Les mécanismes de réparation de l’ADN sont cruciaux pour la survie cellulaire. Cependant, ces mécanismes sont souvent altérés dans les processus cancéreux permettant l’accumulation de mutations et d’instabilité génétique. Plusieurs voies de réparation sont utilisées par les cellules pour réparer différents types de dommages à l’ADN. La réparation des cassures double-brin (CDB) par la Recombinaison Homologue (RH) permet de réparer fidèlement ces lésions. PALB2 est au coeur d’un réseau d’interactions protéiques comprenant BRCA1 et BRCA2. Tout comme ces dernières, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Ainsi, par ses fonctions dans la stabilité du génome et le cancer, l’étude fonctionnelle de PALB2 et la compréhension du rôle de ses domaines sont essentiels. En effet, PALB2 se lie à l’ADN, mais les mécanismes induisant sa liaison et la fonction de cette liaison sont toujours mal compris. En ce sens, nos collaborateurs ont identifié quatre principaux acides aminés dans ce domaine, comme étant importants car leurs mutations en alanine compromettent la liaison de PALB2 à l’ADN. De ce fait, mon premier objectif porte sur l’étude fonctionnelle de ce domaine de liaison à l’ADN dans la recombinaison homologue. En accord avec les essais biochimiques conduits par nos collaborateurs, notre étude in vivo a pu démontrer que la mutation de ces résidus en alanine réduit de 50% la formation de foyers RAD51 aux dommages, réduisant ainsi l’efficacité de la RH dans ces cellules. Mon deuxième objectif, vise l’établissement de modèles de létalité synthétique pour tuer les cellules déficientes en réparation de l’ADN. Le but est d’identifier de nouveaux interacteurs de PALB2 par la technique BioID et qui seraient synthétiquement létaux en combinaison avec d’autres mutations génétiques. Enfin, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP amènent à une létalité synthétique dans les cellules déficientes en PALB2. Cependant, ces études ne prennent pas en compte l’aspect tridimensionnel de la tumeur cancéreuse. C’est pourquoi, dans mon projet j’ai initié le développement de modèles 3D qui pourraient possiblement aider à l’évaluation des stratégies de létalité synthétique, se rapprochant ainsi du contexte physiologique de la tumeur.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r

La physiologie des épithéliums requiert la distribution asymétrique de nombreuses composantes cellulaires. Cette organisation structurale est nommée polarité épithéliale et se caractérise par la formation d'un domaine apical et un domaine basolatéral. La polarisation des cellules épithéliales dépend de la protéine Crumbs 3 (CRB3 chez la souris). Plus spécifiquement, cette protéine contribue à l'établissement du pôle apical et à la formation des jonctions serrées dans les cellules épithéliales en culture. De plus, la protéine CRB3 est capable de réprimer la croissance tumorale et la formation de métastases dans des modèles de xénogreffes. Toutefois, les mécanismes moléculaires agissant en aval de CRB3 sont méconnus et les fonctions physiologiques de CRB3 in vivo chez les mammifères sont peu caractérisées. Ainsi, l'objectif de mon projet était d'analyser le phénotype des souris invalidées pour Crb3 et de valider son rôle potentiel en tant que suppresseur de tumeurs. Nous avons généré des lignées de souris permettant le knockout conditionnel de Crb3. Comme première approche, nous avons invalidé le gène Crb3 dans tout l'organisme. Nous observons une létalité périnatale associée à une détresse respiratoire. Toutefois, les animaux Crb3-/- ne présentent pas de défaut macroscopique majeur. Une analyse plus détaillée révèle des anomalies de développement des alvéoles pulmonaires, la présence de kystes rénaux et la fusion des villosités intestinales. CRB3 est également essentielle pour maintenir l'identité de la membrane apicale dans les cellules épithéliales rénales et intestinales. Une perte de CRB3 cause également une forte augmentation des niveaux de β-caténine cytoplasmique dans l'épithélium intestinal. Cette protéine est un médiateur essentiel de la voie oncogénique Wnt. De plus, la mutation de Crb3 amplifie la croissance tumorale chez les souris ApcMin/+, qui développent de nombreux adénomes dus à la suractivation de la voie Wnt. Dans l'ensemble, nos résultats mettent en lumière l'importance de CRB3 dans l'homéostasie de l'épithélium pulmonaire, rénal et intestinal. De plus, nos données suggèrent que CRB3 pourrait agir en tant que suppresseur de tumeurs via son action sur la voie Wnt.

Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Il est à présent établi que les mutations de l'information génétique des cellules initient et participent à son développement, et que certaines mutations transmises au sein des familles prédisposent à son apparition. C'est le cas notamment des mutations des gènes BRCA1 et BRCA2 qui prédisposent aux cancers du sein et de l'ovaire. Les protéines produites par ces gènes sont directement impliquées dans la protection de l'information génétique puisqu'elles participent à la réparation des cassures se produisant dans le support de cette information : l'ADN. L'ADN peut être endommagé par diverses lésions mais les plus déstabilisatrices de l'information génétique sont les cassures double-brin. Afin de protéger son génome, la cellule possède de nombreux mécanismes de réparation dont la recombinaison homologue qui permet une réparation fidèle, c'est-à-dire sans perte ou modification de l'information génétique, permettant ainsi de prévenir l'apparition du cancer. La recombinaison homologue repose principalement sur l'activité de la protéine RAD51 qui nécessite l'utilisation des médiateurs BRCA2 et PALB2. Tout comme les gènes BRCA1 et BRCA2, PALB2 est un gène suppresseur de tumeur et ses mutations ont été associées avec une susceptibilité aux cancers du sein, de l'ovaire et du pancréas. En plus de la chirurgie, le traitement de ces cancers implique la radiothérapie et la chimiothérapie. Celles-ci font l'objet d'intenses recherches afin de proposer de nouveaux traitements plus efficaces avec moins d'effets secondaires. De nouvelles stratégies chimiothérapeutiques ont notamment émergé et on s'oriente à présent vers le développement de traitements personnalisés qui sont basés sur une meilleure connaissance des spécificités moléculaires des tumeurs. Les travaux présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations concernant le rôle de PALB2 dans la protection du génome lors du stress réplicatif et sur la régulation de ses fonctions par le contrôle de sa localisation cellulaire. Plus précisément, nous montrons que PALB2 et BRCA2 permettent de maintenir la Polymérase η au niveau des fourches de réplication bloquées et stimulent son activité de synthèse de l'ADN pour réinitier la réplication. Grâce à l'analyse de mutations germinales identifiées dans des cancers du sein et de l'ovaire, nous révélons la présence d'une séquence d'export nucléaire qui provoque l'exclusion de PALB2 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, nous rapportons le développement d'une nouvelle molécule chimiothérapeutique, SFOM-0046, qui provoque des cassures double-brin de l'ADN en induisant un stress réplicatif et qui potentialise les effets de l'UCN-01, une molécule qui a été étudiée en clinique. Nous proposons l'utilisation de cette nouvelle molécule comme agent d'amélioration de thérapies ciblées existantes ou pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses personnalisées.

Spécialisé dans la production des ribosomes, mais également impliqué dans de multiples fonctions (e.g. maturation des ARNm, régulation du cycle cellulaire), le nucléole a récemment attiré une grande attention pour son rôle central dans la réponse cellulaire au stress. En effet, de multiples évidences semblent lier la sous-structure nucléaire à la détection, mais aussi à la réponse cellulaire vis-à vis certaines formes de stress. En appui à cette fonction, les protéines nucléolaire L51LII1L23, p14ARF, nucléophosmine et nucléoline sont toutes impliquées dans la stabilisation de p53 via un repositionnement nucléoplasmique stress-dépendant (e.g. inhibition de la transcription). Amené à investiguer la fonction de la protéine nucléolaire GLTSCR2, certaines évidences me suggéraient l'implication potentielle de cette protéine auprès du suppresseur de tumeur p53. Parmi ces indices, il a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, que la protéine Nop53p (protéine homologue de GLTSCR2) pouvait interagir avec Nugl p (protéine homologue de nucléostémine). La nucléostémine est une protéine nucléolaire ayant la capacité de voyager entre le nucléole et le nucléoplasme, en plus d'interagir avec p53. À la lumière de ces observations, l'objectif de cette thèse était de valider et de caractériser l'existence d'une interaction entre GLTSCR2 et p53, en plus de caractériser la dynamique de GLTSCR2 en situation de