour la reconnaissance du promoteur de l'ADNr dans la cellule. Nous constatons que la suppression conditionnelle de la sous-unité Taf1b de SL1 provoque une déplétion de l'UBTF au niveau des deux promoteurs de l'ADNr, mais pas ailleurs dans l'ADNr. Nous constatons également que même si les variants UBTF1 et -2 se lient dans toute la région exempte de nucléosomes de l'ADNr, seul UBTF1 est présent avec SL1 au niveau des promoteurs. Ainsi, les données suggèrent fortement un modèle d'ajustement induit de reconnaissance du promoteur RPI dans lequel UBTF1 joue un rôle architectural. Parmi les promoteurs ribosomiques, on note la présence du promoteur spacer situé 2 kb en amont du promoteur principal du gène où se lie TTF1. Nous avons montré que cette liaison est importante pour empêcher l'ARN polymérase I de transcrire la région dites « enhancer repeats » interférant ainsi avec l'assemblage du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur principal du gène ribosomique via un mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant, inhibant ainsi la transcription de l'ADN ribosomique et cela se produit en réponse à l'activité du suppresseur de tumeur ARF. Le même scénario est observé lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires en cellules neuronales où nous avons montré que KLF4 régule la transcription de RPI via la régulation de ses facteurs associés TTF1 et RRN3. En prenant toutes les données ensemble, nous suggérons deux nouveaux mécanismes qui régulent le gène ribosomal : le modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur RPI et le mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant suite à l'activation du suppresseur de tumeur ARF dans la cellule. / Ribosome biogenesis is an important cellular process occurring in the nucleolus that requires the transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step of this process is the transcription of the precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) containing the catalytic RNAs 28S, 18S and 5.8S by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its action: the architectural factor UBF or UBTF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 40% of total gene transcription. The imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Therefore, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumor suppressors and oncogenes. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies is active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. However, the mechanisms behind ribosomal RNA gene promoter recognition and silencing are not yet fully understood. This thesis suggests an induced-fit model for RNA polymerase I promoter recognition and presents the roles played by the transcription termination factor I in regulating the ribosomal gene. We show that cooperation between SL1 and the UBTF1 splice variant generates the specificity required for rDNA promoter recognition. We find that conditional deletion of the Taf1b subunit of SL1 causes a striking depletion of UBTF at both rDNA promoters but not elsewhere across the rDNA. We also find that while both UBTF1 and -2 variants bind throughout the rDNA nucleosome-free region, only UBTF1 is present with SL1 at the promoters. Thus, the data strongly suggest an induced-fit model of RPI promoter recognition in which UBTF1 plays an architectural role. Of the ribosomal promoters, we note the presence of the spacer promoter located 2Kb upstream the main gene promoter where TTF1 binds. We showed that this binding is important to block the RNA polymerase I from transcribing the enhancer repeat region. We further demonstrated that the spacer promoter is the source of a lncRNA that interferes with the assembly of the pre-initiation complex at the main gene promoter via promoter interference or occlusion thereby inhibiting rDNA transcription. The mechanism is proposed to explain the action of the p19ARF tumor suppressor activity in limiting cell growth. The same scenario is observed during ESCs to NPCs differentiation where we showed that KLF4 determines RPI transcription by regulating the genes encoding TTF1 and RRN3. Our data suggest two novel mechanisms that regulate the ribosomal genes: the RPI promoter recognition induced-fit model and the lncRNA-induced promoter occlusion mechanism driven by ARF displacement of TTF1, and further suggests a role for rDNA regulation in differentiation and loss of pluripotency of embryonic stem cells.

Les ARN polymérases de type phagique, codées dans le noyau (NEP ; Nuclear Encoded RNA Polymerase), assurent une partie de la transcription du génome plastidial des végétaux supérieurs. Ces travaux mettent en évidence l'existence d'une nouvelle famille de protéines d'A. thaliana susceptibles d'interagir avec les NEP des plantes dicotylédones : les protéines NIP (NEP Interacting Protein). Les protéines NIP sont retrouvées uniquement dans les végétaux supérieurs et leur synthèse est dépendante de la lumière. Elles présentent un domaine d'interaction protéine-protéine RING finger en C-terminal. Nous avons montré pour la première fois par immunodétection que ces protéines sont intégrées aux membranes thylacoïdiennes et qu'elles retiennent probablement les NEP plastidiales à la surface de la membrane. Cette interaction avec les membranes pourrait apporter une nouvelle vision du fonctionnement des NEP dans le chloroplaste des plantes dicotylédones.

L'ADN est condensé dans le noyau sous forme de chromatine. La structure chromatinienne de l'ADN est un obstacle pour la transcription car elle limite l'accessibilité de l'ADN. Des complexes spécialisés sont capables de remodeler cette structure. Chez Saccharomyces cerevisiae, les complexes RSC (Remodels the Structure of Chromatin) et SWI/SNF sont apparentés comme en témoignent les homologies existant entre plusieurs de leurs sous-unités. Toutefois, seul le complexe RSC, plus abondant que SWI/SNF, est essentiel à la viabilité cellulaire. Ceci suggère qu'il pourrait avoir de multiples rôles dont un dans la transcription. <br />La transcription est réalisée chez les eucaryotes par trois ARN polymérases (pol) différentes chacune spécifique d'une classe de gènes. Nous avons montré que le complexe RSC interagit avec les ARN polymérases I et III. Notre attention s'est portée sur l'interaction entre la sous-unité Rsc4 et la protéine ABC27, commune aux trois ARN polymérases. La protéine Rsc4 interagit en double-hybride avec ABC27 par son domaine C-terminal. Nous avons étudié un mutant de la sous-unité Rsc4 ayant perdu la capacité d'interagir avec ABC27. Les profils d'expression génomiques, établis par puces à ADN, ont permis de caractériser des effets de cette mutation sur la transcription par l'ARN polymérase II. Curieusement, la majorité des gènes induits sont répartis par le chromosome XII. Cet effet n'est pas polaire. La présence de l'ADN ribosomique sur ce chromosome nous a conduits à proposer qu'il pourrait être une cause de ce comportement particulier. Nous avons mis en évidence des modifications dans la voie de maturation de l'ARN 35S, transcrit par la pol I, mais nous n'avons pas pu caractériser des défauts de transcription par les ARN polymérases I et III.