stress. Afin de valider l'hypothèse d'une interaction entre GLTSCR2 et p53, l'immunoprécipitation des protéines endogènes, de même que l'utilisation de clones stables pouvant induire l'expression d'une fusion carboxy-terminale de GLTSCR2 avec l'épitope flag ont été les approches privilégiées. Dans l'intérêt de préciser les domaines d'interactions nécessaires à chacune des protéines, les propriétés d'une série de mutants pour GLTSCR2 et p53 ont été analysées par des expériences de type ±pull-down ¿. Afin d'évaluer la dynamique de GLTSCR2 en situation de stress, les cellules cancéreuses prostatiques LNCaP et mammaires MCF7 ont été soumises à une inhibition de la transcription induite par des traitements à l'actinomycin D (Act.D) et à l'acide mycophénolique (MPA). La stabilité de GLTSCR2, de même que sa localisation et son interaction avec p53 ont été analysées dans ces conditions. Mes travaux ont permis de démontrer l'interaction entre la protéine nucléolaire GLTSCR2 et le suppresseur de tumeur p53. Alors que p53 semble s'associer entre les résidus 200 à 400 de GLTSCR2, cette dernière interagit avec la portion centrale (domaine de liaison à l'ADN) de p53. De manière inattendue, mes recherches ont également démontré l'existence d'un clivage protéolytique de GLTSCR2. De plus, seul un fragment amino-terminal de GLTSCR2 (clivage en C-terminal) et non la protéine pleine longueur semble habilité à former un complexe avec p53. Cette association est intensifiée suite à l'émergence d'un stress cellulaire (inhibition de la transcription), possiblement en raison d'une diffusion nucléoplasmique stress-dépendante de GLTSCR2. Enfin, l'instabilité protéique de GLTSCR2 (dégradation protéasome-dépendante) suite à sa diffusion nucléoplasmique porte à croire que la protéine serait impliquée au début de la réponse de stress via une influence auprès de p53.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les suppresseurs de tumeurs Rb, p53, INK4a et ARF sont essentiels et ils sont partie intégrante d'un réseau complexe qui régule le cycle cellulaire ainsi que la réponse aux stress oncogéniques. La biogénèse des ribosomes, donc la synthèse et l'assemblage des ribosomes, est une activité essentielle pour la prolifération cellulaire et est fortement affectée par les changements environnementaux ainsi que différentes formes de stress. Il est donc peu surprenant d'apprendre que plusieurs suppresseurs de tumeurs et oncogenes, dont Rb, ARF, p53 et MDM2 travaillent de concert ou en opposition afin de maintenir le niveau de la production de ribosomes à un niveau optimal pour répondre à la demande cellulaire. ARF, un des produits du gène CDKN2A, est reconnu pour causer la stabilisation de p53 en inhibant son ubiquitine ligase MDM2 et ainsi induire l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. ARF peut aussi être un suppresseur de tumeurs en l'absence de p53/TP53, car il peut causer un arrêt de prolifération en inhibant, en partie, la synthèse des ARN ribosomiques (ARNrs) dans des cellules p53-/-. ARF cause l'ubiquitination et la dégradation de la chaperonne NPM/B23 qui est impliquée dans la maturation de l'ARNr 28S, cependant ARF inhibe aussi la production de l'ARNr 18S ainsi que l'ARNr précurseur (47S). L'effet de ARF sur NPM n'explique pas l'ensemble des effets de ARF sur la production et la maturation des ARNrs. Nous avons démontré que ARF contrôle la localisation sub-nucléaire du Facteur de Terminaison de la Transcription de la Polymerase I, TTF-I. TTF-I est dynamique et se déplace entre le nucléoplasme et le nucléole avec l'aide de NPM et d'un signal de localisation nucléolaire dans son domaine de régulation en N-terminal. ARF inhibe la localisation nucléolaire de TTF-I en interagissant avec le signal de localisation nucléolaire causant son accumulation dans le nucléoplasme. La réduction de TTF-I récapitule les effets de ARF sur la synthèse et la maturation des ARNrs et le phénotype est récupéré par l'introduction d'un transgène de TTF-I. La surexpression de TTF-I affecte, de façon similaire à une réduction, la biogénèse des ribosomes et le niveau cellulaire de TTF-I est critique et régulé par l'ubiquitine ligase MDM2. ARF inhibe l'interaction de MDM2 avec TTF-I ainsi que son ubiquitination. De plus, ARF et Senp3 régulent la sumoylation de TTF-I. Nos résultats montrent comment ARF, NPM et MDM2 peuvent réguler et limiter la synthèse des ARNrs.